莖瘤芥抗根腫病育種材料篩選與創(chuàng)制

彭麗莎 沈進娟 冷容 王浩 管中榮 張召榮 楊平 范永紅

摘要 為更好地防治莖瘤芥根腫病，本研究通過采用田間自然誘發(fā)和室內人工接種根腫菌的鑒定方法，對14份材料進行根腫病抗性鑒定，篩選出5份可作為莖瘤芥抗根腫病育種材料創(chuàng)制的抗性資源：‘中蕪‘CR云‘華雙5R‘CR春麗和‘CR-英雄用兩種方法鑒定均表現(xiàn)高抗或免疫根腫病。利用‘CR云作為抗根腫病基因的供體親本進行莖瘤芥抗根腫病材料的創(chuàng)制，獲得莖瘤芥和白菜種間雜交的F1，結合形態(tài)學鑒定和根腫病抗性鑒定確定為真雜種。

關鍵詞 莖瘤芥; 白菜; 根腫病; 種間雜交

中圖分類號： S 436.37

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2021136

Screening and creation of Brassica juncea var. tumida breeding materials resistant to clubroot

PENG Lisha， SHEN Jinjuan*， LENG Rong， WANG Hao， GUAN Zhongrong，ZHANG Zhaorong， YANG Ping， FAN Yonghong

（Chongqing Yudongnan Academy of Agricultural Sciences， Fuling 408000， China）

Abstract

Two methods of natural identification in the field and inoculation identification were used to evaluate the clubroot resistance of 14 materials. Five materials were recommended as resistance resources to creat B.juncea var. tumida breeding materials resistant to clubroot. Resistance evaluation of ‘Zhongwu ‘CR Yun ‘Huashuang 5R ‘CR Chunli and ‘CR-Yingxiong by two methods showed high resistance or immune to clubroot. Using ‘CR Yun as donor parents with resistance gene， B.juncea breeding materials resistant to clubroot were created. F1 generation of hybrids between B.juncea var. tumida? and B.campestris were developed and identified by morphology and resistance evaluation.

Key words

Brassica juncea var. tumida; Brassica campestris; clubroot; interspecific hybridization

莖瘤芥Brassica juncea var. tumida 俗稱為青菜頭，其食用器官——莖[1]的加工產品榨菜是我國的副食珍品，長期以來受到國內外消費者的普遍歡迎。尤其是“涪陵榨菜”，因其“鮮、香、嫩、脆”的獨特品質以及營養(yǎng)豐富、方便可口和耐儲存耐烹調等許多優(yōu)點，在國內外享有盛譽。同時，莖瘤芥種植生產業(yè)的發(fā)展促進和帶動了榨菜加工業(yè)以及相關行業(yè)的發(fā)展，形成了一個以莖瘤芥種植、榨菜加工為中心的互為依存，又相互促進的大產業(yè)體系。

根腫病是十字花科作物的主要病害之一，在全球范圍內廣泛發(fā)生，已經造成糧油、蔬菜等產業(yè)的巨大經濟損失。近年來隨著十字花科作物栽培面積擴大和種植集約化程度的不斷提高，根腫病在大面積生產上危害日益嚴重，威脅著莖瘤芥產業(yè)的健康發(fā)展[2]。目前生產上基本無抗根腫病莖瘤芥品種，已成為莖瘤芥原料生產亟待解決的重大現(xiàn)實問題。篩選十字花科作物中的抗根腫病種質資源，創(chuàng)制抗根腫病莖瘤芥材料，從而培育抗根腫病的品種并加以推廣是解決根腫病最經濟有效的途徑[3]。深度發(fā)掘十字花科作物抗根腫病種質、強化育種創(chuàng)新基礎，為建設現(xiàn)代種業(yè)強國、保障國家糧食安全、實施鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略奠定堅實基礎。其他十字花科作物開展根腫病抗性鑒定工作較早，大白菜、甘藍、油菜等[4-8]都已經鑒定篩選出一批抗根腫病栽培品種。對十字花科作物蕪菁、青花菜、蘿卜、白菜、甘藍和油菜等大量篩選后也獲得了一些寶貴的抗根腫病資源。其中歐洲飼用蕪菁中含有的抗根腫病位點最多，在抗病育種應用中也最為廣泛[9]，Yoshikawa[10]從1 062份蕓薹屬種質資源中篩選出43份蕪菁高抗病品系。有報道表明蕓薹屬A基因組較C基因組的抗源豐富[11]。張小麗等[12]在青花菜中鑒定篩選出5份中抗根腫病材料。Kamei等[13]從蘿卜中發(fā)現(xiàn)對根腫病免疫的抗性位點，而Chen等[14]將蘿卜與白花芥藍雜交，得到對根腫病表現(xiàn)免疫的蘿卜-芥藍異源四倍體材料。采用胚挽救技術得到抗根腫病的甘藍×大白菜和甘藍型油菜新材料[15-16]。對莖瘤芥開展抗根腫病材料篩選與創(chuàng)制工作相對較晚，發(fā)現(xiàn)的抗病種質較少，抗病育種工作進展十分緩慢。因此，本研究通過篩選出抗根腫病材料，利用種間雜交獲得抗根腫病的莖瘤芥×白菜材料，最終將白菜中的抗病基因轉移到莖瘤芥中，旨在為莖瘤芥抗根腫病育種奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試根腫菌

莖瘤芥腫根來自重慶市涪陵區(qū)，使用Williams鑒定系統(tǒng)將其病原菌鑒定為4號生理小種。腫根保存于-20℃冰箱內備用。

1.1.2 供試植物

感病品種：莖瘤芥‘永安小葉為生產中較為感病的品種，將其作為感病對照，莖瘤芥‘JL-2‘JL-5和‘JL-9多次鑒定表現(xiàn)為感病，均由重慶市渝東南農業(yè)科學院提供。

抗病性鑒定材料：蕪菁‘中蕪由中國農業(yè)科學院提供;甘藍型油菜‘華雙5R由華中農業(yè)大學提供;白菜‘CR云為從云南收集的材料;白菜‘四季娃娃菜‘四季黃芯‘懷春‘CR-春美‘CR中聯(lián)金寶‘靚根CR1‘CR117‘CR-英雄‘CR愛民‘CR95和‘CR春麗均購買于市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 田間自然誘發(fā)鑒定

2020年9月-12月，于重慶市涪陵區(qū)江北街道二渡村，前茬為水稻的根腫病重病田進行田間自然誘發(fā)鑒定。每份材料播30穴，每穴1株，3次重復，同時按照隨機區(qū)組排列。播種后按常規(guī)栽培方式管理。收獲期后拔出并洗凈根部進行發(fā)病情況的調查。

1.2.2 休眠孢子懸浮液的制備

休眠孢子懸浮液的制備參考郭向華等[17]的方法。

1.2.3 室內人工接種鑒定

在無菌土中加入休眠孢子懸浮液，使菌土中孢子含量達到2×108 個/g，用石灰和硫酸鋁將土壤pH調至5.5，菌土含水量控制在60%左右，將混勻的菌土分裝至8 cm×8 cm的營養(yǎng)缽中。每份材料30缽，每缽1株，重復3次。接種后的材料置于晝夜溫度26℃/20℃（白天/黑夜），光照強度200 μmol/（m2·s），光周期L∥D=16 h∥8 h的可控培養(yǎng)箱中，定期澆灌自來水。播種50 d后拔出莖瘤芥植株并洗凈其根系，調查植株發(fā)病情況。

1.2.4 雜交及親和指數(shù)測定

2019年10月，將莖瘤芥和白菜‘CR云移栽于重慶市渝東南農業(yè)科學院試驗地，進行正常的肥水管理。翌年4月初采集白菜‘CR云的花粉分別在莖瘤芥‘JL-2‘JL-5和‘JL-9植株上進行人工蕾期授粉。待結實成熟后收集角果，統(tǒng)計角果里的飽滿籽粒數(shù)。

1.2.5 調查及統(tǒng)計

單株分級標準參考司軍等[18]的方法。0級：根系生長正常、無腫瘤;1級：根系主根不發(fā)病或膨大不明顯，直徑≤2倍莖基部或須根有小腫瘤;2級：主根明顯腫大，2倍莖基部<直徑≤3倍莖基部;3級：主根明顯腫大，3倍莖基部<直徑≤4倍莖基部;4級：主根明顯腫大，直徑>4倍以上莖基部或根部發(fā)黑腐爛，無須根。

發(fā)病率=（染病株數(shù)/調查總株數(shù)）×100%;

病情指數(shù)=100×∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調查總株數(shù)×最高級代表值）。

抗病性分級標準參照楊曉云等[19]的方法，分為5級，即免疫（I）：病情指數(shù)=0，高抗（HR）：0 <病情指數(shù)≤11.11，抗病（R）：11.11<病情指數(shù)≤33.33，感?。⊿）：33.33<病情指數(shù)≤55.55，高感（HS）：病情指數(shù)>55.55。

親和指數(shù)=結籽數(shù)/授粉花數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 2010軟件處理，用DPS 1450軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同材料對根腫病的抗性鑒定

2.1.1 田間自然誘發(fā)鑒定

采用田間自然誘發(fā)鑒定，以莖瘤芥‘永安小葉為感病對照，對14份材料進行根腫病的抗性鑒定。其中免疫材料3份，分別為蕪菁‘中蕪、甘藍型油菜‘華雙5R和白菜‘CR云，占供試材料的21.43%。高抗材料4份，分別為白菜‘CR-英雄‘CR愛民‘CR95和‘CR春麗，占供試材料的28.57%。高抗材料中白菜‘CR春麗病情指數(shù)最低，為0.87，顯著低于‘CR愛民 ‘CR-英雄，而與‘CR95差異不顯著;其發(fā)病率也最低，為（1.672.36）%，極顯著低于‘CR95‘CR愛民 ‘CR-英雄?？共〔牧?份，分別為白菜‘四季娃娃菜‘四季黃芯‘懷春‘CR-春美‘CR中聯(lián)金寶‘靚根CR1‘CR117，占供試材料的50.00%。14份供試材料在田間自然誘發(fā)鑒定中均未被鑒定為感病。

2.1.2 室內人工接種鑒定

采用室內人工接種鑒定，以莖瘤芥‘永安小葉為感病對照，對14份材料進行根腫病的抗性鑒定?？共⌒澡b定結果顯示不同材料的抗病性存在較大差異。免疫材料1份，為蕪菁‘中蕪，占供試材料的7.14%。高抗材料4份，分別為白菜‘CR-英雄‘CR春麗‘CR云和甘藍型油菜‘華雙5R，占供試材料的28.57%。其中甘藍型油菜‘華雙5R的發(fā)病率極顯著低于白菜‘CR云和‘CR-英雄，病情指數(shù)顯著低于其他3種高抗材料?？共〔牧?份，分別為白菜‘懷春‘CR117‘CR愛民‘CR95‘靚根CR1和‘CR中聯(lián)金寶，占供試材料的42.86%。感病材料1份，為白菜‘CR-春美，占供試材料的7.14%。高感病材料2份，分別為白菜‘四季娃娃菜和‘四季黃芯，占供試材料的14.29%。其中白菜‘四季娃娃菜的病情指數(shù)（75.676.99），極顯著高于白菜‘四季黃芯。

基于兩種方法對14份材料的鑒定結果，用兩種方法鑒定均表現(xiàn)高抗或免疫根腫病的材料有5份，分別是‘中蕪‘CR云‘華雙5R‘CR春麗和‘CR-英雄。采用兩種方法鑒定都表現(xiàn)為抗病的材料有‘CR懷春‘CR117‘靚根CR1和‘CR中聯(lián)金寶4份材料。至少有1種方法鑒定為感病或高感的材料有‘CR-春美‘四季娃娃菜和‘四季黃芯3份?！瓹R愛民和‘CR952份材料采用田間自然誘發(fā)鑒定的抗病性表現(xiàn)優(yōu)于室內人工接種鑒定的結果。

2.2 莖瘤芥抗根腫病材料的創(chuàng)制

2.2.1 莖瘤芥與白菜‘CR云種間雜交親和性研究

挑選3份莖瘤芥作為母本，白菜‘CR云作為父本，采取人工蕾期授粉的方式創(chuàng)制莖瘤芥×白菜材料。從表3的統(tǒng)計結果來看，3份莖瘤芥與白菜‘CR云種間雜交的親和性不一樣，其中‘JL-5與‘CR云種間雜交的親和性最好，親和指數(shù)為3.17，與組合‘JL-2×CR云的親和性差異不顯著。而‘JL-9與白菜‘CR云的親和性最差，親和指數(shù)極顯著低于組合‘JL-5×CR云和‘JL-2×CR云（圖2）。

2.2.2 F1材料真?zhèn)坞s種鑒定

種間雜交獲得的F1材料，移栽到大田后植株生長狀況良好。形態(tài)學上既表現(xiàn)出莖瘤芥的瘤莖突起，又表現(xiàn)出白菜薹生葉呈環(huán)抱狀態(tài)的特點，開展度較大，不包心。與莖瘤芥比較，成株期葉片數(shù)量變多，葉柄變寬，長度介于莖瘤芥和白菜之間，葉表面有刺毛，具有白菜葉片的特點（圖3）。對F1材料進行根腫病抗性鑒定，根系生長正常，無腫根，天氣晴朗時植株生長正常，無萎蔫，表現(xiàn)為抗?。▓D4）?？偨Y以上農藝性狀和抗病性并與莖瘤芥、白菜比較發(fā)現(xiàn)，可以判斷其為莖瘤芥與白菜雜交后形成的真雜種。

3 討論

莖瘤芥對根腫病的抗性本質上是由其本身的抗病基因控制，亦受環(huán)境條件、根腫菌數(shù)量和致病力的影響。本試驗采用田間自然誘發(fā)和室內人工接種鑒定兩種方法進行根腫病抗性鑒定，9份材料的抗性分級因鑒定方法的不同而出現(xiàn)不同的結果，在這之前甘彩霞等[20]也發(fā)現(xiàn)苗期抗性鑒定病情指數(shù)高，成株鑒定時病情指數(shù)不一定高。與李慧楠等的研究結果不一樣[21]，可能是由于田間自然誘發(fā)鑒定法采用的根腫病田里根腫菌分布不如室內人工接種鑒定均勻一致，環(huán)境條件也達不到統(tǒng)一可控。采用室內人工接種鑒定法的根腫病發(fā)病率和病情指數(shù)絕大部分高于田間自然誘發(fā)鑒定，可能是室內環(huán)境條件為根腫病發(fā)生較為適宜的條件。然而室內人工接種鑒定，挑選的根腫菌較田間的代表性差[22]。本試驗將田間和室內試驗相結合，提高了鑒定結果的可靠性。經過兩種方法鑒定的14份材料對根腫病的抗性，其中均表現(xiàn)高抗或免疫根腫病的5份材料，為‘中蕪‘CR云‘華雙5R‘CR春麗和‘CR-英雄，這些品種可以在重慶市涪陵區(qū)根腫病區(qū)種植，也可以作為莖瘤芥抗根腫病材料創(chuàng)制的抗性資源。至少有1種方法鑒定為感病的材料有‘CR-春美‘四季娃娃菜和‘四季黃芯3份，不適宜在根腫病區(qū)種植。

莖瘤芥和白菜同屬于十字花科作物，但是兩個不同種。十字花科作物種間雜交報道非常多，成功地獲得種間雜交種的案例也很多，有的材料通過抗根腫病鑒定也表現(xiàn)為抗病[23-25]。而關于莖瘤芥與其他十字花科作物雜交的研究還未發(fā)現(xiàn)。鄧婧等[26]在文章中指出蕓薹屬作物種間雜交時，具有部分同源染色體組的兩個親本親和性較強。也有研究表明染色體組AABB的作物和染色體組AA的作物雜交容易得到雜種[27-28]。故本試驗選用經兩種方法鑒定都表現(xiàn)抗根腫病的白菜品種‘CR云作為CR基因的來源，大大地增加了在F1中篩選到抗病材料的機會。本研究發(fā)現(xiàn)，雜交所用的莖瘤芥基因型對親和指數(shù)有影響，莖瘤芥母本選用‘JL-5和‘JL-2時，種間雜交親和性好。王國槐等[29]和廖慧敏[30]的研究證明十字花科種間雜種的營養(yǎng)優(yōu)勢十分顯著。本研究種間雜交獲得的F1雜種優(yōu)勢表現(xiàn)明顯，兼具莖瘤芥和白菜農藝性狀的特點，最為明顯之處是既表現(xiàn)出莖瘤芥的瘤莖突起，又表現(xiàn)出白菜薹生葉呈環(huán)抱狀態(tài)。

本試驗采用兩種鑒定方法篩選出5份可以作為莖瘤芥（榨菜）抗根腫病材料創(chuàng)制的抗性資源，分別是‘中蕪‘CR云‘華雙5R‘CR春麗和‘CR-英雄，進而獲得莖瘤芥和白菜種間雜交的F1，結合形態(tài)學鑒定和根腫病抗性鑒定確定為真雜種。該材料將為通過回交轉育、抗病性鑒定和分子標記輔助選擇（MAS），最終獲得莖瘤芥抗根腫病新材料奠定基礎。

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（責任編輯：田 喆）