吉林、黑龍江毛蔥病毒病調(diào)查

劉建青 王永志 周琦 黃淑敏 梁雨欣 張春雨 魏健 程兆偉 李小宇

摘要 本研究為明確吉林和黑龍江省毛蔥病毒病發(fā)生率，從兩省5個地區(qū)共采集255份毛蔥樣品。根據(jù)毛蔥4種主要病毒基因組序列設(shè)計特異性引物，對胡蔥黃條病毒Shallot yellow stripe virus（SYSV）和青蔥X病毒Shallot virus X （SVX）、洋蔥黃矮病毒Onion yellow dwarf virus （OYDV）和蔥潛隱病毒Shallot latent virus （SLV）進行雙重RT-PCR檢測。結(jié)果表明，229份樣品檢出病毒，帶毒率為89.8%，SLV的檢出率最高，達87.06%，OYDV次之，為36.86%，SYSV檢出率偏低，為0.78%;同時存在病毒復(fù)合侵染，其中雙病毒復(fù)合侵染為SLV和OYDV，檢出率為33.3%;三病毒復(fù)合侵染為SYSV、OYDV和SLV，檢出率為0.78%，未發(fā)現(xiàn)4種病毒復(fù)合侵染。本研究為吉林和黑龍江種植區(qū)毛蔥病毒病防治提供了參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞 毛蔥; 病毒病; 雙重RT-PCR

中圖分類號： S 436.33

文獻標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020617

Investigation of virus disease on shallot in Jilin and Heilongjiang provinces

LIU Jianqing1，2， WANG Yongzhi2， ZHOU Qi3， HUANG Shumin3， LIANG Yuxin2，

ZHANG Chunyu2， WEI Jian1*， CHENG Zhaowei4*， LI Xiaoyu2*

（1. School of Life Science， Changchun Normal University， Changchun 130032， China; 2. Jilin Academy of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China; 3. Jingyu County Agro-Tech Extension Center， Jilin

Province， Baishan 135200， China; 4. Jilin Provincial Agro-Tech Extension Center， Changchun 130033， China）

Abstract

To investigate the incidence of shallot virus diseases in Jilin and Heilongjiang provinces， 255 samples were collected. Four viruses specific primers were designed according to viral genomic sequences， Shallot yellow stripe virus （SYSV） and Shallot virus X （SVX）， Onion yellow dwarf virus （OYDV） and Shallot latent virus （SLV） were detected by duplex RT-PCR. The results showed that 229 samples were positive， and the incidence of virus disease was 89.8%， of which 87.06% were infected with SLV， 36.86% with OYDV and 0.78% with SYSV. Coinfection of SLV and OYDV was the main type of multiple infections with the infection rate of 33.3%， and the mixed-infection of SYSV， OYDV and SLV was the main type of infection containing three kinds of viruses with an incidence of 078%. However， no four virus coinfection was detected. The results provide basis for the prevention and control of virus diseases in shallot planting areas of Jilin and Heilongjiang provinces.

Key words

Allium cepa var. aggregatum; virus disease; duplex RT-PCR

分蘗洋蔥Allium cepa var. aggregatum，俗稱毛蔥，為百合科Liliaceae蔥屬Allium兩年生草本蔥蒜類蔬菜[1]，具有較高的食用價值和藥用價值，深受消費者青睞，大量出口創(chuàng)匯。毛蔥一般以分蘗小鱗莖進行無性繁殖[2]，長期的無性繁殖使毛蔥所感染的病毒逐代傳遞和積累，造成35%以上的減產(chǎn)，嚴(yán)重制約著毛蔥產(chǎn)業(yè)綠色健康發(fā)展[3]。

本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，侵染毛蔥的病毒主要包括胡蔥黃條病毒Shallot yellow stripe virus （SYSV）、洋蔥黃矮病毒Onion yellow dwarf virus （OYDV）[4-5]、青蔥X病毒Shallot virus X （SVX）和蔥潛隱病毒Shallot latent virus （SLV）[6]，往往呈復(fù)合感染。SYSV和OYDV隸屬于馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus，植株感染SYSV后葉片主要表現(xiàn)為縱向黃色條紋，嚴(yán)重時導(dǎo)致植株矮化[7];植株感染OYDV后主要表現(xiàn)為葉片局部不規(guī)則發(fā)黃，向下卷曲，萎縮等癥狀[8];二者通過蚜蟲、汁液摩擦或帶毒種苗傳播[7， 9]。SVX隸屬于青蔥X病毒屬Allexivirus，植株感染SVX后沒有明顯病變[10]。SLV隸屬于香石竹潛隱病毒屬Carlavirus，植株感染SLV后癥狀不明顯，在全世界毛蔥種植區(qū)普遍存在[11]。

植物病毒檢測通常采用分子生物學(xué)和血清學(xué)等手段[12]，多重RT-PCR可應(yīng)用于多種植物病毒的同時檢測;與常規(guī)RT-PCR法相比，檢測效率更高、檢測時間更短、成本更低[13]。本研究通過應(yīng)用實驗室所建立的雙重RT-PCR檢測體系，對吉林、黑龍江毛蔥種植區(qū)病毒感染情況進行調(diào)查，以期為毛蔥病毒病防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物

2019年5月中旬到6月初，在吉林柴崗鎮(zhèn)、三清山鎮(zhèn)、露水河鎮(zhèn)、大安鎮(zhèn)和黑龍江阿城縣5個地區(qū)采用五點取樣法分別隨機采集32、79、81、27、36份樣品，經(jīng)液氮速凍后立即置于-80℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑儀器

主要試劑：TRIzol購自Invitrogen公司，Premix Ex TaqTM、1st Strand cDNA Synthesis Kit購自TaKaRa公司，其余生化試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器：高速冷凍臺式離心機（CT15RE型）購自日本日立公司，基因擴增儀（ETC-811型）購自東勝創(chuàng)新生物技術(shù)有限公司，電泳儀（DYY-11型）購自北京市六一儀器廠，凝膠成像儀購自美國WEALTET公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中已提交的SYSV、OYDV、SVX和SLV等4種病毒基因序列保守區(qū)分別設(shè)計相關(guān)引物，如表1所示， 均由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

1.2.2 雙重RT-PCR檢測

采用TRIzol法提取疑似感病和健康毛蔥葉片總RNA，-80℃冰箱中保存，備用。根據(jù)1st Strand cDNA Synthesis Kit說明書合成cDNA，并以其為模板進行雙重RT-PCR擴增。10 μL PCR反應(yīng)體系：SYSV/SVX或OYDV/SLV上下游引物（10 μmol/L）各0.1 μL，Premix Ex TaqTM 5 μL，模板cDNA 0.5 μL，加ddH2O補足至10 μL;擴增程序：94℃預(yù)變性3 min; 94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸50 s，30個循環(huán); 72℃延伸10 min， 4℃冰箱中保存。將PCR擴增產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶大小確定毛蔥病原種類，并送往吉林省庫美生物科技有限公司進行測序驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重RT-PCR檢測體系的建立

在單重RT-PCR的基礎(chǔ)上，建立雙重RT-PCR檢測體系，可同時檢測出SYSV和SVX、OYDV和SLV。結(jié)果顯示：雙重RT-PCR同時擴增SYSV和SVX、OYDV和SLV時，在同一泳道可清晰地看到SYSV和SVX、OYDV和SLV的特異性條帶，達到了預(yù)期效果（圖1）。

2.2 田間樣品病毒感染情況調(diào)查

對所采集的255份樣品進行雙重RT-PCR檢

測，病毒檢出率為89.80%;如表2所示，SLV陽性檢出率最高，達到87.06%，表明SLV在吉林、黑龍江毛蔥種植區(qū)普遍存在;SYSV的陽性檢出率相對偏低，為0.78%;本次調(diào)查的樣品未檢測出SVX。

病毒侵染包括單獨侵染和復(fù)合侵染。SLV單獨侵染率為52.94%，OYDV單獨侵染率為2.75%。在本次調(diào)查中未發(fā)現(xiàn)SYSV和SVX單獨侵染毛蔥。復(fù)合侵染主要包括雙病毒復(fù)合侵染和三病毒復(fù)合侵染，未發(fā)現(xiàn)四病毒復(fù)合侵染。雙病毒復(fù)合侵染為SLV和OYDV，檢出率為33.3%;三病毒復(fù)合侵染為SYSV、OYDV和SLV，檢出率為0.78%，由此可見，在毛蔥病毒復(fù)合侵染中，SLV和OYDV雙病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍。

2.3 不同地區(qū)毛蔥主要病毒感染情況調(diào)查

對不同毛蔥種植區(qū)病毒感染情況的調(diào)查分析表明（表3），阿城縣陽性檢出率最高，達到97.22%，露水河鎮(zhèn)陽性檢出率相對較低，為83.95%，可見在各個調(diào)查區(qū)病毒感染率普遍偏高。綜合分析各病毒的感染情況，發(fā)現(xiàn)SLV普遍侵染各個產(chǎn)區(qū)，OYDV侵染僅存在于三清山鎮(zhèn)和露水河鎮(zhèn)，此次調(diào)查的5個毛蔥產(chǎn)區(qū)均未檢測出SYSV和SVX單獨侵染。此外，毛蔥病

毒還存在復(fù)合侵染現(xiàn)象，OYDV和SLV復(fù)合侵染普遍存在于不同毛蔥產(chǎn)區(qū)，其中在柴崗鎮(zhèn)復(fù)合侵染率

最高，為56.25%;SYSV、OYDV和SLV復(fù)合侵染僅存在于柴崗鎮(zhèn)和大安鎮(zhèn)，分別為313%和3.70%。

3 討論

近幾年，隨著東北地區(qū)毛蔥種植面積的不斷擴大，以及無性繁殖種植模式的長期應(yīng)用，導(dǎo)致東北毛蔥病毒病普遍發(fā)生，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。本研究對吉林和黑龍江5個毛蔥種植區(qū)病毒病害發(fā)生情況進行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)各個種植區(qū)樣品感染率普遍偏高，平均病毒檢出率超過80%，其中阿城縣、三清山鎮(zhèn)和柴崗鎮(zhèn)病毒檢出率均超過90%。三清山鎮(zhèn)和柴崗鎮(zhèn)是吉林省主要的毛蔥生產(chǎn)地和集散地，種植戶通常自己留種或從黑龍江省買種，由于缺乏有效的病毒檢測方法，使得病毒病泛濫，造成嚴(yán)重減產(chǎn)。

對田間毛蔥樣品進行病毒檢測分析發(fā)現(xiàn)，SLV陽性樣品最多，這可能與生產(chǎn)過程中種植戶主要依據(jù)表觀留種有關(guān)[14]，由于SLV單獨侵染植株后，造成的表觀癥狀并不明顯，很難篩選出不含SLV的鱗

莖。復(fù)合侵染是病毒感染植物的一種常見現(xiàn)象，本研究發(fā)現(xiàn)吉林、黑龍江毛蔥主產(chǎn)區(qū)OYDV和SLV復(fù)

合侵染現(xiàn)象最常見，這可能是因為OYDV屬于馬

鈴薯Y病毒屬Potyvirus，SLV屬于香石竹潛隱病毒屬Carlavirus，兩種不同科屬病毒在侵染植物時容易發(fā)生協(xié)生效應(yīng)[15-16]，而這種互作機制對病毒侵染具有促進作用，因此在檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)了大量的OYDV和SLV復(fù)合侵染。目前，沒有防治毛蔥病毒病的有效藥劑，現(xiàn)階段除了采用脫毒種苗生產(chǎn)和抗病毒品種選育的方法外，還應(yīng)加強對蚜蟲等傳毒媒介的監(jiān)測和防治，從而阻止病毒在毛蔥主產(chǎn)區(qū)的進一步蔓延。

本研究通過采用SYSV和SVX、OYDV和SLV雙重RT-PCR檢測體系，對255份田間樣品進行病毒檢測，明確了吉林、黑龍江兩省毛蔥主產(chǎn)區(qū)主要病毒病害的發(fā)生現(xiàn)狀，對毛蔥病毒病的檢測及綜合防治具有重要意義。目前關(guān)于毛蔥病毒的研究大部分都集中于病毒檢測方法，而對于病毒積累量和病害發(fā)生的相關(guān)關(guān)系等方面的研究有待進一步深入。

參考文獻

[1] 李曙軒. 栽培學(xué)各論[M]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)出版社， 1980： 12.

[2] 劉瑋， 寧淑香， 崔成日， 等. 赤霉素對毛蔥生長發(fā)育影響研究[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2011， 42（7）： 83-86.

[3] 王勇， 梁譽， 陳典， 等. 分蘗洋蔥再生體系的建立與優(yōu)化[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2013， 44（7）：96-100.

[4] SU Ying， WANG Yongzhi， LI Xiaoyu， et al. First report of Onion yellow dwarf virus on shallot （Allium cepa var. aggregatum） in China [J]. Plant Disease， 2018， 103（4）： 778.

[5] 郭炎， 李小宇， 蘇穎， 等. 洋蔥黃矮病毒RT-PCR和ELISA檢測方法的建立[J]. 植物保護學(xué)報， 2019， 46（2）： 495-496.

[6] WANG Yongzhi， SU Ying， LI Xiaoyu， et al. First report of Shallot virus X and Shallot latent virus on shallot （Allium cepa var. aggregatum） in China [J]. Plant Disease， 2019， 103（11）： 2972.

[7] 馬俊豐， 張宸， 張春雨， 等. 胡蔥黃條病毒吉林毛蔥分離物全基因組序列測定與分析[J]. 中國蔬菜， 2020（6）：44-48.

[8] VAN DIJK P. Carlavirus isolates from cultivated Allium species represent three viruses [J]. Netherlands Journal of Plant Pathology， 1993， 99（5）： 233-257.

[9] 王永志， 萬千， 李小宇， 等. OYDV衣殼蛋白表達及其單克隆抗體分析[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 43（2）：26-29.

[10]陳輝麟. 大蒜病毒Real Time PCR定量檢測方法的建立及其應(yīng)用[D]. 蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2014.

[11]李甜甜. 溫度和水分對大蒜生理生化特性及葉片OYDV和LYSV病毒積累的影響[D]. 蘭州： 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2015.

[12]張靜雅， 何衍彪. 植物病毒病檢測及防治技術(shù)研究進展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報， 2019， 25（12）： 79- 81.

[13]杜真真， 劉艷， 王錫鋒. 雙重RT-PCR法同步檢測單頭異沙葉蟬攜帶的兩種小麥病毒[J]. 植物保護， 2020， 46（3）：175- 179.

[14]李小宇， 郭炎， 張春雨， 等. 吉林、黑龍江部分地區(qū)毛蔥OYDV感染情況調(diào)查[J]. 東北農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2019， 44（6）： 53-56.

[15]李舒. 南方水稻黑條矮縮病毒與水稻齒葉矮縮病毒協(xié)生作用研究[D]. 廣州： 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[16]常飛， 鄒文超， 高芳鑾， 等. 不同寄主來源的馬鈴薯Y病毒群體遺傳結(jié)構(gòu)的比較分析[J]. 遺傳， 2015， 37（3）： 292-301.

（責(zé)任編輯：田 喆）