黃花倒水蓮根結(jié)線蟲病的病原鑒定

章淑玲 陳曉波 丁玲

摘要 2019年在福建省多個(gè)地方發(fā)現(xiàn)黃花倒水蓮Polygala fallax遭受根結(jié)線蟲的嚴(yán)重侵染，為明確病原線蟲種類，運(yùn)用形態(tài)學(xué)、rDNA-ITS序列分析及特異引物PCR擴(kuò)增的方法對(duì)分離獲得的根結(jié)線蟲進(jìn)行種類鑒定。結(jié)果表明，該病原線蟲為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita。黃花倒水蓮根結(jié)線蟲病在我國為首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞 黃花倒水蓮; 南方根結(jié)線蟲; 鑒定; 首次報(bào)道

中圖分類號(hào)： S 435.67

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020212

Identification of the pathogen causing root-knot nematode disease in Polygala fallax

ZHANG Shuling， CHEN Xiaobo， DING Ling

（Fujian Vocational College of Agriculture， Fuzhou 350119， China）

Abstract

In 2019， the severe infestation of Polygala fallax by root-knot nematode occurred in several places of Fujian province. In order to confirm the species of root-knot nematode， the nematode was identified by morphological observation， rDNA-ITS sequence analysis and PCR amplification using species-specific primers. The results showed that the root-knot nematode in P.fallax was Meloidogyne incognita. This is the first report of root-knot nematode disease in P.fallax in China.

Key words

Polygala fallax; Meloidogyne incognita; identification; first report

黃花倒水蓮Polygala fallax Hemsl.為遠(yuǎn)志科Polygalaceae遠(yuǎn)志屬Polygala植物，又稱黃花遠(yuǎn)志、倒吊黃花、黃花參等。該植物可以根入藥，具有益氣補(bǔ)血、健脾利濕、活血調(diào)經(jīng)的功效，主要用于病后體虛、腰膝酸痛、跌打損傷、黃疸肝炎等疾病的治療，屬珍貴的中藥材[1]。由于黃花倒水蓮花期長（長達(dá)3個(gè)月）、花色艷麗，還是一類重要的園林觀賞植物。目前該植物主要分布于福建、廣西、江西、云南等地的溝谷叢林中或山坡林地下[2]。當(dāng)前市場(chǎng)上為滿足人們對(duì)黃花倒水蓮的藥用和觀賞價(jià)值的不斷需求，規(guī)?；娜斯づ嘤N植是解決其野生資源不足的重要途徑[3-4]。2019年在福建泉州、漳州、龍巖多地發(fā)現(xiàn)人工栽培的黃花倒水蓮因受根結(jié)線蟲病的嚴(yán)重危害而造成50%以上的減產(chǎn)。本研究對(duì)福建省多地發(fā)生的人工栽培黃花倒水蓮根結(jié)線蟲病進(jìn)行了病害的調(diào)查、取樣、病原線蟲的形態(tài)學(xué)與分子生物學(xué)鑒定，明確其病原為南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病害樣本的采集

2019年采集福建泉州、漳州、龍巖等發(fā)病地染病的黃花倒水蓮病株根莖及根系周圍的病土，分別將病根莖連同周圍的病土（約500 g）放入自封袋內(nèi)，注明各病樣的采集日期、地點(diǎn)、前茬作物及發(fā)病地的土壤類型等。采集到的樣本帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行進(jìn)一步的觀察、分離與鑒定[5]。

1.2 線蟲種群純化與保存

于體視顯微鏡（Nikon SMZ745T）下分離黃花倒水蓮病根組織中的單卵囊，分別接種到經(jīng)滅菌培養(yǎng)的長有2～3片真葉的番茄苗根部，進(jìn)行線蟲種群的純化與保存[5]。

1.3 病原線蟲的形態(tài)學(xué)鑒定

用于形態(tài)鑒定的各蟲態(tài)線蟲均分離自單卵囊繁育的番茄根結(jié)線蟲種群。雌蟲經(jīng)剖解病根組織所得;雄蟲由改良貝爾曼漏斗法分離染病番茄的培養(yǎng)介質(zhì)獲得;2齡幼蟲來自于番茄病根處的單卵囊孵化獲得。供試線蟲的殺死、固定及會(huì)陰花紋的制作方法參照張紹升[6]。各蟲態(tài)線蟲的體長、體寬、口針長、背食道腺開口至口針基部球的距離（DGO）和尾長等重要分類形態(tài)與特征值于Leica D6000顯微鏡下拍照、測(cè)量并用De Man公式進(jìn)行計(jì)量[6-7]。各蟲態(tài)分別取30個(gè)樣本，形態(tài)拍照時(shí)除雌蟲頭部1 000×外其他蟲態(tài)特征均在400×下進(jìn)行。

1.4 病原線蟲的分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 DNA提取

病原線蟲DNA的提取方法參照陳淑君等[8]。于體視鏡下挑取1～3條2齡幼蟲，用滅菌ddH2O清洗2～3次，加入到4 μL WLB（線蟲裂解液）中，用無菌挑針將線蟲切為2～3段，后用移液槍將含有線蟲的懸浮液吸入含有1.2 μL蛋白酶K和17 μL WLB的Eppendorf管中，放入-20℃冰箱中冷凍過夜。次日取出置于PCR儀中65℃消化60 min，95℃滅活10 min，10 000 r/min離心2 min。離心后的上清液直接用于PCR擴(kuò)增或置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 rDNA-ITS序列分析

選用的線蟲ITS區(qū)通用引物V5367（5′-TTGATTACGTCCCTGCCCTTT-3′）和26S（5′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′）[9]由生工生物工程（上海）

股份

有限公司合成。25 μL PCR反應(yīng)體系：2.0 μL DNA模板，12.5 μL 10×PCR Master Mixture，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，8.5 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸45 s，35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1% 瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，其余產(chǎn)物經(jīng)鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。將獲得的黃花倒水蓮根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中常見根結(jié)線蟲序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，后利用MEGA X軟件的鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以自展法（bootstrap）進(jìn)行1 000次檢測(cè)[10]。

1.4.3 特異性引物檢測(cè)

根據(jù)病原線蟲的形態(tài)學(xué)與ITS序列分析結(jié)果，選用南方根結(jié)線蟲特異性引物Mi-F（5′-GTGAGGATTCAGCTCCCCAG-3′）和 Mi-R（5′-ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC-3′）[11]對(duì)供試的福建省泉州、漳州、龍巖3個(gè)地理種群的黃花倒水蓮根結(jié)線蟲進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增。25 μL PCR反應(yīng)體系，擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4 min;94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)黃花倒水蓮受根結(jié)線蟲嚴(yán)重侵染后，植株地上部表現(xiàn)出明顯矮化，葉片失綠黃化，生長緩慢，甚至整株枯死（圖1a）。受害根部表面出現(xiàn)許多粗糙、形狀大小不一的根結(jié)，部分根結(jié)連成塊狀腫瘤，直徑為健株根的2倍以上。隨著病情加重，病根處的根結(jié)由黃褐色漸變成黑褐腐爛狀（圖1b～c）。剖解受害根組織可見球形或梨形的雌蟲及埋生于根結(jié)內(nèi)的褐色卵囊（圖1d～e）。受害地塊黃花倒水蓮株發(fā)病率為20%～100%。

2.2 形態(tài)特征

雌蟲呈球形或梨形，乳白色，有一明顯的短頸，頭區(qū)的骨質(zhì)化不明顯?？卺樰^纖細(xì)，排泄孔位于口針基部球附近（圖2a）。會(huì)陰花紋呈圓形或橢圓形，線紋較平滑或有波浪形紋，背弓較高;側(cè)區(qū)的側(cè)線不明顯，陰肛區(qū)無明顯線紋（圖2b～c）。

雄蟲為蠕蟲形，體較長，頭區(qū)骨質(zhì)化較明顯，無明顯縊縮?？卺樰^發(fā)達(dá)，排泄孔位于峽部附近，后食道腺從側(cè)腹面覆蓋于腸的前端（圖2d）。側(cè)區(qū)有4條明顯的側(cè)線;交合刺發(fā)達(dá)，無交合傘包被（圖2e）。

2齡幼蟲蠕蟲形，體小，頭區(qū)骨質(zhì)化弱?？卺樌w細(xì)，基部球小，排泄孔位于食道腺前端，后食道腺從側(cè)腹面覆蓋于腸（圖2f）。尾呈長錐形，末端有一清晰的透明區(qū)，常伴有1～2個(gè)縊縮（圖2g）。

黃花倒水蓮根結(jié)線蟲形態(tài)測(cè)量值見表l。通過形態(tài)鑒定，黃花倒水蓮根結(jié)線蟲的分類特征與南方根結(jié)線蟲Meloidogyne incognita （Kofold & White） Chitwood的描述相符[12-13]。

2.3 分子生物學(xué)特征鑒定

利用通用引物V5367/26S對(duì)福建省黃花倒水蓮根結(jié)線蟲的3個(gè)地理種群進(jìn)行rDNA-ITS擴(kuò)增與測(cè)序后均得到了768 bp序列，GenBank登錄號(hào)為MT361637～MT361639。利用Blast比對(duì)分析顯示供試的黃花倒水蓮根結(jié)線蟲與GenBank中南方根結(jié)線蟲M.incognita（MH113856～MH113858，MH665425，MH734918，KP901064，AY438556，KC464469）的序列相似性達(dá)到99%～100%。利用MEGA X軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出，3個(gè)地理種群的黃花倒水蓮根結(jié)線蟲與南方根結(jié)線蟲的遺傳距離最近（圖3）。

根據(jù)以上形態(tài)及分子序列分析結(jié)果，利用南方根結(jié)線蟲特異性引物Mi-F/Mi-R對(duì)黃花倒水蓮根結(jié)線蟲的3個(gè)地理種群進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均擴(kuò)增出大約1 000 bp的清晰條帶，陰性對(duì)照沒有條帶（圖4）。這一研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致[11]，以此可確定采集自福建省3個(gè)地方的黃花倒水蓮根結(jié)線蟲均為南方根結(jié)線蟲。

3 結(jié)論與討論

形態(tài)學(xué)結(jié)合分子生物學(xué)是當(dāng)前植物寄生線蟲種類鑒定的主要方法。線蟲rDNA-ITS因其在種內(nèi)高度的保守性和種間的變異性而廣泛運(yùn)用于種的分類鑒定。但南方根結(jié)線蟲M.incognita、西班牙根結(jié)線蟲M.hispanica、爪哇根結(jié)線蟲M.javanica和花生根結(jié)線蟲M.arenaria的rDNA-ITS序列同源性較高，可達(dá)99%以上[14-15]。本研究中黃花倒水蓮根結(jié)線蟲rDNA-ITS序列與南方根結(jié)線蟲種群的同源性最高，與花生根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲也有較高的同源性，但結(jié)合供試線蟲各蟲態(tài)的形態(tài)描述及線蟲種間特異性引物擴(kuò)增條帶的結(jié)果，最終鑒定福建省漳州、泉州、龍巖等多地黃花倒水蓮的根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲M.incognita。黃花倒水蓮根結(jié)線蟲病為我國首次報(bào)道。黃花倒水蓮為南方根結(jié)線蟲的新寄主。南方根結(jié)線蟲是一類分布廣、危害重的病原線蟲，受害寄主作物一般減產(chǎn)15%～20%，嚴(yán)重時(shí)達(dá)70%以上，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1 000億美元[16-17]。本研究調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在福建多地人工培植的黃花倒水蓮出現(xiàn)長勢(shì)衰退、葉黃、枯死等癥狀，多數(shù)是由于根結(jié)線蟲侵染所致，而黃花倒水蓮根結(jié)線蟲病發(fā)生的地塊多為砂質(zhì)土壤，其前茬作物往往是上一年有發(fā)生根結(jié)線蟲病的蔬菜類作物。因此，為預(yù)防人工栽培黃花倒水蓮根結(jié)線蟲病的發(fā)生，選擇的栽培地必須是無病地塊，尤其不能選擇往年有根結(jié)線蟲病發(fā)生的砂質(zhì)地。幼苗移植前或定植后發(fā)現(xiàn)長勢(shì)衰退的植株應(yīng)檢查根部是否有根結(jié)，一旦發(fā)現(xiàn)根結(jié)病株立即銷毀并對(duì)周圍植株施用噻唑膦或氟吡菌酰胺等殺線蟲劑進(jìn)行消殺處理。

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（責(zé)任編輯：田 喆）