甘蔗白葉病抗病性鑒定方法的建立與應(yīng)用

李文鳳 王曉燕 倉曉燕 單紅麗 王長秘 張榮躍 尹炯 黃應(yīng)昆

摘要 為建立簡便高效、致病性穩(wěn)定和規(guī)范實(shí)用的甘蔗抗白葉病鑒定方法，推動(dòng)甘蔗抗白葉病育種，本文從甘蔗材料處理與種植、接種液配制、接種方式、病情調(diào)查、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定等層面對(duì)甘蔗抗白葉病鑒定技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)研究與探索，首次優(yōu)化創(chuàng)建了簡便高效、致病性穩(wěn)定和規(guī)范實(shí)用的甘蔗抗白葉病鑒定方法，即種苗噴霧接種法和生長期切莖接種法。種苗噴霧接種法：直接篩選甘蔗白葉病植原體蔗莖榨汁加10倍量無菌水配制接種液，接種液噴灑蔗種，塑料薄膜保濕，接種材料桶栽置于防蟲溫室培養(yǎng)，接種種植30 d開始調(diào)查病株率，按1～5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)。切莖接種法：直接篩選甘蔗白葉病植原體蔗莖榨汁加10倍量無菌水配制接種液，鑒定材料桶栽置于防蟲溫室培養(yǎng)，株齡6月時(shí)切莖用移液槍將100 μL接種液滴入根部切口接種，接種種植20 d開始調(diào)查病株率，按1～5級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)。兩種方法與自然傳播相似，接種后發(fā)病顯著、靈敏度高、重現(xiàn)性好，抗性鑒定結(jié)果與田間自然發(fā)病相吻合。通過兩種接種方法和田間自然發(fā)病調(diào)查，鑒定明確了10個(gè)主栽品種對(duì)甘蔗白葉病抗病性，其抗病性真實(shí)、可靠，可作為今后甘蔗抗白葉病鑒定標(biāo)準(zhǔn)品種。

關(guān)鍵詞 甘蔗白葉病; 接種技術(shù); 種苗噴霧接種法; 切莖接種法; 抗病鑒定

中圖分類號(hào)： S 435.661

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020313

Establishment and application of the resistance identification method for sugarcane white leaf disease

LI Wenfeng#， WANG Xiaoyan#， CANG Xiaoyan， SHAN Hongli， WANG Changmi，

ZHANG Rongyue， YIN Jiong， Huang Yingkun*

（Sugarcane Research Institute， Yunnan Academy of Agricultural Sciences， Yunnan Province Key

Laboratory of Sugarcane Genetic Improvement， Kaiyuan 661699， China）

Abstract

This study aims to establish a simple and efficient， standardized and practical resistance identification method with stable pathogenicity for sugarcane white leaf disease （SCWL）， and then promote resistance breeding. The resistance identification technology of SCWL was systematically investigated and explored from the aspects of treatment and planting of sugarcane varieties， inoculum preparation， inoculation method， disease investigation and formulation of grading standard. The simple and efficient， stable in pathogenicity， standardized and practical resistance identification method of SCWL namely seedcane-spraying inoculation method and stem-cutting inoculation method during growth period were optimized and established for the first time. The seedcane-spraying inoculation method was established on directly screening the sugarcane stem juice contained SCWL phytoplasma and adding 10-fold of sterile water to prepare the inoculum， spraying with the inoculum to the seedcane on the plastic film to keep moisture， planting the inoculated materials in the pot and cultivating in the insect-proof greenhouse， starting to investigate the disease incidence after 30 days of inoculation and planting， and evaluating the disease resistance according to the 1-5 grade standards. The stem-cutting inoculation method was established on directly screening the sugarcane stem juice contained SCWL phytoplasma and adding 10-fold of sterile water to prepare the inoculum， planting the tested materials in the pot and cultivating in the insect-proof greenhouse， using a pipette to drop 100 μL inoculum into the cut section of the six month old stem， starting to investigate the disease incidence after 20 days of inoculation and planting， and evaluating the disease resistance according to the 1-5 grade standards. These two inoculation methods were similar to the natural transmission， and the incidence was obvious after inoculation， the sensitivity was high， the reproducibility was good， and the resistance identified result was consistent with the natural incidence in the field. Through two methods and natural disease investigation in the field， the SCWL resistance of 10 main cultivated varieties was identified， and their resistance was true and reliable， which could be used as the SCWL resistance identification standard varieties in the future.

Key words

sugarcane white leaf disease; inoculation technology; seedcane-spraying inoculation method; stem-cutting inoculation method; resistance identification

甘蔗白葉?。╯ugarcane white leaf， SCWL）是由16Sr XI組植原體引起的危險(xiǎn)性甘蔗重要病害[1-2]。此病1954年首次在泰國發(fā)現(xiàn)[3]，現(xiàn)已廣泛發(fā)生于印度、巴基斯坦、斯里蘭卡、日本、老撾、緬甸、越南、菲律賓等東南亞國家，給當(dāng)?shù)卦斐删薮蠼?jīng)濟(jì)損失[4-7]。2013年Li等[8]首次檢測確定云南保山蔗區(qū)存在SCWL，隨后云南臨滄和普洱蔗區(qū)也相繼發(fā)現(xiàn)SCWL[9-11]。SCWL擴(kuò)散蔓延十分迅速，嚴(yán)重威脅著我國甘蔗生產(chǎn)和發(fā)展。

SCWL的癥狀主要表現(xiàn)為葉質(zhì)柔軟、白化，分蘗明顯增多，植株矮縮，節(jié)間縮短，頂部葉片叢生。甘蔗感染SCWL植原體后，株高、莖粗、有效莖數(shù)和單莖重量顯著減少，導(dǎo)致甘蔗產(chǎn)量和糖分損失嚴(yán)重[2]。SCWL植原體主要通過帶病蔗種進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播，在田間還可通過葉蟬自然傳播[2， 6]。田間調(diào)查結(jié)果表明，不同品種植期田間自然發(fā)病率不同[12]。SCWL發(fā)生受品種抗性，種蔗帶毒率、傳毒蟲媒葉蟬數(shù)量及環(huán)境條件等諸因素影響。如品種高度感病，種蔗帶毒率高，加上環(huán)境條件有利于介體昆蟲繁殖和傳毒活動(dòng)，則SCWL發(fā)生重[2]。

選育和推廣抗病品種是防控甘蔗病害最經(jīng)濟(jì)有效的方法[2]，也是最具潛力的綠色生態(tài)防控技術(shù)，而抗病性鑒定方法直接影響抗病育種成效。甘蔗白葉病是近年快速發(fā)展起來的新病害，引起甘蔗白葉病的植原體是無細(xì)胞壁原核微生物，尚不能采用人工培養(yǎng)基離體培養(yǎng)[2]，至今國內(nèi)外在甘蔗抗白葉病鑒定方面研究甚少、尚未建立甘蔗白葉病抗性鑒定方法。如何準(zhǔn)確高效評(píng)價(jià)甘蔗品種的白葉病抗病性是目前甘蔗育種家選育抗病品種面臨的一個(gè)技術(shù)瓶頸。鑒于我國甘蔗白葉病蔓延擴(kuò)展和日趨加重態(tài)勢，急需研究建立一套簡便高效、致病性穩(wěn)定和規(guī)范實(shí)用的甘蔗白葉病抗性鑒定方法，以推動(dòng)甘蔗抗白葉病育種。

1 材料與方法

1.1 供試甘蔗品種

選取‘粵糖60號(hào)‘新臺(tái)糖25號(hào)‘盈育91-59‘粵糖93-159‘新臺(tái)糖22號(hào)‘云蔗86-161‘云蔗03-194‘新臺(tái)糖10號(hào)‘柳城05-136‘云蔗05-51共10個(gè)主栽品種作供試品種，以‘粵糖86-368作感病對(duì)照，‘粵糖83-88作抗病對(duì)照。

1.2 接種病原及接種液配制

從云南省臨滄耿馬縣甘蔗白葉病發(fā)病區(qū)域選擇具典型白葉病癥狀的高感品種‘粵糖86-368蔗株，按文獻(xiàn)[13]中的方法經(jīng)巢式PCR檢測篩選含甘蔗白葉病植原體的蔗莖作接種病原。接種前壓榨作接種病原的蔗莖獲得攜帶甘蔗白葉病植原體蔗汁，加入10倍體積的無菌水稀釋混勻，用雙層紗布過濾，濾液即為甘蔗白葉病植原體接種液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 鑒定方法

1.3.1 種苗噴霧接種法

材料處理：各供試品種按文獻(xiàn)[13]中的方法經(jīng)巢式PCR檢測篩選不帶甘蔗白葉病植原體的無病健壯蔗株，分別切成帶2個(gè)芽的甘蔗莖段（即雙芽段），在常溫流動(dòng)自來水中浸泡48 h之后，用50℃±0.5℃熱水處理2 h，再用70%噻蟲嗪水分散劑和50%多菌靈可濕性粉劑1∶800倍液浸泡甘蔗莖段10 min。

種苗噴霧接種：將處理好的蔗種晾干表面水分后置于塑料膜表面，采用電動(dòng)噴霧器按1 000 kg處理好的蔗種用15 kg接種液的比例，將接種液均勻噴灑置于塑料膜表面的蔗種，邊噴邊翻動(dòng)蔗種，噴完后將該塑料膜的一半覆蓋蔗種，并在25℃下保濕24 h。

材料種植：接種后的供試品種分別種植在直徑35 cm、高30 cm的塑料桶內(nèi)，桶內(nèi)裝入2/3的高溫蒸煮消毒土壤和有機(jī)質(zhì)（3∶1），各供試品種種植4桶，每桶8芽，共32芽，置于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所（云南開遠(yuǎn)）的20～30℃抗病蟲鑒定防蟲溫室中培養(yǎng)。

病情調(diào)查：接種種植30 d后，各供試品種標(biāo)記20株調(diào)查發(fā)病株率，以后每隔15 d調(diào)查1次，直至感病對(duì)照品種發(fā)病株率穩(wěn)定為止。記錄接種日期、出苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病株數(shù)。

分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)各供試品種發(fā)病株率進(jìn)行抗性水平分類，劃分為1～5級(jí)，分別表示高抗、抗病、中抗、感病和高感，其發(fā)病株率范圍相應(yīng)為0～3%、31%～10%、10.1%～20%、20.1%～40%和401%～100%。

1.3.2 切莖接種法

材料處理和種植與1.3.1相同。

切莖接種：供試品種6個(gè)月株齡時(shí)，在陰天的傍晚用滅菌鋒利切刀（或枝剪）把供試材料植株地上部分沿土表快速切去，再用移液槍將 100 μL甘蔗白葉病植原體病原接種液滴入蔗株根部切口上，每個(gè)品種接種20株，遮光24 h。接種后繼續(xù)置于20～30℃抗病蟲鑒定防蟲溫室中培養(yǎng)。

病情調(diào)查：接種種植20 d后，各供試品種標(biāo)記20株接種株，調(diào)查發(fā)病株率，以后每隔15 d調(diào)查1次，直至感病對(duì)照品種發(fā)病株率穩(wěn)定為止。記錄接種日期、出苗數(shù)、病害癥狀始現(xiàn)期、累計(jì)發(fā)病株數(shù)。

病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同1.3.1。

1.3.3 田間自然發(fā)病調(diào)查

于5月甘蔗白葉病發(fā)病穩(wěn)定后，對(duì)云南發(fā)病最重的耿馬芒翁蔗區(qū)各供試品種進(jìn)行田間自然發(fā)病調(diào)查。調(diào)查地塊各品種新植下種時(shí)間為當(dāng)年2月、收砍留養(yǎng)宿根時(shí)間為當(dāng)年2月，種植行距均為1 m，旱地，磚紅壤，pH 6.0，有機(jī)質(zhì)含量2.5%，肥力中等，水肥管理及甘蔗長勢均勻一致。各品種隨機(jī)選擇3塊地，每塊地隨機(jī)選擇3個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)連續(xù)調(diào)查100株，共300株，記錄發(fā)病株數(shù)。自然發(fā)病株率=（病株數(shù)/總調(diào)查株數(shù)）×100%。病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同13.1。

2 結(jié)果與分析

由表1可以看出，兩種接種方法10個(gè)供試主栽品種和1個(gè)感病、1個(gè)抗病對(duì)照品種發(fā)病株率略有差異，其抗病等級(jí)和抗病性結(jié)果完全一致;且兩種接種方法對(duì)各供試品種的抗性鑒定結(jié)果與田間自然發(fā)病情況相吻合，說明兩種接種方法鑒定結(jié)果均能真實(shí)反映甘蔗品種的自然抗感性。

種苗噴霧接種法：‘粵糖60號(hào)‘新臺(tái)糖25號(hào)‘盈育91-59‘粵糖93-159‘新臺(tái)糖22號(hào)‘云蔗86-161‘云蔗03-194‘新臺(tái)糖10號(hào)‘柳城05-136病害癥狀始現(xiàn)期分別為30、30、30、30、30、45、45、60、60 d;切莖接種法：‘粵糖60號(hào)‘新臺(tái)糖25號(hào)‘盈育91-59‘粵糖93-159‘新臺(tái)糖22號(hào)‘云蔗86-161‘云蔗03-194‘新臺(tái)糖10號(hào)‘柳城05-136‘云蔗05-51病害癥狀始現(xiàn)期分別為20、20、20、20、20、35、35、50、50、50 d。

根據(jù)各供試品種材料發(fā)病株率按1～5級(jí)分級(jí)進(jìn)行抗性水平分類，其中：‘粵糖60號(hào)‘新臺(tái)糖25號(hào)‘盈育91-59表現(xiàn)為5級(jí)高感，‘粵糖93-159‘新臺(tái)糖22號(hào)表現(xiàn)為4級(jí)感病，‘云蔗86-161表現(xiàn)為3級(jí)中抗，‘云蔗03-194‘新臺(tái)糖10號(hào)表現(xiàn)為2級(jí)抗病，‘柳城05-136‘云蔗05-51表現(xiàn)為1級(jí)高抗（表1）。

3 結(jié)論與討論

甘蔗白葉病是近年快速發(fā)展起來的植原體新病害，至今尚未建立甘蔗白葉病抗性鑒定方法[2]。如何準(zhǔn)確高效評(píng)價(jià)甘蔗品種的白葉病抗性是目前甘蔗育種研究者選育抗病品種面臨的一個(gè)技術(shù)瓶頸。為此，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所在前期調(diào)查研究基礎(chǔ)上，從甘蔗材料處理與種植、接種液配制、接種方式、病情調(diào)查、分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)制定等層面對(duì)甘蔗抗白葉病鑒定技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)性研究與探索，首次優(yōu)化創(chuàng)建了兩套簡便高效、致病性穩(wěn)定和規(guī)范實(shí)用的甘蔗白葉病抗性鑒定方法，即種苗噴霧接種法和生長期切莖接種法，為我國甘蔗抗白葉病育種提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。利用兩種鑒定方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)甘蔗優(yōu)異種質(zhì)資源、常用雜交親本及新品種（系）抗白葉病的快速、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)，將切實(shí)提高抗白葉病育種的可靠性和選育效率，對(duì)于抗白葉病種質(zhì)資源篩選和生產(chǎn)用種選擇具有重大意義和現(xiàn)實(shí)作用。

兩種接種方法各供試品種的抗性鑒定結(jié)果與田間自然發(fā)病情況相吻合[9， 12]，均能真實(shí)反映甘蔗品種材料的自然抗感性。種苗噴霧接種法通過病原接種液噴灑蔗種塑料薄膜包衣接種，具備和滿足甘蔗白葉病侵染發(fā)病生境條件，能直觀表現(xiàn)出甘蔗品種對(duì)甘蔗白葉病抗性水平。切莖接種法與自然傳播相似，鑒定結(jié)果更接近于田間自然感病結(jié)果，制造的傷口均勻，接種病原量一致，發(fā)病均勻。兩種接種方法接種液不用分離培養(yǎng)，直接從田間采集制備;接種方法快速簡便，可操作性強(qiáng);接種后甘蔗白葉病發(fā)病顯著、靈敏度高、重復(fù)性好，鑒定結(jié)果可靠。因此，方便對(duì)大批量材料進(jìn)行鑒定和篩選，為育種和生產(chǎn)部門提供更多更廣泛的抗病品種和抗源材料。

本研究通過兩種接種方法和田間自然發(fā)病調(diào)查，鑒定明確了10個(gè)主栽品種對(duì)甘蔗白葉病抗病性，其抗病性真實(shí)、可靠，可作為今后甘蔗抗白葉病鑒定標(biāo)準(zhǔn)品種。

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（責(zé)任編輯：田 喆）