大麥條紋花葉病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

王立杉 王海洋 錢云開 高飛 吳曦 王秀平 柳吉芹

摘要 大麥條紋花葉病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是我國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物。為提高大麥條紋花葉病毒檢測(cè)的靈敏度和特異性，縮短檢測(cè)周期，根據(jù)該病毒不同分離株外殼蛋白（coat protein， CP）基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，建立了BSMV的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，本檢測(cè)方法特異性強(qiáng)，對(duì)南方菜豆花葉病毒Southern bean mosaic virus（SBMV）、小麥線條花葉病毒W(wǎng)heat streak mosaic virus（WSMV）、玉米褪綠斑駁病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、煙草環(huán)斑病毒Tobacco ringspot virus（TRSV）、菜豆莢斑駁病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和番茄環(huán)斑病毒Tomato ringspot virus（ToRSV）6種病毒均無(wú)交叉擴(kuò)增;且檢測(cè)方法靈敏度高，對(duì)RNA模板的最低檢測(cè)限達(dá)到5×10-4 ng/μL，與雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（DAS-ELISA）和普通RT-PCR相比，本方法的靈敏度分別提高了10倍和100倍。此外，我們利用該方法對(duì)12批進(jìn)口大麥進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6批大麥中檢出大麥條紋花葉病毒，占比約50%?？傊狙芯拷⒌臒晒舛縋CR方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適合于BSMV的快速檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 大麥條紋花葉病毒; 熒光定量PCR; 大麥; RT-PCR; ELISA

中圖分類號(hào)： S 435.123

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.

2020388

Establishment and application of fluorescence quantitative PCR detection method for Barley stripe mosaic virus

WANG Lishan1，2， WANG Haiyang2， QIAN Yunkai2， GAO Fei2， WU Xi2， WANG Xiuping1， LIU Jiqin2*

（1. Hebei Normal University of Science and Technology， Qinhuangdao 066004， China;

2. Qinhuangdao Custom Technical Center， Qinhuangdao 066004， China）

Abstract

Barley stripe mosaic virus （BSMV） is a quarantine pest in China. In order to improve the detection sensitivity， specificity and shorten the detection cycle， based on the conserved sequences in coat protein genes of different BSMV isolates， we established a real-time fluorescent RT-PCR detection method with specific primers and TaqMan probe. The results showed that this method could be only used for BSMV， but not Southern bean mosaic virus （SBMV）， Wheat streak mosaic virus （WSMV）， Maize chlorotic mottle virus （MCMV）， Tobacco ring spot virus （TRSV）， Bean pod mottle virus （BPMV） or Tomato ringspot virus （ToRSV）. The minimum detection limit of template RNA was 5×10-4 ng/μL. Compared with double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay （DAS-ELISA） or ordinary RT-PCR， the sensitivity was increased by 10 or 100 times， respectively. In addition， BSMV was detected in six of 12 batches of imported barley with this method. The real-time PCR method is a rapid， sensitive and highly specific method for BSMV.

Key words

Barley stripe mosaic virus; fluorescence quantitative PCR; barley; RT-PCR; ELISA

大麥條紋花葉病毒Barley stripe mosaic virus（BSMV）是大麥病毒屬Hordeivirus的代表成員[1]，主要侵染大麥、小麥、玉米和野燕麥等禾本科植物，也可侵染藜科和茄科植物。BSMV為無(wú)包膜、長(zhǎng)桿狀的病毒粒體，由外殼蛋白和3種正單鏈ssRNA（α，β和γ）組成[2-3]，該病毒因來源地不同而分化出不同的株系，且不同株系間存在著傳毒特性和寄主范圍的差異[4]。BSMV不同株系侵染寄主后，可引起葉片產(chǎn)生細(xì)線條至縱向條紋癥狀，不同寄主植物上產(chǎn)生淡綠色條紋、褪綠、壞死等，被害植株種子小而皺縮，并且嚴(yán)重矮化[5]。BSMV危害癥狀也因毒株、寄主品種和環(huán)境因素而不同，高溫（24～30℃）可使癥狀加重。1910年美國(guó)最先發(fā)現(xiàn)大麥條紋花葉病毒，1953年-1970年此病害在Montana地區(qū)造成的損失達(dá)3千萬(wàn)美元，1955年僅在Montana和North Dakota地區(qū)大麥就減產(chǎn)25%～30%[6-7]。目前大麥條紋花葉病毒病已成為一種世界性病害。由于種子能傳毒，隨著世界性種質(zhì)資源的流通，BSMV傳遍各大洲，加拿大、墨西哥、巴西、以色列、日本、巴基斯坦、羅馬尼亞、南斯拉夫、土耳其、英國(guó)、法國(guó)、丹麥、蘇聯(lián)以及澳大利亞等國(guó)都有分布[8]，一度嚴(yán)重影響世界大麥產(chǎn)量。該病毒還可通過親本傳給雜交后代，從而造成潛在威脅。1983年歐洲及地中海組織EPPO將大麥條紋花葉病毒列為A2類檢疫性有害生物[9]。據(jù)報(bào)道大麥條紋花葉病毒曾在我國(guó)新疆、山東、上海等地大面積流行[10-11]，并傳播到我國(guó)大部分地區(qū)，給我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了巨大損失。2004年孫現(xiàn)超等在北京郊區(qū)麥田中發(fā)現(xiàn)了大麥條紋花葉病毒，并證實(shí)該毒株與之前報(bào)道的新疆毒株在種子帶毒率和寄主侵染范圍方面存在差異[12]。2006 年- 2007年岳紅妮等在陜西韓城等地的小麥上也發(fā)現(xiàn)了大麥條紋花葉病毒[13]。鑒于該病毒的傳播特點(diǎn)及其對(duì)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的潛在高危害性，我國(guó)將其列為檢疫性有害生物。

目前有關(guān)大麥條紋花葉病毒的檢測(cè)主要有生物學(xué)、血清學(xué)、電鏡觀察、RT-PCR和免疫捕捉RT-PCR等方法[12，14-15]，但有些檢測(cè)方法靈敏度不夠高，檢測(cè)周期長(zhǎng)，而且可能會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性。在我國(guó)大麥條紋花葉病毒的截獲率一直較低，僅2018年寧波郵路口岸首次報(bào)道從疑似谷物粉末中截獲該病毒[16]。為了提高大麥條紋花葉病毒的檢出率，研究一種較為靈敏、準(zhǔn)確和快速的檢測(cè)方法迫在眉睫。目前實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用到植物病毒的快速檢測(cè)中。聞偉剛等[17-19]根據(jù)病毒外殼蛋白（coat protein， CP）基因序列設(shè)計(jì)引物探針，開發(fā)了玉米褪綠斑駁病毒Maize chlorotic mottle virus（MCMV）、菜豆莢斑駁病毒Bean pod mottle virus（BPMV）和小麥線條花葉病毒W(wǎng)heat streak mosaic virus（WSMV）的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，王佳瑩等[16]依據(jù)大麥條紋花葉病毒RNA2 beta C蛋白基因序列研發(fā)了一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法。

GenBank序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)大麥條紋花葉病毒的外殼蛋白基因在不同株系間的同源性較高，據(jù)此設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，研發(fā)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)，并將其應(yīng)用于秦皇島口岸進(jìn)口大麥的檢測(cè)中，以期為海關(guān)行政執(zhí)法部門提供技術(shù)保障，以便加強(qiáng)口岸檢疫監(jiān)管，嚴(yán)格執(zhí)行相關(guān)檢疫措施，進(jìn)一步防止該病毒的傳播蔓延。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

大麥條紋花葉病毒、小麥線條花葉病毒、玉米褪綠斑駁病毒、南方菜豆花葉病毒Southern bean mosaic virus （SBMV）、煙草環(huán)斑病毒Tobacco ringspot virus （TRSV）、菜豆莢斑駁病毒和番茄環(huán)斑病毒Tomato ringspot virus （ToRSV）的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自美國(guó)Agdia公司，樣品為凍干的葉片粉末。BSMV的雙抗體夾心酶聯(lián)（DAS-ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa公司。One Step RT-PCR Kit（RR055A）、One Step RT-PCR Kit（Perfect Real Time， RR064A）、熒光探針、引物均購(gòu)自TaKaRa公司。北京擎科新業(yè)生物技術(shù)公司對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序。所用儀器：普通PCR儀（ABI 9700）;實(shí)時(shí)熒光PCR儀（ABI Steponeplus）;Model 4001P電泳儀（Life Technologies）;RNA提取試劑盒（RN53）購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司。Multiskan Ascent酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）;Nu Genius凝膠成像儀（Syngene）。

1.2 DAS-ELISA

BSMV、WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、SBMV、ToRSV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品按要求加入2 mL樣品提取液，充分混勻后，取100 μL病毒原液用于RNA提取。

取100 μL BSMV病毒原液加入900 μL樣品提取液，充分混勻后，得到10-1倍稀釋的樣品，以此類推，分別得到10-2、10-3、10-4、10-5倍稀釋的病毒樣品。取100 μL不同稀釋濃度的BSMV病毒樣品用于DAS-ELISA靈敏度檢測(cè)，測(cè)試方法參照試劑盒說明書。

1.3 普通RT-PCR擴(kuò)增

RT-PCR擴(kuò)增體系參照One Step RT-PCR Kit說明書，反應(yīng)體系為：2×One Step Buffer 25 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL;RNase free ddH2O 20 μL;PrimeScript One Step Enzyme Mix 2 μL;RNA模板2 μL，總體積50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃ 30 min， 94℃ 2 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，36個(gè)循環(huán);72℃ 5 min;4℃保存。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.4 病毒RNA提取及實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增

取100 mg磨碎的大麥粉，按照RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR擴(kuò)增體系參照One Step RT-PCR Kit （Perfect Real Time）說明書，反應(yīng)體系為：RNase free ddH2O 5 μL;2×One Step RT-PCR Buffer III 10 μL;ROX reference dye （50×）0.4 μL;上下游引物（20 μmol/L）各0.6 μL;熒光探針（20 μmol/L）0.6 μL;PrimeScriptTM RT Enzyme Mix II 0.4 μL;TaKaRa EX TaqTM HS（5 U/μL）0.4 μL;RNA模板2 μL，總體積20 μL。每個(gè)樣品做3個(gè)平行，并設(shè)置陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和水空白對(duì)照。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 15 min，95℃ 10 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，共45個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光RT-PCR利用熒光定量PCR儀自帶的軟件進(jìn)行結(jié)果分析，根據(jù)陰性對(duì)照結(jié)果設(shè)定閾值線，擴(kuò)增曲線及樣品Ct值由軟件自動(dòng)生成。

1.5 引物與探針序列

引物與探針序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的特異性分析

提取BSMV、WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、ToRSV和SBMV陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品的RNA，利用BSMV引物和探針進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示僅BSMV出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct值為22.42，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序?yàn)锽SMV病毒序列，而WSMV、MCMV、BPMV、TRSV、ToRSV和SBMV均無(wú)擴(kuò)增（圖1），表明BSMV引物和探針具有較強(qiáng)的特異性。

2.2 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法的靈敏度分析

取100 μL BSMV病毒原液用于RNA提取，經(jīng)測(cè)定RNA濃度為5 ng/μL。將上述RNA依次進(jìn)行10-1～10-6梯度稀釋，每個(gè)稀釋度做3次重復(fù)，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，10-1～10-4稀釋度的Ct分別為26.53，30.61，33.83和38.91，10-5～10-6稀釋度均無(wú)擴(kuò)增（圖2）。因此實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法的最低檢測(cè)限為5×10-4 ng/μL。將上述RNA稀釋液用普通RT-PCR方法進(jìn)行驗(yàn)證，電泳結(jié)果表明僅10-1～10-2稀釋度有明顯的擴(kuò)增條帶，而10-3～10-5稀釋度均無(wú)擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序?yàn)锽SMV病毒序列（圖3）。因此與普通RT-PCR方法相比，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的靈敏度提高了100倍。

取100 μL BSMV病毒原液及10-1～10-5稀釋度的病毒樣品進(jìn)行DAS-ELISA檢測(cè)，每個(gè)樣品做2個(gè)平行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10-1～10-3稀釋度的病毒樣品OD405 > 2×陰性對(duì)照OD405，可以判定為陽(yáng)性樣品，而10-4～10-5稀釋度的反應(yīng)為陰性（表2）。因此與DAS-ELISA方法相比，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的靈敏度提高了10倍。

2.3 進(jìn)口大麥中的BSMV檢測(cè)

從秦皇島口岸共收集到12批澳大利亞、加拿大進(jìn)口的大麥樣品，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)6批樣品中檢出BSMV病毒，Ct在38～41，而另6批未檢出（圖4）。同時(shí)利用普通RT-PCR和DAS-ELISA方法對(duì)12批大麥樣品進(jìn)行分析，結(jié)果均未檢出BSMV病毒，表明實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法靈敏度更高。

3 討論

中國(guó)是主要的大麥進(jìn)口國(guó)。2017年-2019年，我國(guó)大麥進(jìn)口總量分別為886萬(wàn)、682萬(wàn)、593萬(wàn)t，秦皇島口岸大麥進(jìn)口量分別為39萬(wàn)、47萬(wàn)、44萬(wàn)t，約占全國(guó)進(jìn)口總量的6.2%。我國(guó)主要從加拿大、澳大利亞、芬蘭、烏克蘭、英國(guó)、阿根廷、烏拉圭、哈薩克斯坦和法國(guó)進(jìn)口大麥，秦皇島口岸主要從加拿大、澳大利亞、法國(guó)進(jìn)口大麥。由于大麥條紋花葉病毒在大部分大麥出口國(guó)均有發(fā)生與分布，且其自然寄主為我國(guó)的主要糧食作物，為防止大麥條紋花葉病毒的傳入，保護(hù)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全，根據(jù)有害生物風(fēng)險(xiǎn)分析結(jié)果，我國(guó)將該病毒列為進(jìn)口大麥中重點(diǎn)檢疫的有害生物。本文我們建立了大麥條紋花葉病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，與普通RT-PCR和DAS-ELISA方法相比，該檢測(cè)方法更靈敏、更快速。本方法的最低檢測(cè)限達(dá)到5×10-4 ng/μL，擴(kuò)增靶標(biāo)為外殼蛋白基因，而王佳瑩等報(bào)道的最低檢測(cè)限僅為0.02 ng/μL，擴(kuò)增靶標(biāo)為RNA2 beta C蛋白基因[16]，我們的檢測(cè)靈敏度與之相比提高了40倍。對(duì)12批加拿大、澳大利亞進(jìn)口大麥進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)6批檢出BSMV病毒，占比50%，說明BSMV病毒檢出率較高，可能之前的檢測(cè)方法由于靈敏度低存在漏檢的情況，或者國(guó)內(nèi)帶毒種子調(diào)運(yùn)監(jiān)管不嚴(yán)，從而造成BSMV病毒在我國(guó)的傳播擴(kuò)散。此外，檢出的大麥樣品中BSMV病毒Ct值在38～41，說明病毒含量較低，這是因?yàn)槲覀冎皇请S機(jī)取樣，未仔細(xì)挑選有癥狀的大麥，由于存在稀釋效應(yīng)，導(dǎo)致檢測(cè)Ct偏低。

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（責(zé)任編輯：田 喆）