藏紅花球莖腐爛病病原鑒定及防治藥劑室內(nèi)篩選

魏琳 段曉明 蘆光新 常建萍 周孝娟 馬海霞 祁鶴興

摘要 球莖腐爛病是嚴重影響藏紅花球莖品質(zhì)和柱頭產(chǎn)量的病害。為鑒定引起藏紅花球莖腐爛病的病原菌及篩選防治該病害的有效殺菌劑，本研究基于形態(tài)學特征、rDNA-ITS和TEF-1α序列分析，對青海省藏紅花球莖腐爛病的病原菌進行了鑒定，并利用菌絲生長速率法測定了10種殺菌劑對病原菌的抑菌作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，引起藏紅花球莖腐爛病的病原菌為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum和木賊鐮刀菌F.equiseti，其中尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢病原菌。室內(nèi)藥劑試驗表明70%甲基硫菌靈WP、 50%咯菌腈WP、 50%苯醚甲環(huán)唑SC和25%硅唑·咪鮮胺EW對兩種鐮刀菌均具有較好的抑制作用，EC50在0.574 0～1.808 6 mg/L之間，64%噁霜·錳鋅WP、 30%噁霉靈AS和45%石硫合劑WP對2種鐮刀菌的抑菌作用較差，EC50在2.134 4～7.915 3 mg/L之間。試驗結(jié)果為生產(chǎn)上合理選用殺菌劑防治藏紅花球莖腐爛病提供了科學依據(jù)。

關鍵詞 藏紅花球莖腐爛病; 尖孢鐮刀菌; 木賊鐮刀菌; 殺菌劑篩選

中圖分類號： S 435.672

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020521

Identification of saffron corm rot disease pathogen and laboratory screening of chemical agents

WEI Lin， DUAN Xiaoming， LU Guangxin， CHANG Jianping， ZHOU Xiaojuan， MA Haixia， QI Hexing*

（College of Agriculture and Animal Husbandry， Qinghai University， Xining 810016， China）

Abstract

Saffron corm rot disease has a strong impact on the quality of saffron corm and the yield of stigma. For identifying the pathogenic fungi of saffron corm rot disease and screening the effective fungicides for controlling this disease， this study aimed at identifying the pathogen based on morphological characteristics， rDNA-ITS and TEF-1α sequence analysis. The inhibition effects of ten fungicides on the pathogens were also determined by using mycelial growth rate method in this study. The results showed that Fusarium oxysporum and F.equiseti caused saffron corm rot disease， and F.oxysporum was the dominant pathogen. Laboratory fungicide experiments demonstrated that thiophanate-methyl 70% WP， fludioxonil 50% WP， difenoconazole 50% SC? and flusilazole·prochloraz 25% EW had a strong inhibition effect on F.oxysporum and F.equiseti， with an EC50 value of 0.574 0-1.808 6 mg/L. The inhibition effect of oxadixyl·mancozeb 64% WP， hymexazol 30% AS and lime sulphur 45% WP was worse， with an EC50 value of 2.134 4-7.915 3 mg/L. The results provide a scientific basis for using fungicides to control saffron corm rot disease in saffron production.

Key words

saffron corm rot disease; Fusarium oxysporum; Fusarium equiseti; screening of fungicide

藏紅花Crocus sativus L.又名番紅花，西紅花，屬鳶尾科Iridaceae，多年生，短日照草本植物[1]。主要分布在歐洲、地中海及中亞等地，最早在希臘人工栽培，漢朝時傳入我國西藏，因此有藏紅花、番紅花之稱[2]。藏紅花以柱頭入藥，是一種名貴的中藥材，具有祛瘀生新、活血通經(jīng)、涼血解毒、解郁安神等功效[3-5]。此外，藏紅花球莖又可做高檔觀賞花卉出售，因此，藏紅花具有較高的經(jīng)濟價值[6]。我國從80年代初在上海引種成功后，隨后在江蘇、浙江、江西、福建、北京、湖南、新疆、河南、江西、廣西和青海等22個省區(qū)市陸續(xù)引種[7-9]。目前藏紅花的主產(chǎn)區(qū)在上海、江蘇和浙江等地，并被作為高附加值經(jīng)濟作物進行種植，國內(nèi)多數(shù)地區(qū)種植藏紅花采用“大田培育大球莖，室內(nèi)培育大花蕊”的二段式栽培模式或者露地栽培模式[1，10]。青海省地處青藏高原，境內(nèi)各地區(qū)年平均氣溫在-5.1～9.0℃，在當?shù)夭捎迷O施栽培模式種植藏紅花。青海省主產(chǎn)區(qū)在西寧市大通縣、海東群科、海西德令哈、海東市樂都區(qū)等地[9]，2020年，青海省藏紅花栽培面積約為2 hm2。

近十幾年來市場對藏紅花的需求日益增加，人工栽培面積逐年上升，藏紅花球莖腐爛病已成為其生產(chǎn)上最嚴重的病害，在種球儲存期和種植期病球率高達30%～70%，造成了很大的經(jīng)濟損失，嚴重影響了球莖、柱頭的品質(zhì)和產(chǎn)量[11]。青海省因種植地氣候條件的不同，藏紅花受該病害的影響也有所不同，如年平均氣溫為7.6℃的西寧地區(qū)藏紅花發(fā)病較重，而年平均氣溫為-3.9℃的果洛地區(qū)藏紅花發(fā)病較輕。藏紅花球莖腐爛病由真菌引起，病原菌主要為巴西曲霉Aspergillus brasiliensis[12]、尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum[13-14]、茄病鐮刀菌F.solani[15]、叢花青霉Penicillium corymbiferum[16]和炭疽菌Anthracnose sp.等[6]，且該病害在秋季發(fā)病率最高。目前，國內(nèi)對上海、貴州和浙江等地的藏紅花球莖腐爛病有過報道[6，11-12]，但是對青海省藏紅花球莖腐爛病病原尚未進行過鑒定和報道。

本研究從青海省西寧市城北區(qū)二十里鋪鎮(zhèn)瑪可河林業(yè)局苗木培育基地采集藏紅花病種球進行病原菌的分離、鑒定和室內(nèi)藥劑防治效果測定。在明確病原菌種類的前提下，篩選出能有效抑制病原菌生長的高效殺菌劑，旨在為后續(xù)開展大田防治提供理論依據(jù)和基礎。

1 材料與方法

1.1 材料來源

2019年10月-12月從青海省西寧市城北區(qū)二十里鋪鎮(zhèn)瑪可河林業(yè)局苗木培育基地（101°45′13″E，36°43′43″N;海拔：2 314 m）采集苗期病種球，并及時帶回實驗室分離病原菌。

1.2 培養(yǎng)基配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）配制參照祁鶴興等[17]的方法;2%水瓊脂培養(yǎng)基（2%WA）：瓊脂20 g， 蒸餾水定容至1 L。CM固體培養(yǎng)基：酵母提取物6 g，酶水解干酪素3 g，酸水解干酪素3 g，蔗糖10 g溶于900 mL ddH2O中，混勻后定容至1 L，121℃高壓蒸汽滅菌20 min，備用。

1.3 殺菌劑

99%高錳酸鉀顆粒劑（GR），白銀良友化學試劑有限公司;64%噁霜·錳鋅可濕性粉劑（WP），先正達作物保護有限公司;50%多菌靈可濕性粉劑（WP），四川潤爾科技有限公司;25%溴菌腈可濕性粉劑（WP），江蘇托球農(nóng)化股份有限公司;70%甲基硫菌靈可濕性粉劑（WP），濟南泰禾化工有限公司;50%咯菌腈可濕性粉劑（WP），先正達作物保護有限公司;30%噁霉靈水劑（AS），江西禾益化工股份有限公司;50%苯醚甲環(huán)唑懸浮劑（SC），江蘇云帆化工有限公司;25%硅唑·咪鮮胺水乳劑（EW），上海滬聯(lián)生物藥業(yè)股份有限公司;45%石硫合劑可濕性粉劑（WP），河北雙吉化工有限公司。

1.4 病原菌的分離、純化與保存

在病種球病健交界處切取小塊組織，置于35%次氯酸鈉溶液中消毒1 min，然后用無菌水沖洗3次，用無菌濾紙吸干，放在含0.1%氨芐青霉素的水瓊脂平板上，置于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h。用無菌水將長出的分生孢子洗下配成濃度為2×104個/mL 的孢子懸浮液，吸取200 μL孢子懸浮液于2%水瓊脂平板上涂抹均勻，在超凈工作臺中吹干，于26℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至孢子萌發(fā)，在體視顯微鏡下挑取萌發(fā)的單個分生孢子至PDA平板。將分離到的單孢菌株采用濾紙片保存法[18]，置于-20℃冰箱長期保存。

1.5 病原菌的分類鑒定

1.5.1 菌株形態(tài)學鑒定

將分離得到的單孢菌株接種于CM平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)7 d，挑取分生孢子制成臨時玻片，在光學顯微鏡（40×）下觀察分生孢子形態(tài)。菌株在CM平板上生長5 d后，用直徑0.5 cm的打孔器打取菌餅放置在CM平板中。每株菌株3個重復，并且每皿培養(yǎng)基的厚度保持一致。放置于25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 d后觀察菌落形態(tài)。

1.5.2 菌株基因組DNA的提取

采用CATB法提取基因組DNA[19]，步驟如下：1）刮取在PDA平板上培養(yǎng)了5 d的病原菌菌落氣生菌絲，置于離心管中，用細胞破碎儀破碎細胞。2）在離心管中加入 2×CTAB抽提液600 μL，混合均勻，65℃孵育30 min，每隔10 min顛倒混勻1次。3）孵育完成后，取出離心管，待其冷卻至室溫后，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），充分混勻后，12 000 r/min、4℃離心15 min。4）吸取500 μL上清液于1.5 mL滅菌離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），充分混勻后12 000 r/min、4℃、離心15 min。之后再吸取400 μL上清重復抽提1次。5）吸取上清300 μL，加入0.6倍體積的異丙醇，-20℃沉淀30 min。6）12 000 r/min、4℃、離心15 min。7）棄上清，70%乙醇洗沉淀2次，烘干，用25 μL TE/RNase溶解，-20℃保存。

1.5.3 菌株序列分析

rDNA-ITS擴增引物為ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）[20]，TEF-1α基因擴增引物：EF-1（5′-ATGGGTAAGGA（A/G）GACAAGAC-3′）和EF-2（5′-GGA（G/A）GTACCAGT（G/C）ATCATGTT-3′）[21-22]。反應體系（25 μL）：2×PCR Mix（北京天根生物科技）12.5 μL;上下游引物各（25 pmol/L）1.0 μL，;模板DNA（30 μg/L）1.0 μL;雙蒸水補足至25 μL。PCR反應程序：95℃，5 min;95℃，1 min，55℃，1 min，72℃，2 min，30個循環(huán);72℃，10 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測產(chǎn)物，PCR擴增產(chǎn)物純化后由北京擎科新業(yè)生物技術公司進行雙向測序。使用軟件 MAFFT對正反向序列進行拼接，拼接序列在 MEGA 6.0.6 軟件進行校正。使用 PAUP* v. 4.0 alpha 軟件構(gòu)建最大簡約樹，采用啟發(fā)式算法（heuristic searches）進行運算。以總狀毛霉Mucor racemosus （GenBank 登錄號：MT530270和AH001352） 作為外群，運算重復 1 000次。參照菌株序列下載自NCBI 數(shù)據(jù)庫。13株菌株rDNA-ITS序列GenBank登錄號為MT997878～MT997890，12株菌株TEF-1α基因登錄號為MW009678～MW009689。

1.6 病原菌回接試驗

將菌株接種至PDA培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng) 7 d，用0.025% Tween 20溶液洗下分生孢子并制備濃度為1×105個/mL的孢子懸浮液。在塑料盆底盛放一定量的水，中間放置間隔板，在間隔板上放置健康藏紅花種球，孢子懸浮液點接于球莖表面，共4點每點接種10 μL，以接種無菌水為對照。置于25℃培養(yǎng)箱黑暗保濕培養(yǎng)24 h后進行光照培養(yǎng)。接種7 d后觀察種球發(fā)病情況。

1.7 殺菌劑的抑菌作用測定

采用菌絲生長抑制法。用分析天平準確稱量殺菌劑，分別放入5 mL EP管中，加入一定體積的二甲基亞砜（DMSO），振蕩至藥劑充分溶解，配制成105 mg/L的母液，4℃黑暗保存?zhèn)溆?。之后用DMSO稀釋，制成系列濃度梯度藥液，加入CM培養(yǎng)基中，充分搖勻，制成含藥平板（9 cm），以加入等量DMSO的CM培養(yǎng)基為對照。99%高錳酸鉀GR設置7個濃度梯度，分別為：05、1、2、4、8、16、32 mg/L;25%溴菌腈WP、50%多菌靈WP、50%咯菌腈WP和45%石硫合劑WP設置6個濃度梯度，分別為：0.4、0.9、1.6、3.2、6.4 mg/L和12.8 mg/L;64%噁霜·錳鋅WP和30%噁霉靈AS設置6個濃度梯度，分別為：0.5、1、2、4、8 mg/L和16 mg/L;70%甲基硫菌靈WP設置7個濃度梯度，分別為：0.3、09、1.2、2.4、4.8、9.6 mg/L和19.2 mg/L：50%苯醚甲環(huán)唑SC和25%硅唑·咪鮮胺EW設置7個濃度梯度，分別為：0.4、0.9、1.6、3.2、6.4、128 mg/L 和25.6 mg/L。

用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取直徑5 mm的菌餅，接種到含藥平板中央，每處理3次重復，25℃黑暗培養(yǎng)6 d后，用十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。

菌絲生長抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

使用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件，求得b值±標準誤差、EC50、95%置信限、卡方值。

2 結(jié)果與分析

2.1 藏紅花球莖腐爛病病原鑒定

從采集的藏紅花球莖腐爛病病種球上共分離得到26株菌株，分離菌株經(jīng)柯赫氏法則驗證，對藏紅花球莖均有致病性（圖1）。經(jīng)形態(tài)學鑒定26株病原菌均為鐮刀菌，菌絲白色至淡粉紅色。有的菌株菌落呈輪紋狀，如菌株ZHH-7和ZHH-22，且菌株ZHH-22菌絲不發(fā)達，生長較慢（ZHH-22平均生長速率為127 cm/d，ZHH-7為1.41 cm/d）（圖2）。25株菌株的大型分生孢子略彎曲，但菌株ZHH-WZW-2的大型分生孢子與其他菌株相比明顯不同，該菌株大型分生孢子彎曲弧度較大，且氣生菌絲呈棉絮狀（圖2）。

根據(jù)形態(tài)特征分析結(jié)果，選擇13株代表病原菌進行分子生物學鑒定，將所測得代表菌株的rDNA-ITS序列和TEF-1α基因序列在GenBank中與已知序列進行BLAST相似性比較分析，以已在NCBI公布序列的菌株為參考菌株，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定菌株的分類地位。

基于菌株rDNA-ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3a），發(fā)現(xiàn)菌株ZHH-WZW-2與木賊鐮刀菌F. equiseti在同一發(fā)育分支上，親緣關系最近，rDNA-ITS序列相似性為99.21%。ZHH-1、ZHH-7和ZHH-22等12株菌株與尖孢鐮刀菌F.oxysporum聚為1個大分支，rDNA-ITS序列相似性均大于99%?；诰闠EF-1α基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3b），同樣發(fā)現(xiàn)菌株ZHH-WZW-2與木賊鐮刀菌在同一發(fā)育分支上，親緣關系最近，TEF-1α基因序列相似性為99.69%。ZHH-1、ZHH-7和ZHH-22等11株菌株與尖孢鐮刀菌聚為1個分支，親緣關系最近，序列相似性均大于99%。

2.2 病原菌對殺菌劑的敏感性

通過測定10種殺菌劑對尖孢鐮刀菌ZHH-1和木賊鐮刀菌ZHH-WZW-2菌絲生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其中4種殺菌劑70%甲基硫菌靈WP、50%咯菌腈WP、50%苯醚甲環(huán)唑SC和25%硅唑·咪鮮胺EW對2種鐮刀菌均具有很強的抑制作用，EC50在0.574 0～1.808 6 mg/L之間。其中50%苯醚甲環(huán)唑SC對尖孢鐮刀菌的EC50最低。64%噁霜·錳鋅WP、30%噁霉靈AS和45%石硫合劑WP對2種鐮刀菌的抑菌作用較差，EC50在2.134 4～7.915 3 mg/L之間。同一種殺菌劑對不同鐮刀菌的抑制作用存在差異，99%高錳酸鉀GR、25%溴菌腈WP、50%多菌靈WP、50%苯醚甲環(huán)唑SC、25%硅唑·咪鮮胺EW和45%石硫合劑WP對尖孢鐮刀菌的抑制作用強于對木賊鐮刀菌，即尖孢鐮刀菌比木賊鐮刀菌對這6種殺菌劑更為敏感。99%高錳酸鉀GR、25%溴菌腈WP和50%多菌靈WP對尖孢鐮刀菌都具有一定的抑制作用，但是這3種殺菌劑分別在0.5～320 mg/L、0.4～12.8 mg/L和0.4～12.8 mg/L供試濃度范圍內(nèi)對木賊鐮刀菌沒有抑制作用。64%噁霜·錳鋅WP、70%甲基硫菌靈WP、50%咯菌腈WP和30%噁霉靈AS對木賊鐮刀菌的抑制作用強于對尖孢鐮刀菌，即木賊鐮刀菌比尖孢鐮刀菌對這4種殺菌劑更為敏感（表1）。

3 結(jié)論與討論

鐮刀菌屬真菌可引起多種藥用植物根部病害，國內(nèi)外已有研究報道，引起藏紅花根腐病的鐮刀菌包括尖孢鐮刀菌和茄病鐮刀菌[13-15]，本研究經(jīng)形態(tài)學和系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，青海地區(qū)引起藏紅花球莖腐爛病的鐮刀菌有尖孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌，其中尖孢鐮刀菌為優(yōu)勢病原菌?，斂珊恿謽I(yè)局苗木培育基地藏紅花種球引種自河南，病原菌有可能來源于產(chǎn)地，也有可能是土著病原菌。

藏紅花染色體是三倍體，花粉敗育高，開花后不結(jié)種子，生產(chǎn)上采用無性繁殖方法，且繁殖率較高。原產(chǎn)地一般采用種球連續(xù)多年重復種植方式，11月中旬露地開花[23-24]。在青海多數(shù)地區(qū)采用設施栽培模式種植藏紅花，枯黃期（4月-5月）挖出種球在室內(nèi)通風干燥保存，9月初陸續(xù)開始種植。

本研究通過測定10種殺菌劑對尖孢鐮刀菌和木賊鐮刀菌代表菌株菌絲生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)不同殺菌劑對這2種鐮刀菌的抑制作用有所不同。如25%溴菌腈WP和50%多菌靈WP對尖孢鐮刀菌有一定的抑制作用，但是在供試濃度范圍內(nèi)對木賊鐮刀菌沒有抑制作用。

張國輝等對貴州省藏紅花球莖腐爛病病原菌鐮刀菌進行室內(nèi)藥劑防治時，發(fā)現(xiàn)多菌靈的防治效果最好[6]。趙麗娟對上海藏紅花致病菌尖孢鐮刀菌進行藥劑防治，發(fā)現(xiàn)溴菌腈的抑制效果最好[12]。本試驗結(jié)果與文獻報道結(jié)果有所差異，可能與菌株個體差異和地域差異有關。本研究還發(fā)現(xiàn)甲基硫菌靈、咯菌腈、苯醚甲環(huán)唑和硅唑·咪鮮胺對2種鐮刀菌的抑制作用較好，周雙等對浙江省藏紅花腐爛病病原尖孢鐮刀菌進行室內(nèi)藥劑防治，也發(fā)現(xiàn)咯菌腈對病原菌的抑制作用較好[11]。同一藥劑對不同鐮刀菌菌株敏感性差異極大的情況也有過類似報道，如許媛等通過測定不同殺菌劑對34株草莓枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌的抑制作用發(fā)現(xiàn)，咪鮮胺EC50范圍為0.001 1～0.128 2 mg/L[25]。本試驗結(jié)果為藏紅花球莖腐爛病的化學防治提供了候選藥劑，也為藥劑的輪換使用提供了科學依據(jù)。

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（責任編輯：楊明麗）