miR1320表達水平與水稻白葉枯病抗性的關(guān)聯(lián)性分析

胡積祥 朱秀梅 余超 楊鳳環(huán) 王繼春 張立新 陳華民

摘要 水稻白葉枯病是由稻黃單胞菌水稻致病變種Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）引起的一種細菌性病害，嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。miR1320是水稻與Xoo互作中重要的調(diào)控因子。本研究在接種Xoo后的0、12、24 h分別檢測了10個粳稻和8個秈稻品種中miR1320的積累和4個防衛(wèi)基因的轉(zhuǎn)錄水平，測量了各品種葉片上的病斑長度，分析了miR1320的積累和防衛(wèi)基因的表達與水稻白葉枯病抗性之間的相關(guān)性。結(jié)果表明：接種Xoo后，miR1320的表達模式在不同品種中有所不同;秈稻和粳稻對白葉枯病的抗性分別與接種后24 h和12 h時miR1320的表達量呈緊密負相關(guān);且相對于防衛(wèi)基因，miR1320更能反映品種間的抗病性。因此，miR1320可應用于評估水稻品種對白葉枯病的抗性，輔助水稻抗病種質(zhì)的鑒定。

關(guān)鍵詞 miR1320; 水稻; 白葉枯病; 抗性; 表達

中圖分類號： S 435.11

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020354

Analysis of the correlation between the expression level of miR1320 and resistance to bacterial blight in rice

HU Jixiang1， ZHU Xiumei1， YU Chao1， YANG Fenghuan1，

WANG Jichun2， ZHANG Lixin3， CHEN Huamin1*

（1. State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests， Institute of Plant Protection， Chinese

Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China; 2. Institute of Plant Protection， Jilin Academy

of Agricultural Sciences， Gongzhuling 136100， China; 3.College of Plant Protection，

Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract

Rice bacterial blight （BB）， caused by Xanthomonas oryzae pv. oryzae （Xoo）， is a serious bacterial disease and significantly reduces the rice yield and quality in the field. miR1320 is an important regulatory factor in the interaction between rice （Oryzae sativa） and Xoo. In this study， the expression levels of miR1320 and four defense genes were detected in 10? japonica rice （Oryzae sativa subsp. geng） and eight indica rice （Oryzae sativa subsp. xian） varieties at 0、12、24 h time points after inoculation with Xoo. Then the leaf lesion length was measured on the 14th day after inoculation with Xoo. Finally， the correlations between lesion length and either miR1320 or defense genes were analyzed. The results suggested that the different rice varieties displayed different patterns in response to Xoo infection， and the resistance to BB in japonica rice and indica rice was closely and negatively correlated with the expression levels of miR1320 at 24 hpi （hours post inoculation） and 12 hpi， respectively. Moreover， compared with defense genes， miR1320 was a better indicator of the resistance to BB in different rice varieties. In conclusion， miR1320 can be applied to assess the resistance of rice varieties to BB and assist the identification of rice resistant germplasms.

Key words

miR1320; rice; bacterial blight; resistance; expression

水稻白葉枯病是由稻黃單胞菌水稻致病變種Xanthomonas oryzae pv. oryzae（Xoo）侵染引起的一種細菌病害，對水稻產(chǎn)量影響輕的減產(chǎn)20%～30%，重的可達50%～60%，甚至顆粒無收。病株的稻谷加工后碎米多，嚴重降低稻米的品質(zhì)[1-2]。在生產(chǎn)上，盡管噴施殺菌劑能在一定程度上控制病害的發(fā)生，但殺菌劑的使用嚴重污染了當?shù)氐沫h(huán)境，大大增加了水稻的生產(chǎn)成本。因此，種植抗病品種是防治水稻白葉枯病最經(jīng)濟有效且綠色環(huán)保的策略[3]，而作物抗病性鑒定是作物抗病育種的重要基礎性環(huán)節(jié)，快速的鑒定手段可以提高育種效率、加快育種進度。

miRNA是生物體內(nèi)源性存在的、長度為21～24個核苷酸的單鏈RNA小分子[4]，廣泛存在于動物、植物和病毒中，其5′端被磷酸化，3′端帶有羥基，本身不能編碼氨基酸，但可與Argonaute （AGO）蛋白一起形成RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex， RISC），抑制靶基因mRNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯，從而實現(xiàn)對靶基因的調(diào)控[5]。

隨著對miRNA的深入研究，人們發(fā)現(xiàn)植物miRNA在抗病方面起著重要的調(diào)控作用。植物一旦感知病原物的入侵，就會迅速改變miRNA的表達水平來啟動某些抗病信號和途徑，增強自身的抵抗力[6-7]。其中，一些miRNAs的變化具有明顯的病原特異性。甜橙miR399和miR159在感染黃龍病10周后的各品種中表達量至少增加3倍，而在感染頑固病（病原為柑橘螺原體Spiroplasma citri）的植株中卻幾乎沒有變化。因此利用miR399和miR159在表達上的變化特征可以區(qū)分甜橙中黃龍病和頑固病這兩種癥狀易混淆的病害[8]。而另一些植物miRNAs表達水平的變化具有品種特異性，且在抗病品種中的差異表達更明顯，暗示它們與品種抗病屬性存在緊密關(guān)聯(lián)。目前，這類miRNA在水稻[9]、玉米[10]和小麥[11]等多種作物中已有報道，但它們與品種抗病性之間的關(guān)系尚未深入研究。

miR1320是水稻特有的miRNAs之一[12]。在接種稻瘟病菌后，水稻中的miR1320持續(xù)上調(diào)表達，24 h后增幅達3倍以上[9，13]，且在抗病品種‘C101LAC中的表達量是感病品種‘CO39中的2倍以上[9]。通過高通量測序和熒光定量PCR技術(shù)人們發(fā)現(xiàn)水稻被Xoo侵染后miR1320的表達量也至少上調(diào)2倍[14-15]。但這些都是基于1～2個水稻品種上的研究結(jié)果，而在品種群體水平上研究miR1320的表達模式將有助于全面認識其與品種抗病性之間的聯(lián)系。為此，本研究測定了10個粳稻和8個秈稻品種在接種Xoo后的病斑長度和miR1320的積累以及4個防衛(wèi)基因的表達水平，并分析了miR1320和4個防衛(wèi)基因在Xoo脅迫條件下的表達特征與品種抗病性之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 植物材料和菌株

供試水稻材料包括10個粳稻品種和8個秈稻品種。粳稻品種為‘日本晴和9個東北三省的粳型生產(chǎn)品種‘吉粳816‘吉粳88‘東稻9‘九稻60‘稻花香2號‘吉農(nóng)大735‘通禾899‘遼粳5號和‘鹽豐47，其中‘稻花香2號由東北農(nóng)業(yè)大學張忠臣博士提供;秈稻品種為‘IR24及國際水稻研究所以‘IR24為遺傳背景育成的分別含有水稻白葉枯病抗性基因Xa2、Xa3、Xa4、xa5、xa13、Xa14和Xa21的7個近等基因系‘IRBB2‘IRBB3‘IRBB4‘IRBB5‘IRBB13‘IRBB14和‘IRBB21。試驗菌株為Xoo菌株P(guān)XO99A。

1.2 試劑和儀器

Invitrogen公司的TRIzol試劑（15596026）;Promega公司的去基因組DNA試劑盒（M6101）;北京全式金生物技術(shù)有限公司的miRNA cDNA合成試劑盒（AT351-01）;康潤生物公司的StarScript II cDNA第一鏈合成預混試劑（A224-02）和實時熒光定量PCR試劑盒（A314-05）。

試驗中所用引物均委托北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。試驗儀器包括實時定量PCR儀ABI 7500和超微量分光光度計Thermo Nanodrop 2000。

1.3 試驗方法

1.3.1 水稻種植

水稻種子在37℃培養(yǎng)箱中浸種催芽，幼芽長至1 cm時移至育苗蛭石中生長;待其5 cm高時再移植于4.8 L圓形塑料桶中（5株/桶），置溫室生長2個月（包括發(fā)芽天數(shù)），供試。

1.3.2 抗病性鑒定

利用剪葉接種法測定水稻抗病性：將保存于-80℃的Xoo菌株P(guān)XO99A在PSA（蔗糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，谷氨酸1 g/L，瓊脂粉15 g/L pH 7.0）平板上活化;挑取單菌落到液體M210（蔗糖5 g/L，酶水解干酪素8 g/L，MgSO4·7H2O 0.3 g/L，酵母粉4 g/L，K2HPO4·3H2O 3 g/L，pH 7.0）中，200 r/min振蕩培養(yǎng);24 h后按1∶100比例轉(zhuǎn)接1次;待菌液OD600為0.8左右時，5 000 r/min 離心5 min收集菌體;用滅菌ddH2O洗滌1次并重懸菌液至OD600為0.8;滅菌剪刀浸沾菌液后，在離葉尖1～2 cm處剪葉;14 d后測量葉片病斑長度。

1.3.3 miR1320和防衛(wèi)基因OsPR1a、PR1b、OsPR10a和OsWRKY45表達量測定

水稻總RNA提?。好總€品種分別在接種Xoo后0、12 h和24 h時剪取至少3片不同植株上的接種葉尖，立即放入液氮中，然后在研磨儀上1 500 r/min到800 r/min降速劇烈振蕩1 min，將葉片研磨成粉末;加入1 mL TRIzol，參照說明書提取葉片總RNA。

總RNA中殘存基因組DNA的去除：反應體系為100 μL，其中RNA為10 μg，DNaseⅠ（1 U/μL） 10 μL， 于37℃孵育45 min;加入20 μL氯仿后用乙醇沉淀法純化RNA。

cDNA制備和熒光定量PCR：參照說明書進行。在10 μL體系中，將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，10倍稀釋后取5 μL作為PCR的模板。PCR采用20 μL體系，反應程序均設為95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 35 s，40個循環(huán)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

防衛(wèi)基因和miR1320的表達量按照2-ΔΔCt法計算，它們的內(nèi)參基因分別為Actin1和OsU6。

ΔCt=目的基因的Ct-內(nèi)參基因的Ct;

ΔΔCt=接種后x h測得的ΔCt-接種后0 h測得的ΔCt 。

采用Excel 2016和SPSS 20軟件對測得的病斑長度和熒光定量數(shù)據(jù)進行整理和統(tǒng)計分析，用Waller-Duncan （k比率t測驗）法比較差異顯著性（P<0.05）。最后，利用GraphPadPrism 7軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻白葉枯病抗性的測定

水稻白葉枯病抗性的測定結(jié)果表明，供試水稻品種對Xoo的抗性存在顯著差異。在秈稻中，IRBB系列葉片上的病斑長度均顯著短于對照品種‘IR24，其中‘IRBB21葉片上的病斑長度最短（圖1a和1c）;而在粳稻中，9個東北地區(qū)生產(chǎn)品種葉片上的病斑長度均長于‘日本晴，其中病斑最長的品種為‘鹽豐47，其次為‘東稻9和‘稻花香2號（圖1b和1d）。

2.2 miR1320表達量的測定

接種Xoo后水稻中miR1320的表達量隨接種時間的動態(tài)變化因品種而異，在‘IRBB13‘日本晴‘九稻60‘吉粳816‘通禾889和‘吉粳88中先升后降，在‘IR24‘IRBB4和‘吉農(nóng)大735中逐漸降低，在‘IRBB2‘IRBB5‘IRBB14‘IRBB21和‘稻花香2號中先降后平穩(wěn)，在‘鹽豐47中先降后升，而在‘東稻9和‘遼粳5號中基本不變。

品種間miR1320的表達水平有顯著差異。秈稻在接種Xoo后，miR1320整體上下調(diào)表達，在‘IR24中的接種后0、12、24 h均較低表達，尤其是在接種后24 h時表達水平最低，顯著低于其他IRBB系列水稻（圖2a）。而粳稻在接種Xoo后，miR1320在一些品種中略呈上調(diào)表達，而在另一些品種中呈下調(diào)表達趨勢;在接種后12 h，miR1320的表達水平在‘日本晴中最高，在‘鹽豐47中最低。

2.3 防衛(wèi)基因OsPR1a、PR1b、OsPR10a和OsWRKY45轉(zhuǎn)錄水平的測定

各水稻品種中的4個防衛(wèi)基因在接種后0、12、24 h的表達水平如圖3所示。在秈稻中，接種后0 h時4個防衛(wèi)基因在多數(shù)IRBB系列品種中的表達水平顯著高于對照品種‘IR24，只在個別品種中存在

例外;接種后12 h時PR1b的表達水平在‘IR24中最低;接種后24 h時4個防衛(wèi)基因的表達水平均在‘IRBB3中最高，且PR1b和OsPR10a的表達水平在‘IR24中最低。在粳稻中，接種后12 h時，OsPR10a的表達水平在‘通禾889中最高，其次是‘日本晴，而在‘稻花香2號中表達量最低;接種后24 h時，OsPR1a在‘日本晴中的表達量最高，而在‘通禾889中最低。

2.4 miR1320和4個防衛(wèi)基因的表達量與抗病性之間的相關(guān)性分析

作散點圖分析防衛(wèi)基因表達量（x）與葉片病斑長度（y）之間的關(guān)系，結(jié)果表明，4個防衛(wèi)基因中僅OsPR1a、PR1b和OsPR10a的表達量在特定條件下與葉片病斑長度存在較好的負相關(guān)性。在秈稻中，接種后12 h時PR1b的表達量和葉片病斑長度呈一定程度的負相關(guān)（圖4d），皮爾森相關(guān)系數(shù)r為-043;接種后24 h時，除‘IRBB3外，各品種中PR1b和OsPR10a對應的散點緊密地聚集在各自擬合直線附近（圖4a）且r分別為-0.446和-0.683。而在粳稻（圖4b）中，接種后24 h時僅OsPR1a對應的散點有類似的情形，r為-0.498。

同樣的方法分析miR1320的表達量與葉片病斑長度之間的關(guān)系，結(jié)果表明，在特定條件下無論是在除‘IRBB3外的秈稻（圖4c）還是粳稻（圖4d）中，它們構(gòu)成的散點均緊密地聚集在擬合直線附近，且它們具有較好的負相關(guān)性。粳稻接種后12 h時，miR1320的表達量與葉片病斑長度之間存在顯著負相關(guān)性，其中r為-0.728，P值為0.017;8個品種（‘日本晴‘東稻9‘九稻60‘吉粳816‘吉粳88‘稻花香2號‘遼粳5號和‘鹽豐47）的線性公式為y=-0.107 4x+2.761 4，其中R2=0.875 9。而秈稻（不含‘IRRB3）接種后24 h時，它們也具有良好的負相關(guān)性，r為-0.512。

3 討論

植物一旦感知病原菌的入侵，就會迅速改變一些miRNAs的表達來啟動某些抗病信號和途徑，增強自身的抵抗力。有學者以1～2個水稻品種為研究對象，接種稻瘟菌[9，13]或Xoo[14-15]，發(fā)現(xiàn)miR1320持續(xù)上調(diào)表達;而本研究分析了10個粳稻品種和8個秈稻品種中的miR1320在接種Xoo后的表達水平，結(jié)果表明miR1320的表達模式因品種而異，即在品種群體水平上具有多樣性，如在‘IRBB13‘日本晴和‘九稻60中miR1320的表達水平先升后降，而在‘鹽豐47中先降后升。因此，本研究在接種Xoo后對多品種中miR1320的表達模式進行了分析，深化和豐富了對miR1320響應病菌侵染的認識，有助于揭示miR1320的抗病機制。

研究表明，在病菌脅迫下，包括miR1320在內(nèi)的許多miRNAs在抗病品種中的表達變化比感病品種中的更明顯[9]。本研究的結(jié)果則進一步表明，粳稻對白葉枯病的抗性與其接種后12 h時miR1320的積累顯著正相關(guān);而秈稻（不包括IRRB3）對白葉枯病的抗性與其接種后24 h時miR1320的積累之間也有良好的相關(guān)性，皮爾遜相關(guān)系數(shù)r為0.512。盡管秈稻IRBB系列品種分別攜帶不同的白葉枯病抗性基因，而這些抗性基因又來自不同的遺傳背景（如Xa21源自西非長藥野生稻），但在接種Xoo后24 h時所有供試的IRBB系列品種中的miR1320的表達水平均比背景品種‘IR24中的高，這與它們的抗病性一致。因此，miR1320可輔助水稻對白葉枯病抗性的評價。

植物防衛(wèi)基因一旦感知病原菌浸染就會立即啟動表達以阻止病菌的進一步侵害，相比感病品種，其在抗病品種中的表達速度更快和強度更高[21]。因此，防衛(wèi)基因在時空上的表達特征一定程度上反映了植物抗病性的強弱。Vergne等分析了23個水稻品種中21個防衛(wèi)基因的表達模式，結(jié)果表明在稻瘟病菌侵染前的防衛(wèi)基因的表達水平與水稻中的“部分抗病性（partial resistance）”極度相關(guān)[22];而Liu等進一步指出在特定的環(huán)境背景下一些特定的防衛(wèi)基因可以預測品種的抗病性[23]。在本試驗中，4個防衛(wèi)基因的表達水平與各秈稻品種中的抗病性也存在一定的相關(guān)性;但這種相關(guān)性比品種抗病性和miR1320之間的相關(guān)性弱，尤其是在粳稻中。因此，相對于防衛(wèi)基因而言，miR1320可能更適合輔助評估水稻品種的抗病性。

抗性鑒定在抗病育種中是一項基礎性工作，鑒定結(jié)果易受環(huán)境等因素的影響，鑒定過程費時費力[24]。挖掘和利用更多類似于miR1320的miRNAs來輔助比較育種材料的抗病性可在一定程度上克服以上局限性。

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（責任編輯：楊明麗）