野生藥用植物內(nèi)生真菌的分離及拮抗菌株篩選

楊帆 劉春來 劉亮 王爽 蔣希峰 李敏 曹大為 李新民

摘要 為挖掘生防新資源，采用組織分離法從21種野生藥用植物不同組織部位分離純化內(nèi)生真菌，以6種植物病原菌為靶標(biāo)菌篩選拮抗菌株，并根據(jù)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，在此基礎(chǔ)上研究了高效拮抗菌株對(duì)靶標(biāo)菌菌絲生長及孢子萌發(fā)的影響。結(jié)果表明：從分離純化的478株內(nèi)生真菌中篩選出11株高活性拮抗菌株，分屬于青霉屬Penicillium、平臍蠕孢屬Bipolaris、棘殼孢屬Pyrenochaeta、鐮孢屬Fusarium、粒毛盤菌屬Lachnum、墊殼孢屬Coniella和Neonectria 7個(gè)屬，其中青霉屬占比最高，達(dá)36.36%。平皿對(duì)峙試驗(yàn)表明，

棘殼孢菌12-R-5對(duì)灰葡萄孢表現(xiàn)出高效性和專一性，其對(duì)菌絲抑制率達(dá)66.67%。含藥平皿試驗(yàn)表明，菌株12-R-5發(fā)酵濾液10倍稀釋液對(duì)灰葡萄孢菌絲生長抑制率達(dá)100%，與其他處理差異顯著。菌株12-R-5 10倍發(fā)酵濾液處理灰葡萄孢10 h，孢子不萌發(fā);100倍稀釋液處理對(duì)孢子萌發(fā)抑制率為91.01%。顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，棘殼孢菌使灰葡萄孢菌絲扭曲變形，膨大腫脹及斷裂，部分菌絲發(fā)生縊縮、消融現(xiàn)象。說明棘殼孢菌12-R-5菌株具有很好的生防潛力及應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 藥用植物; 內(nèi)生真菌; 植物病原菌; 拮抗作用

中圖分類號(hào)： S 572

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020499

Isolation of endophytic fungi from medicinal plants and screening for antagonistic strains

YANG Fan1，2，3， LIU Chunlai2，3， LIU Liang2，3， WANG Shuang2，3，

JIANG Xifeng2，3， LI Min2，3， CAO Dawei2，3， LI Xinmin1，2，3*

（1. Postdoctoral Research Workstation， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China;

2. Institute of Plant Protection， Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150086， China;

3. Scientific Observation and Experimental Station of Crop Pests in Harbin， Ministry of

Agriculture and Rural Affairs， Harbin 150086， China）

Abstract

In order to explore new biocontrol resources， endophytic fungi were isolated and purified from different tissues of 21 wild medicinal plants by using tissue isolation method. Antagonistic strains were screened against six common pathogenic fungi， and the strains were identified based on morphology and molecular biology. The effects of antagonistic strains against target pathogens on mycelial growth and spore germination were further studied. The results showed that 11 highly active antagonistic strains were screened out from 478 strains of endophytic fungi， which belonged to Penicillium， Bipolaris， Pyrenochaeta， Fusarium， Lachnum， Coniella and Neonectria. Penicillium accounted for the highest proportion， up to 36.36% of the total. The inhibition rate? of the strain 12-R-5 against Botrytis cinerea hyphae was 66.67% by the plate confrontation test. The inhibition rate of 10-fold fermentation filtrate of 12-R-5? against pathogen hyphae growth reached 100%， which was significantly higher than other treatments. Pathogen spores treated 10-fold the fermentation filtrates of the strain 12-R-5 for 10 h could not germinate. When the spores were treated with 100-fold diluent， the inhibition rate of spore germination was 91.01%. According to microscopic observation， the strain 12-R-5 could cause the hyphae of B.cinerea to expand and twist， and some hyphae shrunk and melted. The results indicated that the strain 12-R-5 had a good biocontrol potential and application prospect.

Key words

medicinal plants; endophytic fungi; phytopathogens; antagonistic activity

Petrini于1991年將內(nèi)生菌定義為在其生活史中的某一段時(shí)期生活在植物組織內(nèi)，且沒有引起植物組織明顯病害癥狀的微生物[1]。同時(shí)植物內(nèi)生菌的挖掘被認(rèn)為是尋找具有潛在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值的天然產(chǎn)物的新領(lǐng)域[2-3]。藥用植物是具有生物活性的天然化合物的豐富資源，且藥用植物內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的活性成分[4-5]，而且在很大程度上仍未被開發(fā)[6]。因此從藥用植物中分離得到內(nèi)生真菌在尋找新的生物活性天然化合物方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在殺菌劑的研制中內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物具有很大的潛力。傳統(tǒng)藥用植物被認(rèn)為是新型內(nèi)生真菌的重要來源[7-9]。

本研究以采自大興安嶺東麓內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市阿榮旗三岔鎮(zhèn)新勝村處于營養(yǎng)生長階段的野生藥用植物為材料，采用組織分離法，進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離、鑒定，從中篩選對(duì)植物病原菌拮抗作用較強(qiáng)的菌株，為挖掘野生植物內(nèi)生真菌多樣性及功能型拮抗菌株篩選提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試植物

供試植物材料于2017年7月底采自大興安嶺東麓內(nèi)蒙古自治區(qū)呼倫貝爾市阿榮旗三岔河鎮(zhèn)新勝村，包括黃芩Scutellaria baicalensis、地丁草Corydalis bungeana、興安石竹Dianthus chinensis、玉竹Polygonatum odoratum、小葉玉竹Polygonatum humile、地榆Sanguisorba officinalis、威靈仙Clematis chinensis、關(guān)防風(fēng)Saposhnikovia divaricata、藜蘆Veratrum nigrum、興安烏頭Aconitum ambiguum、毛筒玉竹Polygonatum inflatum、黃芪Astragalus mongholicus、毛百合Lilium dauricum、白蘚Dictamnus dasycarpus、蒼術(shù) Atractylodes lancea、白芷Angelica dahurica、興安柴胡Bupleurum sibiricum、苦參Sophora flavescens、漏蘆Rhaponticum uniflorum、桔梗Platycodon grandiflorus、狼毒Euphorbia fischeriana，共21份野生植物樣本。

1.2 供試病原菌

供試病原真菌為：大豆根腐病菌Fusarium oxysporum、玉米大斑病菌Setosphaeria turcica、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、馬鈴薯早疫病菌Alternaria solani、水稻紋枯病菌Rhizoctonia solani、玉米莖基腐病菌Fusarium graminearum，以上病原菌菌株由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治研究室保存。

1.3 供試植物中內(nèi)生真菌分離及純化

采用組織分離法：植物樣品的根、莖、葉、花、果反復(fù)用自來水沖洗掉泥污，濾紙上晾干。取野生植物健康組織根、莖、果5～7 mm，葉、花3 mm見方。各組織經(jīng)70%乙醇浸泡5 s，根、莖、果經(jīng)0.1%升汞浸泡1.5～2 min，葉、花經(jīng)0.1%升汞浸泡30～45 s，無菌水漂洗3次，滅菌濾紙吸干表面水分，接在含有鏈霉素（400 μg/mL）的PDA平皿上，每皿4塊組織，4次重復(fù)。于（25±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察至有菌絲長出。

消毒效果驗(yàn)證：取各組織最后1次無菌水沖洗液400 μL涂布于PDA平板，于（25±1）℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～5 d，觀察有無菌落產(chǎn)生，若平皿表面無真菌生長，則表明組織表面滅菌徹底，所分離獲得的是內(nèi)生真菌，否則不能繼續(xù)用于試驗(yàn)。

各組織培養(yǎng)2～3 d后，待培養(yǎng)組織邊緣有菌絲長出時(shí)，采用尖端菌絲挑取法，挑取形態(tài)不同的菌落轉(zhuǎn)移到新的PDA平皿繼續(xù)培養(yǎng)，反復(fù)純化并培養(yǎng)，對(duì)已純化的菌株編號(hào)，轉(zhuǎn)至PDA斜面培養(yǎng)基上，于（25±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～7 d，4℃冰箱內(nèi)保藏備用。

1.4 拮抗內(nèi)生真菌初篩

采用平皿對(duì)峙培養(yǎng)法[10]，略改進(jìn)。打取7 mm供試病原菌菌碟分別接在PDA平板中央，在距培養(yǎng)皿邊緣1 cm處等距對(duì)稱接種4株待測(cè)內(nèi)生真菌菌碟，以單獨(dú)接種病原菌為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。（25±1）℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至對(duì)照皿中病原菌長滿平皿，觀察待測(cè)內(nèi)生真菌是否有拮抗作用，并測(cè)量抑菌帶寬。

1.5 拮抗內(nèi)生真菌的鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：活化具有高效拮抗作用的菌株，取培養(yǎng)皿邊緣直徑7 mm菌碟，將菌碟轉(zhuǎn)接于PDA平板中央，（25±1）℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，每隔2 d觀察菌落形態(tài)，至菌絲長滿平皿時(shí)，顯微鏡下觀察菌絲、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)以及分生孢子梗著生情況，對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。

分子生物學(xué)鑒定：利用通用引物ITS1和ITS4擴(kuò)增菌株DNA，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段經(jīng)DNA膠回收試劑盒回收純化后送北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序后獲得的序列提交到NCBI，用BLAST完成序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定菌株。

1.6 高效拮抗菌株12-R-5對(duì)灰霉菌的影響

1.6.1 對(duì)病原菌菌絲的影響

對(duì)峙培養(yǎng)法。用直徑7 mm的打孔器分別在植物病原菌邊緣、待測(cè)菌株12-R-5平板上打取菌碟，在直徑90 mm PDA平板上取半徑3.5 cm的圓周，沿直徑對(duì)稱接種病原菌和菌株12-R-5菌碟各一塊，每處理重復(fù)3次。設(shè)只接種病原菌的平板為對(duì)照。置于（25±1）℃黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落長滿培養(yǎng)皿，直尺測(cè)量抑菌帶寬和處理組病原菌菌落半徑，計(jì)算菌絲生長抑制率（IMG）。

IMG=（對(duì)照菌落半徑-處理病原菌菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑×100%。

瓊脂擴(kuò)散培養(yǎng)法。在PDA平板中央接種植物病原菌菌碟，在菌碟周圍，按等邊三角形等距離放置牛津杯，每孔接入菌株12-R-5發(fā)酵濾液250 μL，每處理重復(fù)3次。以每孔接入無菌PDB培養(yǎng)液為對(duì)照。置于（25±1）℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照菌落長滿培養(yǎng)皿，測(cè)量抑菌圈直徑。

含藥平皿法。用直徑7 mm打孔器在拮抗菌株的菌落邊緣打取菌碟，接種到150 mL PDB培養(yǎng)液中，每瓶3個(gè)菌碟，于（25±1）℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d。將發(fā)酵液在5 000 r/min下離心15 min，收集上清液，用0.22 μm細(xì)菌過濾器過濾，獲得無菌發(fā)酵濾液，待用。待滅菌PDA培養(yǎng)基溫度降至40℃左右時(shí)與拮抗菌株發(fā)酵濾液按不同體積比混合均勻，制得含不同稀釋倍數(shù)（10、50、100、500倍和1 000倍）發(fā)酵濾液的平皿，將直徑7 mm的病原菌菌碟接種至平皿中央，以不含發(fā)酵液的PDA平板上接種的病原菌為對(duì)照，置于（25±1）℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照PDA平皿菌落長滿培養(yǎng)皿，十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑，計(jì)算菌絲生長抑制率（IMG）。

IMG=（對(duì)照菌落直徑-處理病原菌菌落直徑）/對(duì)照菌落直徑×100%。

1.6.2 對(duì)病原菌孢子萌發(fā)的影響

收集在PDB中培養(yǎng)7 d的病原菌，4層無菌紗布過濾病原菌菌絲體，獲得病原菌孢子懸浮液，將菌株12-R-5發(fā)酵濾液與病原菌孢子懸浮液混合，得到稀釋10、50、100、500倍和1 000倍的發(fā)酵濾液5個(gè)處理，以病原菌孢子懸浮液為對(duì)照，每處理3次重復(fù)。將各處理孢子懸浮液裝入無菌試管中，置于（25±1）℃培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)10 h檢測(cè)孢子萌發(fā)率，以芽管長度超過孢子一半長度為標(biāo)準(zhǔn)，判定孢子萌發(fā)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗內(nèi)生真菌初篩

試驗(yàn)共分離、純化得到478株內(nèi)生真菌，采用平皿對(duì)峙法測(cè)定分離菌株對(duì)6種靶標(biāo)菌的抑菌作用，初篩獲得具有拮抗作用的菌株61株，其中對(duì)6種靶標(biāo)菌抑菌帶寬≥5 mm的菌株有11株（表1）。

分離自地丁草果實(shí)的菌株2-Fr-8對(duì)6種病原菌菌絲生長均有較強(qiáng)的抑制作用，拮抗作用廣譜且高效，分離自黃芪根部的菌株12-R-5對(duì)番茄灰霉病菌具有專一性，且拮抗作用很強(qiáng)（圖1）。

2.2 拮抗內(nèi)生真菌鑒定

通過NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)，11株高效拮抗菌株分屬于青霉屬Penicillium、平臍蠕孢屬Bipolaris、棘殼孢屬Pyrenochaeta、鐮孢屬Fusarium、粒毛盤菌屬Lachnum、墊殼孢屬Coniella和Neonectria，共7個(gè)屬：青霉屬在7個(gè)屬中占比最高，達(dá)36.36%。

2.3 菌株12-R-5對(duì)灰葡萄孢的拮抗作用

2.3.1 12-R-5對(duì)灰葡萄孢菌絲生長的影響

經(jīng)鑒定12-R-5為棘殼孢屬真菌。采用對(duì)峙培養(yǎng)法處理灰葡萄孢，可見邊緣菌絲稀少疏松（圖3a），菌株12-R-5對(duì)灰葡萄孢菌絲生長抑制率為（66.67±3.15）%。平板擴(kuò)散培養(yǎng)法測(cè)定12-R-5發(fā)酵濾液對(duì)灰葡萄孢的抑制作用，發(fā)現(xiàn)牛津杯周邊幾乎不長菌絲，偶見稀少菌絲，抑菌直徑為（20.83±3.78）mm（圖3b）。在顯微鏡下觀察，對(duì)照菌絲生長細(xì)長而均勻，并無膨大、崩解、畸形現(xiàn)象（圖3c）。經(jīng)發(fā)酵濾液處理的病原菌，菌絲生長受到嚴(yán)重的抑制，出現(xiàn)畸變現(xiàn)象，菌絲粗細(xì)不均，扭曲變形，膨大腫脹及斷裂（圖3d、e）。

在拮抗菌發(fā)酵濾液與PDA混合的平板上培養(yǎng)灰霉病菌，待對(duì)照PDA平皿上病原菌長滿時(shí)，各處理下病原菌菌落直徑有明顯差異（圖4）。發(fā)酵濾液稀釋10、50、100、500倍和1 000倍處理對(duì)病原菌菌絲生長抑制率分別為100%、89.14%、8234%、4524%和35.65%。

2.3.2 12-R-5發(fā)酵濾液對(duì)孢子萌發(fā)的影響

隨著稀釋倍數(shù)的增加，12-R-5對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用減弱。不同稀釋倍數(shù)的12-R-5發(fā)酵濾液處理灰葡萄孢孢子10 h后， 50、100、500倍和1 000倍發(fā)酵濾液對(duì)孢子的萌發(fā)抑制率分別為9340%、91.01%、78.63%和28.4%， 10倍稀釋液平皿下病原菌孢子不萌發(fā)，孢子萌發(fā)抑制率可達(dá)到100%。

3 結(jié)論與討論

自然界植物內(nèi)生真菌種類多達(dá)100萬種[11]。因其特殊的生長環(huán)境以及和寄主長期協(xié)同進(jìn)化，藥用植物內(nèi)生菌可產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的活性物質(zhì)，成為了尋找和發(fā)現(xiàn)新穎而有價(jià)值的生物活性物質(zhì)的研究熱點(diǎn)[12-13]。具有生物活性的微生物次生代謝產(chǎn)物可直接開發(fā)成為農(nóng)用抗生素應(yīng)用于農(nóng)業(yè)病蟲害的防治[14]。目前已從沙冬青Ammopiptanthus mongolicus、老瓜頭Cynanchum mongolicum、甘草Glycyrrhiza uralensis、苦參Sophora flavescens、杜仲Eucommia ulmoides 、枸杞Lycium barbarum等多種藥用植物中獲得對(duì)植物病原菌有抑制作用的內(nèi)生菌[15-17]。本研究從21種野生藥用植物中分離獲得478株內(nèi)生真菌，篩選出對(duì)多種植物病原菌具有高效拮抗作用的內(nèi)生真菌菌株11株，為研究開發(fā)新型生物農(nóng)藥提供了豐富的生防微生物資源。

已報(bào)道的植物內(nèi)生真菌絕大多數(shù)屬于子囊菌Ascomycetes，無孢菌群的多種真菌以及半知菌中的鏈格孢屬Alternaria、青霉屬Penicillium、鐮孢屬Fusarium真菌[18-19]。以藥用植物煙草Nicotiana tabacum為材料，分離獲得的539株內(nèi)生真菌分屬于31個(gè)屬、73種，其中曲霉屬Aspergillus和鐮孢屬為優(yōu)勢(shì)菌群[20]。從艾納香Blumea balsamifera的根、莖、葉中分離獲得的152株內(nèi)生真菌具有豐富的物種多樣性，分屬于鐮孢屬、曲霉屬、青霉屬、木霉屬Trichoderma、彎孢屬Curvularia、脈孢菌屬Neurospora、多節(jié)孢屬Nodulisporium、間座殼屬Diaporthe、莖點(diǎn)霉屬Phoma、蠟質(zhì)菌屬Ceriporia和煙管菌屬Bjerkandera 11個(gè)屬，其中鐮孢屬、曲霉屬、木霉屬和彎孢屬為艾納香內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)菌屬[21]。本研究篩選得到的11株高效拮抗菌株分屬于7個(gè)屬，其中青霉屬占36.36%，為優(yōu)勢(shì)菌屬。

拮抗真菌抑菌機(jī)理主要體現(xiàn)在其具有較強(qiáng)的空間和營養(yǎng)競爭能力，能夠產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)抑制植物病原菌的生長，或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性等多方面[15]。據(jù)報(bào)道，杜仲Eucommia ulmoides內(nèi)生真菌嗦孢殼屬Thielavia菌株DZGS08發(fā)酵液對(duì)玉米紋枯菌Rhizoctonia solani的抑制率達(dá)到50%以上[15]。分離自鳳丹Paeonia ostii 根部的一株鐮孢屬內(nèi)生真菌對(duì)毛霉Mucor sp.、鏈格孢和青霉等6種病原菌抑制率均在80%以上[22]。枸杞內(nèi)生真菌鐮孢屬菌株NQ8GII4對(duì)膠孢炭疽菌Colletotrichum Gloeosporioides的抑制率高達(dá)93.43%[16]。棘殼孢屬真菌作為感染人類皮膚、指甲的一類病原菌在醫(yī)學(xué)研究中普遍報(bào)道，同時(shí)該屬部分真菌以腐生菌的形式廣泛存在于熱帶和亞熱帶的土壤、植物中，部分真菌也會(huì)導(dǎo)致番茄、玉米根腐病的發(fā)生[23-24]，但未見棘殼孢屬真菌對(duì)植物病原菌具有拮抗作用的報(bào)道。本研究從野生黃芪根部篩選到的一株棘殼孢屬真菌12-R-5菌株，對(duì)灰葡萄孢菌絲生長及孢子萌發(fā)有顯著的抑制作用，并表現(xiàn)出高效專一性。有關(guān)菌株12-R-5的抑菌機(jī)理及其抑菌活性物有待深入研究，為研發(fā)微生物農(nóng)藥提供依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）