高效液相色譜法同時測定食品中兩種非食用色素的含量

◎ 李 濤，周 瓊

（1安康市質量技術檢驗檢測中心，陜西 安康 725000；2陜西省富硒食品工程實驗室，陜西 安康 725000）

近年來，一些不法食品經(jīng)營者為了獲取更大利益，打著食品添加劑的旗號，在食品中添加非食用物質，對人們的生命和健康造成巨大傷害，如三聚氰胺、吊白塊、蘇丹紅、堿性橙等，引發(fā)了重大的食品安全事故。

在這些非法添加物中，蘇丹紅、堿性橙這兩種非食用色素被使用的頻率較高。蘇丹紅和堿性橙種類多樣，單獨或重疊使用都能使產(chǎn)品呈現(xiàn)良好的色澤，且成本低廉，增加了產(chǎn)品競爭力。國家技術部門出臺了相應的檢測方法標準[1-2]，只能對蘇丹紅和堿性橙分別進行檢測，檢測效率較低。若能同時檢測這兩種非食用色素，則能很大程度地提高檢測效率、降低檢驗成本。本研究結合蘇丹紅和堿性橙的檢測條件，建立了同時檢測蘇丹紅和堿性橙的分析方法，快速準確，具有一定的參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐干、豆油皮、腐竹、豆腐乳、豆瓣醬、辣椒醬和辣椒面等，購自陜西省安康市本地市場；標準品[堿性橙2（CAS號：532-82-1，純度≥99.9%）、堿性橙21（CAS號：3056-93-7，純度≥96.7%）、堿性橙22（CAS號：4657-00-5，純度≥99.9%）]，購自海安譜實驗科技股份有限公司；蘇丹紅Ⅰ（編號：GBW10056純度為≥99.9%），購自中國計量科學院研究院；所有試驗用水符合GB/T 6682—2008中一級水要求（超純水）；乙酸銨（分析純）；無水硫酸鈉（分析純）；氨水（分析純）；甲醇（色譜純）；乙腈（色譜純）；磷酸（分析純）。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀：LC-20A，島津公司；紫外檢測器；C18色譜柱（島津Inertsil公司250 mm×4.6 mm，5 μm）；超聲波清洗儀；超純水器；電子天平；離心機；針頭過濾器：孔徑為0.45 μm有機微孔濾膜。

1.3 樣品處理

將樣品攪碎，稱取2 g（精確至0.001 g）樣品于25 mL離心管中，加入1 mL蒸餾水潤濕樣品；用10%（V/V）氨水調節(jié)樣品至pH為7～8，加入5 mL乙腈提取，振蕩10 min，超聲10 min，4 000 r·min-1離心5 min；將上清液移入10 mL容量瓶中，向殘渣中再加入5 mL堿性甲醇，振蕩10 min，超聲10 min，4 000 r·min-1離心5 min；合并上清液，用甲醇定容至10 mL；過0.45 μm濾膜，供HPLC分析[3-5]。

1.4 標準曲線繪制

1.4.1 標準溶液制備

分別稱取標準品堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ各50 mg，（精確至0.000 1 g），置于100 mL棕色容量瓶中，加90%乙腈超聲使之完全溶解，定容，搖勻。所配溶液中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ濃度均為500 μg·mL-1標準儲備液，于4 ℃保存。

1.4.2 標準中間液

準確移取堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ標準貯備液各5 mL，分別置于50 mL棕色容量瓶中，用90%乙腈定容至刻度。所配溶液中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ濃度均為50 μg·mL-1，于4 ℃保存。

1.4.3 標準工作溶液

準確移取堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ染料標準中間液各0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、5.0 mL、7.5 mL和10.0 mL于50 mL棕色容量瓶中，用90%乙腈定容至刻度。此時，混合溶液中堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22、蘇丹紅Ⅰ染料的濃度分別為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、5.0 μg·mL-1、7.5 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1。將配制好的標準工作溶液，繪制以峰面積為縱坐標，工作溶液濃度為橫坐標的標準曲線。

1.5 色譜條件

色 譜 柱：C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），島津Inertsil公司；流動相：甲醇-乙酸銨（pH 4.5，20 mmol·L-1）；流速以1.0 mL·min-1進行梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1；柱溫：40 ℃；檢測器：紫外檢測器；檢測波長：450 nm；進樣量：20 μL。

表1 梯度洗脫程序表

1.6 樣品分析

按照1.5中的色譜條件檢測待測樣品，繪制標準曲線并比較，依據(jù)保留時間進行定性分析，采用外標峰面積法進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 流動相的選擇

根據(jù)蘇丹紅和堿性橙的分析方法，采用梯度洗脫程序，分別試驗了甲醇-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙酸銨溶液等作為流動相，探究其對堿性橙和蘇丹紅分離效果的影響，結果發(fā)現(xiàn)，甲醇-乙酸銨作為流動相時，蘇丹紅和堿性橙的分離效果、峰型及線性關系都比較理想，采用其他流動相時，或有組分缺失，或有幾種組分重疊無法分離的問題。

關于流動相中乙酸銨的濃度，分別采用20 mmol·L-1和50 mmol·L-1乙酸銨進行試驗，二者都能達到良好效果，且50 mmol·L-1時響應值稍高，但柱壓相應增加，在分離效果方面二者無大的差別。若乙酸銨濃度高，溶質在系統(tǒng)中析出程度增加，對系統(tǒng)的穩(wěn)定和后期沖洗造成影響。因此，為避免高濃度乙酸銨在系統(tǒng)中析出的影響，本試驗采用20 mmol·L-1乙酸銨作為流動相。同時參考有關資料，對乙酸銨在不同pH值下的分離效果進行比較試驗[3]，用1 mol·L-1磷酸調節(jié)pH值為3.5、4.5、5.5和6.5，結果發(fā)現(xiàn)當pH值為4.5時，效果最好。但結合實際，不同的色譜柱性能有差異，對酸度的適應有所不同，不一定每支色譜柱在pH值為4.5時效果最好。

關于梯度洗脫條件，上述條件只是其中一種。甲醇含量增加，分離速度快，但分離效果降低；甲醇含量降低，分離速度減慢，分離效果變好。如果降低初始甲醇含量至30%左右，減緩甲醇比例上升速度，則分離效果更好一些，但4種組分出峰時間會相應延長2～5 min。

2.1.2 檢測波長的選擇

有關資料顯示[2]，堿性橙2在波長450 nm處有最大吸收，堿性橙21、堿性橙22和蘇丹紅Ⅰ在480 nm處有最大吸收，本試驗對這兩個波長進行了比較，結果發(fā)現(xiàn)，在波長為450 nm時，4種組分都能達到滿意的檢測效果，而在480 nm時，堿性橙2的響應值不太理想，故而選擇波長為450 nm。

2.2 前處理條件選擇

提取堿性橙的溶劑有甲醇和乙醇，提取蘇丹紅的溶劑有乙腈和丙酮等，單獨使用某一種或某一類，都不能將幾種組分完全提取出來，回收率很低。經(jīng)過試驗發(fā)現(xiàn)，乙腈提取蘇丹紅效果較好，堿性甲醇提取堿性橙效果較好，乙醇提取峰形雜亂不利于定性，故而采取乙腈-堿性甲醇的提取組合。調節(jié)pH值是為了使各個樣品保持統(tǒng)一穩(wěn)定的酸堿環(huán)境，保證方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，保證被檢組分的定性檢出。

2.3 標準曲線和檢出限

用1.5中的色譜條件分析4種非法添加色素（濃度均為10.0 mg·kg-1），標樣譜圖如圖1所示。4種組分得到很好分離。在標準系列中，4種組分的濃度分別為1.0 mg·L-1、2.0 mg·L-1、5.0 mg·L-1、7.5 mg·L-1和10.0 mg·L-1，在此范圍內，峰面積與濃度之間有良好的線性關系。同時測定4種組分的檢出限，均達到0.05 mg·L-1，具體如表2所示。

圖1 4種非法色素檢測譜圖

表2 4種組分線性范圍、回歸方程、線性相關系數(shù)和檢出限表

2.4 回收率和精密度試驗

分別選取2.0 g辣椒面和豆腐乳樣品（均未含堿性橙和蘇丹紅），添加4種組分的混合標準溶液，每個組分添加高低濃度各兩個平行樣，進行加標回收試驗?；厥章省⑾鄬ο嗖詈投肯奕绫?所示。結果表明，兩種樣品辣椒面和豆腐乳的兩平行試驗中堿性橙的回收率均大于80%，蘇丹紅Ⅰ的回收率≥89%。相對相差在3.8%～4.6%，4種組分的定量限在0.20 mg·kg-1。

表3 4種組的加標回收率、相對偏差表

2.5 樣品的含量測定

采用本方法對市售的豆腐干、豆油皮、腐竹、豆腐乳、豆瓣醬、辣椒醬和辣椒面共20份樣品中的非食用色素進行了檢測，具體情況見表4。

表4 不同食品中的色素檢測結果表

3 結語

采用本方法對安康本地產(chǎn)的辣椒面、辣椒醬、豆腐乳、豆瓣醬、腐竹、豆油皮等產(chǎn)品進行檢測，均未檢測出堿性橙和蘇丹紅。而且安康當?shù)匾矝]有非法添加蘇丹紅和堿性橙的投訴，也沒有其他檢測機構在安康出產(chǎn)的食品中檢測出堿性橙和蘇丹紅的報告。本方法穩(wěn)定可靠，快速準確，重現(xiàn)性好，檢測效率高，具有一定的參考價值。