正交試驗法優(yōu)選藥食同源四君子湯的提取工藝

◎ 張勝楠，張 璐，劉 京，李榮喬，史東林，謝鳳玲

（1.石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050000；2.河北體育學院，河北 石家莊 050000）

四君子湯出自《太平惠民和劑局方》，是一味中醫(yī)方劑，具有補氣，益氣健脾之功效。方中人參性甘溫大補脾胃之氣，是為君藥；白術苦溫，助君藥燥濕健脾，是為臣藥；茯苓甘淡，健脾滲濕，是為佐藥；甘草味甘性平，調(diào)和諸藥，益氣和中，是為使藥[1]。四君子湯不僅能促進機體的造血功能，具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、抗氧化、提高代謝水平等作用，同時還能糾正免疫系統(tǒng)功能紊亂，提高體液免疫和細胞免疫的功能，具有調(diào)節(jié)胃腸功能、提高機體免疫力、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等藥理作用，達到健脾益氣的功效[2-3]。

脾胃在中醫(yī)的五行學說中屬土，為“氣血生化之源”，有生化萬物的特性，所以稱其為“后天之本”。如果脾氣不升，則能源匱乏；脾精不行，則筋骨肌肉無氣以生。脾胃功能的強弱，直接關系到人體生命的盛衰。然而大量的運動和鍛煉耗氣，易肌肉勞頓，導致肢體乏力；大量出汗，也會損傷津液，故脾先受損[4]。從現(xiàn)代醫(yī)學的角度來看，有關肌肉與組織器官代謝相關的線粒體的結(jié)構(gòu)和酶活性功能的變化，都與脾氣不足發(fā)生的病理機制相關[5]。所以脾胃健康對運動有直接影響，健脾益氣可緩解運動性疲勞。

根據(jù)四君子湯的功效，將原方中白術由藥食同源山藥代替，山藥有健脾燥濕，加強益氣的功效。人參、山藥、茯苓、甘草四味藥食同源藥材組方經(jīng)水提后通過干燥制得的提取物，可益氣健脾，改善機體運動性疲勞。四君子湯的水煎液主要含有多糖類、皂苷類、黃酮類等其他成分，另外還包括了一些揮發(fā)油及生物堿類物質(zhì)[6]。多糖類物質(zhì)在生物體中普遍存在，是由糖苷鍵結(jié)合而成的糖鏈，是一類天然高分子多聚物。多糖是生物體內(nèi)重要的生物大分子，它是維持生命活動正常運轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一，也是中藥主要活性成分之一[7]。

近年來，有關中藥多糖類物質(zhì)藥理作用的研究報道逐年增加，中藥多糖具有保護肝臟、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗癌等多種藥理活性，具有很大的發(fā)展?jié)摿?。鑒于其重要的免疫調(diào)節(jié)作用，中藥多糖又被稱為免疫活性多糖。多糖類物質(zhì)來源廣泛、療效準確并且毒副作用小，因此受到人們的普遍重視[8]。多糖的提取方法有很多，如超聲提取法[9]、酸堿提法[10-11]、生物酶提取法[12]、水提法[13]、微波提取法[14]等，其中水提法是最傳統(tǒng)的提取方法，相較于其他幾種方法，操作最為簡單安全。對于多糖的測定，有苯酚-硫酸法[15]、蒽酮-硫酸法[16]、DNS法[17]等方法。為了更好地控制中藥方劑質(zhì)量，為制備工藝提供科學性依據(jù)，本文以粗多糖含量為指標，正交試驗法對水提工藝進行系統(tǒng)考察，采用苯酚-硫酸法進行含量檢測，以篩選出最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

處方藥材，購自河北蘭氏盛泰藥業(yè)有限公司；D-無水葡萄糖標準品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201908；苯酚、硫酸、無水乙醇，均為分析純，本實驗試劑如無特殊說明均為分析純。

1.2 儀器與設備

賽多利斯（224-1CN）電子天平；電熱恒溫水浴鍋（DK-S26）；超聲波清洗器（KQ-700VDE）；紫外可見分光光度計（PE Lambda 25）；渦旋振蕩器；離心機。

1.3 正交試驗設計

以提取次數(shù)（A）、提取時間（B）、料液比（C）為考察因素，空列（D），以粗多糖提取率為指標，L9（34）正交試驗設計表見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表

1.4 多糖提取及測定

提取物經(jīng)過乙醇作用，產(chǎn)生沉淀，在去除其他可溶性糖和大量雜質(zhì)后，粗多糖與苯酚-硫酸作用生成橙紅色化合物，顯色強度與溶液中粗多糖的含量成正比，最終在波長為485 nm下比色定量。

1.4.1 標準曲線的繪制

稱取對照品D-無水葡萄糖100 mg放于100 mL的容量瓶中，加適量水，待葡萄糖溶解后，定容至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg·mL-1的對照品溶液。

準確吸取葡萄糖標準使用液0 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.80 mL、1.20 mL、1.60 mL和2.00 mL（相當于0 mg、0.02 mg、0.04 mg、0.08 mg、0.12 mg、0.16 mg和0.20 mg葡萄糖）于25 mL比色管中，加水補至2.0 mL，加入1.0 mL 5%的苯酚溶液，混勻，小心加入濃硫酸10 mL，混勻，置沸水浴2 min，冷卻至室溫，用分光光度計在485 nm波長處以空白試劑為參比，1 cm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4.2 樣品提取

將藥材按比例混合后提取、濃縮、干燥后得中藥提取物，稱取適量樣品，置于25 mL容量瓶中，加水搖勻溶解，定容至刻度（V1），混勻后過濾，棄去初濾液后，收集余下的濾液供沉淀粗多糖。

1.4.3 沉淀粗多糖

準確吸取濾液5.0 mL（V2），放于50 mL離心管中，再加入20 mL無水乙醇，混勻，4 ℃的冰箱中靜置4 h以上，再以4 000 r·min-1離心5 min后，棄去上清液，殘渣用80%（V/V）乙醇溶液洗滌，離心后棄去上清液，重復操作3次。殘渣用水溶解后定容至25 mL（V3），再吸取2.5 mL溶液至100 mL容量瓶，定容。

1.4.4 樣品測定

準確吸取溶解液2.0 mL（V4）置于25 mL比色管中，測定吸光度值。從測得的標準曲線上查出葡萄糖含量，按照式（1）計算該提取物中粗多糖含量。

式中：X-提取物中粗多糖含量（mg·100g-1）；m1-提取物測定液中葡萄糖的質(zhì)量（mg）；m2-提取物質(zhì)量（g）；V1-提取物提取液總體積（mL）；V2-沉淀粗多糖所用樣品提取液體積（mL）；V3-粗多糖溶液體積（mL）；V4-測定用樣品液體積（mL）；0.9-葡萄糖換算為粗多糖的系數(shù)；40-稀釋倍數(shù)。

1.5 統(tǒng)計分析

利用軟件記錄試驗數(shù)據(jù)，計算藥食同源四君子湯提取物粗多糖含量，正交試驗設計和結(jié)果采用正交設計助理IIV 3.1進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取工藝優(yōu)化

由表2知，由均值得該中藥組合物的最佳提取工藝為A3B3C1；由正交試驗表得粗多糖含量最高的為第9組（A3B3C2）。由表3知，提取次數(shù)（A）與提取時間（B）對結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），而料液比無顯著性影響。

表2 正交優(yōu)化試驗結(jié)果分析表

表3 正交優(yōu)化實驗方差分析表

2.2 最佳提取工藝與優(yōu)選提取工藝的對比

為了確定此中藥組方水提工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，在正交試驗的基礎上，結(jié)合實際生產(chǎn)中節(jié)能減排（節(jié)電、節(jié)水、節(jié)時間）的相關政策，在粗多糖得率較高的實驗6、實驗8和實驗9中，確定實驗8為優(yōu)選工藝1（A3B2C1），實驗6為優(yōu)選工藝2（A2B3C1）。即優(yōu)選工藝1為提取次數(shù)3次、提取時間90 min、料水比1∶8；優(yōu)選工藝2為提取次數(shù)2次、提取時間120 min、料水比1∶8，進行中藥提取物粗多糖測定分析，考慮到試驗中可出現(xiàn)的誤差，重復3次，對比結(jié)果如表4所示。

表4 最佳與優(yōu)選工藝結(jié)果分析表（單位：mg/100 g）

由表4結(jié)果可以看出，最佳工藝和優(yōu)選工藝1粗多糖測定結(jié)果差距并不大，和優(yōu)選工藝2粗多糖測定結(jié)果差距較大，從節(jié)約能源、簡化工藝、降低成本、節(jié)省時間等方面考慮，選定優(yōu)選工藝1為最終提取工藝，即提取次數(shù)3次、提取時間90 min、料水比1∶8。進行提取、濃縮、干燥得到中藥提取物。

3 結(jié)論

本文通過試驗優(yōu)選出最佳提取工藝為提取次數(shù)3次、提取時間90 min、料水比1∶8，本工藝中所用提取溶劑廉價易得，應用廣泛，且工藝方法簡便，實用性強，可為后期工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。