抑制石榴葉斑病菌的化學(xué)農(nóng)藥和木霉菌株篩選

潘成蕊，魯海菊，張蓉蓉，胡 婕，李昱賢

（1.紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院，云南蒙自 661199；2.蒙自海關(guān)綜合技術(shù)中心，云南蒙自 661199）

石榴是鮮食水果之一，在我國(guó)已有兩千多年的歷史，現(xiàn)已成為云南蒙自的主要特色水果之一，成為了蒙自市重要的經(jīng)濟(jì)果樹，但隨著種植規(guī)模的不斷擴(kuò)大，石榴病害隨著種植時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。1999 年周又生[1]報(bào)道了石榴干腐病，發(fā)病率約40%，造成重大經(jīng)濟(jì)損失。2003年劉云龍[2]首次報(bào)道云南蒙自地區(qū)發(fā)生石榴枯萎病，發(fā)病率達(dá)到15%，經(jīng)濟(jì)損失超過1500萬元[3]。1996年李夷波[4]等人報(bào)道蒙自地區(qū)石榴果腐病發(fā)生高達(dá)20%-30%，嚴(yán)重影響對(duì)外銷售。郭建偉[5]等人在石榴病原菌與病害研究綜述中提到石榴樹還會(huì)發(fā)生其他病害：如石榴根腐病、石榴瘡痂病、石榴褐斑病、石榴圓斑病、石榴葉霉病等，因而科學(xué)防治石榴病害是關(guān)鍵，提高果樹經(jīng)濟(jì)價(jià)值已迫在眉睫。

目前，已發(fā)現(xiàn)由擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsisspp.)引起的石榴葉斑病成為石榴生產(chǎn)上的重要病害之一，其病害多從葉尖或葉緣開始，初葉片正面為紅褐色小斑點(diǎn)，后擴(kuò)大為圓形至橢圓形病斑，外圍有黃綠色暈圈，天氣潮濕時(shí)，溢出黃色黏液。嚴(yán)重時(shí)病斑連成片，引起焦枯，葉片脫落。對(duì)石榴造成了新的威脅，影響了石榴的產(chǎn)量和品質(zhì)。通過初步調(diào)查蒙自市新安所鎮(zhèn)種植基地石榴葉斑病的發(fā)病率約為20%，給果農(nóng)們帶來很大困擾。擬盤多毛孢可引起多種植物的葉斑病和灰斑病，曾引起印度南部茶葉灰斑病，導(dǎo)致產(chǎn)量下降了17%[6]。在浙江和福建楊梅上大面積引發(fā)楊梅凋萎病[7]。薛德勝曾報(bào)道棒狀擬盤多毛孢（P.clavispora）引起藍(lán)莓的枝枯病、葉斑病和根腐病[8-10]。Lisa等[11]報(bào)道小孢擬盤多毛孢菌引起番石榴的瘡痂病；張傳清[12]等報(bào)道小孢擬盤多毛孢菌會(huì)引起山核桃的黑斑??；Shen等[13]報(bào)道小孢擬盤多毛孢菌引起油棕葉斑??；Looby[14]曾報(bào)道擬盤多毛孢屬引起羅漢松頂端枯萎，病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了作物自生品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。說明小孢擬盤多毛孢菌寄主多樣，導(dǎo)致眾多果樹及經(jīng)濟(jì)作物發(fā)病，對(duì)石榴的威脅不容小覷。

化學(xué)防治是植物病害防治的重要手段，它憑借快速、高效、簡(jiǎn)便、防效顯著等特點(diǎn)備受歡迎，對(duì)病害的預(yù)防、發(fā)生、流行在某種程度上起到?jīng)Q定性作用，目前已成為農(nóng)戶的首選方案。毛忠順等[15]人報(bào)道三唑酮、百菌清、多菌靈等化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴病害有一定的抑制作用，但隨著病害種類增多、化學(xué)農(nóng)藥不斷更新?lián)Q代，同種藥劑表現(xiàn)出不同效果也是常見現(xiàn)象。通過歸納總結(jié)前人抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果，筆者選擇8種藥劑進(jìn)行室內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以期為大田試驗(yàn)示范提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

長(zhǎng)期廣泛使用農(nóng)藥，病原菌易產(chǎn)生抗性，同時(shí)還會(huì)引起環(huán)境污染。近年來，綠色、無公害產(chǎn)品的呼聲越來越高，生物防治尤為重要。早在1981年西歐國(guó)家借助木霉制劑工序簡(jiǎn)單、防治效果好的優(yōu)點(diǎn)在生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用[16]。目前已有大量學(xué)者發(fā)現(xiàn)木霉菌(Trichodermaspp.)是一種良好的生防因子[17]，其繁殖速度快，能防治病害、增強(qiáng)抗性，是理想的生物防治資源之一。陳海龍[18]研究表明，木霉菌不僅對(duì)黃瓜枯萎病起到47%的防效，而且還具有增產(chǎn)作用。徐佳美等[19]曾報(bào)道哈茨木霉對(duì)擬盤多毛孢引起的草莓根腐病有抑制作用。魯海菊等[20]研究表明，枇杷內(nèi)生木霉P3.9菌株對(duì)多種病原菌均有不同程度的抑制作用。木霉是否對(duì)石榴葉斑病有抑制作用尚未報(bào)道，待進(jìn)一步探究。目前，石榴葉斑病日益嚴(yán)重，尚未見由擬盤多毛孢菌引起石榴葉斑病相關(guān)防治措施的報(bào)道，筆者采用菌絲生長(zhǎng)速率法和對(duì)峙培養(yǎng)法，測(cè)定化學(xué)農(nóng)藥和木霉生防菌株對(duì)石榴葉斑病病菌的抑菌效果，通過室內(nèi)篩選，獲得抑菌效果最優(yōu)的化學(xué)農(nóng)藥和生防菌株，以期為石榴病害的研究提供參考依據(jù)。

一 材料與方法

（一）試驗(yàn)材料

1.試驗(yàn)器材

培養(yǎng)皿（88mm）、酒精燈、接種環(huán)、打孔器、封口膜、75%酒精、打火機(jī)、錐形瓶、無菌操作臺(tái)、鑷子、電子天平。

2.供試菌株

蒙自石榴種植園采集的葉斑病病葉，通過組織分離法、柯赫氏法則驗(yàn)證，獲得擬盤多毛孢Pestalotiopsissp.病菌菌株SY1；木霉Trichodermaspp.（GD1、Y2、GM6、PZ1、GD1抗三唑酮、Y2抗三唑酮、GM6抗三唑酮、GM6抗氟硅唑、PZ1三唑酮、PZ1氟硅唑）菌株，現(xiàn)保存于紅河學(xué)院生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)學(xué)院植物病理教學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

3.供試化學(xué)農(nóng)藥

表1 供試化學(xué)農(nóng)藥相關(guān)信息

將保存好的供試菌株SY1接種到配置好的PDA培養(yǎng)基內(nèi)，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14d。用打孔器取直徑為5mm 的菌塊備用。

4.測(cè)定各供試化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴葉斑病病菌的抑制率

將各化學(xué)農(nóng)藥按照使用說明上的濃度配制好注入到高壓滅菌冷卻至50℃左右的PDA培養(yǎng)基內(nèi)，搖晃均勻后倒平板。待其冷卻后將供試菌株接入培養(yǎng)基正中央，用封口膜封好后置于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d（溫度設(shè)置為28℃），以不加藥PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。最后觀察記錄菌絲生長(zhǎng)量，用十字交叉法測(cè)量每皿菌落的直徑大小，計(jì)算其抑制率。公式如下：

抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑]×100%[21]。

5.測(cè)定各供試木霉菌株對(duì)石榴葉斑病病菌的抑制率

采用對(duì)峙培養(yǎng)法[22]。將SY1與各供試木霉菌株兩兩組合接種到距離平板中央相等的兩個(gè)點(diǎn)上，以不接種木霉菌株的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照。每個(gè)處理3次重復(fù)，于28℃ 條件下恒溫培養(yǎng)。第3d對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢情況進(jìn)行觀察并記錄；第7d測(cè)定病菌的菌落直徑，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率。

6.數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 19.0和Excel 2003進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用Duncan’s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

二 結(jié)果與分析

（一）各供試化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴葉斑病病菌SY1菌株的抑制作用

由圖1可知，利用Duncan’s進(jìn)行方差分析，顯示各供試化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴葉斑病病菌SY1菌株具有不同程度的抑菌作用。其中咪鮮胺、丙環(huán)唑?qū)Y1抑制率差異不顯著，但與其余處理達(dá)到極顯著差異，抑菌率均為100%，抑制效果最好。其次是氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、百菌清、三唑酮4種農(nóng)藥，抑制率均高于79%，抑菌效果較好。氟硅唑與苯醚甲環(huán)唑抑制率差異達(dá)到極顯著水平，其抑制率分別為86.8%、83.3%；百菌清與三唑酮差異不顯著，抑制率分別為79.9%、79.5%。甲基硫菌靈、多菌靈差異不顯著，抑菌效果最差，其抑制率分別為14.9%、13.3%。綜上所述，咪鮮胺和丙環(huán)唑可作為田間防治石榴葉斑病的首選農(nóng)藥。氟硅唑、苯醚甲環(huán)唑、百菌清、三唑酮可作為備選農(nóng)藥。

圖1 各供試化學(xué)農(nóng)藥對(duì)石榴葉斑病病菌SY1的抑制效果圖

（二）各供試木霉菌株對(duì)石榴葉斑病病菌SY1菌株的抑制作用

由圖2可知，利用Duncan’s多重比較法進(jìn)行方差分析，表明10株木霉菌株對(duì)石榴葉斑病病菌SY1菌株均有不同程度的抑制作用。其中，PZ1三唑酮和GM6抗氟硅唑、GD1和GD1抗三唑酮兩兩之間抑菌率差異不顯著，其余菌株之間差異顯著。10個(gè)木霉菌株根據(jù)抑菌率不同分為8組，抑菌率由高到低依次為PZ1>PZ1氟硅唑>GM6>PZ1三唑酮=GM6抗氟硅唑>Y2抗三唑酮>GM6抗三唑酮>Y2>GD1抗三唑酮=GD1。抑菌率分別為57%、54.5%、51.6%、51.6%、51.2%、49.6%、48.4%、41.9%、39.1%和38.7%。PZ1、PZ1氟硅唑、GM6、PZ1三唑酮和GM6抗氟硅唑5個(gè)木霉菌株抑菌率均高于50%，可以作為進(jìn)一步開發(fā)利用的生防菌株?？顾幮阅久咕關(guān)Z1和GM6抑菌率低于原始菌株，抑菌作用衰退；抗藥性木霉菌株GD1抑菌率與原始菌株相同，抑菌效果不變；抗藥性木霉菌株Y2抑菌率高于原始菌株，抑菌作用增強(qiáng)。說明木霉GD1和Y2菌株可與農(nóng)藥混配使用。

圖2 各供試木霉菌株對(duì)石榴葉斑病病菌SY1的抑制效果圖

三 討論

（一）化學(xué)農(nóng)藥抑菌作用

1.同種藥劑對(duì)不同病原菌引起的石榴病害的防治效果

楊麗芬等[23]報(bào)道了由球毛殼菌 (Chaetomium globosum) 引起的石榴葉斑病使用濃度為13.33μg·mL-1，80%的甲基硫菌靈抑制率達(dá)100%；而筆者使用甲基硫菌靈抑制由擬盤多毛孢菌(P.eriobotryfolia)引起的石榴葉斑病抑制率約為14.9%，說明病原菌不同導(dǎo)致化學(xué)農(nóng)藥的抑菌效果有差異。白海燕等[24]人報(bào)道由厚盤單毛孢（Monochaetia pachyspora）引起的石榴葉斑可用50%多菌靈1000倍液進(jìn)行防治。而筆者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明多菌靈的抑菌率約為13.3%，抑菌效果差，造成這一差異的原因可能是病原菌不同、地域差異及抗藥性產(chǎn)生。2017年土耳其地中海石榴種植園內(nèi)發(fā)現(xiàn)由膠孢炭疽菌（Colletotrichium gloeosporioides）引起的炭疽病，此文獻(xiàn)未提及化學(xué)農(nóng)藥防治[25]。2013年云南省建水植保站的張榮勝曾在《致富天地》期刊上報(bào)道過石榴葉斑病又稱為黑斑病、褐斑病、角斑病，此文獻(xiàn)未提及病原菌[26]。李廣強(qiáng)等[27]報(bào)道由石榴生尾孢霉菌(Cercospora punicae)侵染引起的石榴黑斑病可用80%退菌特可濕性粉劑600-800倍液防治，說明引起石榴葉斑病的病原菌至少有5種，同種農(nóng)藥對(duì)不同病原菌的抑制效果不同，在防治時(shí)要根據(jù)病原菌的種類來選擇最佳農(nóng)藥進(jìn)行防治。

2.同種藥劑對(duì)擬盤多毛孢菌的抑制效果

管斌等[28]報(bào)道25%咪鮮胺乳油對(duì)引起紅葉石楠葉斑病病原菌小孢擬盤多毛孢 (Pestalotiopsis microspora) 的抑菌率達(dá)到71.11%；溫浩[29]報(bào)道可將咪鮮胺作為草莓棒孢擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）葉斑病化學(xué)防治的推薦藥劑；姜琬[30]報(bào)道25%咪鮮胺乳油的833倍液對(duì)枇杷擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsis eriobotrifolia）引起的枇杷灰斑病的防效最佳，抑制率達(dá)83.08%；筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明咪鮮胺對(duì)擬盤多毛孢菌(Pestalotiopsis.sp.)引起的石榴葉斑病的抑制效果高達(dá)100%。說明咪鮮胺對(duì)擬盤多毛屬均有抑制作用。

（二）木霉菌株抑菌作用

在大力防控農(nóng)藥殘留的局勢(shì)下，生物防治越來越受到重視，魯海菊等[31]報(bào)道，木霉菌株對(duì)枇杷根腐病病菌有抑制作用；張婷等[32]人報(bào)道了木霉種衣劑包衣玉米種子對(duì)玉米彎孢霉葉斑病菌有抑制作用；茆振川[33]等人報(bào)道木霉菌抑制蘋果輪紋病菌。但篩選木霉菌株抑制石榴葉斑病尚屬首次。在響應(yīng)綠色環(huán)保的主題下采用綜合防治是關(guān)鍵，通過木霉與化學(xué)農(nóng)藥混配后的協(xié)同作用來降低藥劑施用劑量和次數(shù)，從而達(dá)到有效防治病害。段銀芝等[34]報(bào)道了吡蟲啉、咪唑乙煙酸、咪唑煙酸對(duì)哈茨木莓菌的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢具有促進(jìn)作用。田連生等[35]報(bào)道了木霉菌株與多菌靈混配后施用，對(duì)灰霉病的防治具有協(xié)同增效作用。仁鳳山[36]研究表明防治蘋果輪紋病采用2000倍液的中生菌素與T2木霉菌混配起到增效作用。魯海菊等[37]人報(bào)道紫外線誘變能夠提高木霉菌株的耐藥性，從而減少殺菌劑對(duì)木霉菌株的影響，具有針對(duì)性的進(jìn)行防治。在未來的發(fā)展中大量投入綜合防治也是打造綠色防控的關(guān)鍵。

除上述文獻(xiàn)之外，我們同組組員的研究結(jié)果顯示：丙環(huán)唑?qū)M盤多毛孢菌(Pestalotiopsissp.)引起的石榴葉斑病和鏈格孢菌（Alternaria）引起的石榴褐斑病抑制效果最好，抑制率均達(dá)100%，說明丙環(huán)唑具有廣譜性，這也給不能正確辨別致病病原菌的農(nóng)戶提供便利，一種農(nóng)藥可以防治不同病害，大大降低了成本。PZ1三唑酮菌株對(duì)上述兩種病原菌抑制率均高于50%，開發(fā)利用前景廣闊，可作為大田防治的備選菌種資源。菌-藥復(fù)配的增效作用能減少化學(xué)農(nóng)藥使用量，降低多年生植株的抗藥性。故抗藥性木霉PZ1菌株與咪鮮胺、丙環(huán)唑2種農(nóng)藥復(fù)配對(duì)石榴葉斑病的抑制效果將是下一步研究的方向。

綜上知，準(zhǔn)確識(shí)別診斷病害，選擇合適的藥劑能夠有效防治病害，迄今為止，對(duì)石榴病害的防治，學(xué)者們也篩選出了許多有效農(nóng)藥，但大多都集中在單劑藥劑對(duì)病原菌抑制的研究上，至于化學(xué)農(nóng)藥與生物農(nóng)藥混配使用的研究報(bào)道少之又少，這也將是后續(xù)研究的一個(gè)方向。