益氣化瘀清熱方及其拆方對(duì)IgA腎病大鼠蛋白尿、血尿及其血生化的影響

趙永旺，何改麗，翟文生

（河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000）

IgA 腎?。↖gA nephropathy，IgAN）又叫Berger 病，1968年Berger在人體腎活檢術(shù)后應(yīng)用免疫技術(shù)第一次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道本病。該病是一種原發(fā)性腎小球疾病，臨床特點(diǎn)表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的鏡下或肉眼血尿，病理特點(diǎn)表現(xiàn)主要是在腎小球系膜區(qū)IgA 明顯沉積。亞洲是IgAN 的高發(fā)區(qū)，東亞、東南亞等地域發(fā)病率約為30%～40%［1］，明顯高于歐美區(qū)域。我國(guó)也是IgAN 的高發(fā)區(qū)。益氣化瘀清熱方是臨床治療IgAN 的經(jīng)驗(yàn)方，本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行拆方，研究各類藥物對(duì)IgAN 大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、尿蛋白定量及腎臟病理的作用強(qiáng)度，并觀察其安全性，為臨床辨證用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及藥物

益氣化瘀清熱方（黃芪、黨參、丹參、水蛭、黃芩、蒲公英）及雷公藤多苷片均購(gòu)買于河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診藥房。

牛血清白蛋白（BSA）、脂多糖（LPS）由北京索萊寶科技有限公司提供Sigma 進(jìn)口分裝；四氯化碳（CCL4，批號(hào)：Y76222，山東西亞化工有限公司）；生化檢測(cè)于我院兒科實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 造模與分組

SPF級(jí)雄性Wistar大鼠165只，體質(zhì)量180～210 g，山東魯抗有限公司提供［SCXK（魯）20130001］。動(dòng)物飼料為標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料［合格證號(hào)：蘇飼證（2014）01008，江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司］，自由喂養(yǎng)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度嚴(yán)格按河南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)定設(shè)置。適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按隨機(jī)分配原則分為11組，每組15只，分別為空白組、模型組、益氣組、化瘀組、清熱組、復(fù)方組、雷公藤多苷組（GTW 組）、益氣高劑量組（益高組）、化瘀高劑量組（化高組）、清熱高劑量組（清高組）和復(fù)方高劑量組（復(fù)高組）。參考陸慧瑜等［2］及GUO 等［3］報(bào)道的IgAN 造模方法，即BSA +CCL4+LPS 的實(shí)驗(yàn)方法制備IgAN 模型，隔日灌服BSA（以蒸餾水配成100 g/L），隔天灌胃400 mg/kg，連續(xù)8周；皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCL40.1 mL，1周1次，連續(xù)9 周；LPS以氯化鈉溶液配成0.25 g/L，第6周尾靜脈注射0.25 mg/kg?？瞻捉M給予等量蒸餾水隔日灌胃，皮下注射氯化鈉溶液0.4 mL，第6 周等量尾靜脈注射氯化鈉溶液。

1.3 給藥方法

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)大鼠的具體給藥量計(jì)算方法按照大鼠與人的換算公式進(jìn)行［4］。益氣化瘀清熱方：黃芪30 g，黨參15 g，丹參20 g，水蛭3 g，黃芩10 g，蒲公英15 g；雷公藤多苷片1 mg/kg。大鼠灌胃量為1 mL/100 g。益氣組每毫升含黃芪0.3 g，黨參0.15 g；化瘀組每毫升含丹參0.2 g，水蛭0.03 g；清熱組每毫升含黃芩0.1 g，蒲公英0.15 g；復(fù)方組配制為所有生藥濃度混合；雷公藤多苷組0.6 g/mL，高劑量組為藥物濃度提高4 倍?？瞻捉M、模型組給予等量蒸餾水灌胃，頻次同前。

1.4 觀察指標(biāo)及測(cè)定方法

1.4.1 尿紅細(xì)胞及24 h UTP檢測(cè)

各組大鼠于實(shí)驗(yàn)的第0、2、4、6、8、10、12 周末時(shí)，收集3 h和24 h尿液，應(yīng)用尿沉渣計(jì)數(shù)法檢測(cè)尿紅細(xì)胞個(gè)數(shù)，應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定24 h尿蛋白定量。

1.4.2 生化指標(biāo)檢測(cè)

第12 周末時(shí)，待留取完尿液，各組大鼠取血，采用腹主靜脈取血法；取血完畢后用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、AST、ALB、TP、BUN、Cr、TG及TCH的含量。

1.4.3 腎組織病理

第12 周末收集完大鼠血液樣本后剖取腎皮質(zhì)，進(jìn)行PAS 染色及免疫熒光IgA 檢測(cè)。病理分級(jí)參照國(guó)內(nèi)IgAN 病理Ⅴ級(jí)分類標(biāo)準(zhǔn)，免疫熒光IgA 強(qiáng)度的判定參照五級(jí)半定量法。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)量資料用±s表示，組間差異采用單因素方差分析（oneway ANOVA）－LSD 法，以P <0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各治療組對(duì)大鼠尿紅細(xì)胞數(shù)、24 h UTP的影響

從第6 周末開(kāi)始，各造模組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯升高，并且呈持續(xù)進(jìn)展。第12 周末時(shí)，模型組大鼠尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)仍持續(xù)升高，但沒(méi)有出現(xiàn)肉眼血尿。①與模型組比較，其余各治療組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。②與GTW 組比較，復(fù)高組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)下降最明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）。③復(fù)高組與化高組、清高組、益高組比較，尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）；益高組與化高組、清高組比較，尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.01）；化高組與清高組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。④復(fù)方組與化瘀組、清熱組、益氣組比較，尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）；益氣組尿紅細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高，與其他三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；化瘀組與清熱組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑤高劑量組與低劑量組比較，表達(dá)均增強(qiáng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)尿紅細(xì)胞數(shù)比較（±s，個(gè)/HP）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)尿紅細(xì)胞數(shù)比較（±s，個(gè)/HP）

注：與空白組比較，★P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與益氣組比較，△P<0.01；與化瘀組比較，◇P<0.01；與清熱組比較，■P<0.01；與復(fù)方組比較，●P<0.01；與GTW組比較，■P<0.01；與益高組比較，◆P<0.01；與化高組比較，#P<0.01；與清高組比較，dP<0.01；與復(fù)高組比較，eP<0.05。

組別空白組模型組益氣組化瘀組清熱組復(fù)方組GTW組益高組化高組清高組復(fù)高組n 12 10 9 10 8 9 10 11 11 10 9 0周1.08±1.00 1.40±0.84 1.44±1.01 1.10±1.00 1.13±0.99 0.89±0.78 1.40±0.84 1.36±0.92 1.00±1.00 1.40±0.97 1.33±1.00 2周1.25±0.97 1.20±0.92 1.33±1.23 1.30±1.16 1.50±1.07 1.33±1.23 1.30±1.16 1.18±0.98 1.36±1.03 1.20±1.03 1.89±1.05 4周1.17±1.03 1.30±0.95 2.00±1.12 1.40±1.08 2.00±0.76 1.67±1.00 1.80±0.92 1.73±0.91 1.55±1.04 1.50±1.18 1.56±1.01 6周1.33±1.07 14.30±2.45★14.67±3.04★14.90±1.91★14.38±2.62★14.22±2.77★14.90±2.51★15.18±0.98★14.18±1.83★15.10±2.73★15.56±2.01★8周1.75±1.42 24.20±2.25★25.33±2.00★24.50±1.27★24.88±2.80★24.11±2.52★25.40±1.71★25.00±3.03★24.91±2.55★24.60±1.51★23.89±2.57★10周1.42±1.16 34.40±2.22★34.33±1.58★■e 34.20±2.10★■e 33.25±2.38★■e 32.56±2.55★■e 14.30±2.91★▲33.64±1.69★■e 33.64±1.75★■e 32.90±2.51★■e 12.22±1.39★▲12周1.75±1.14 43.90±2.33★32.89±2.15★▲19.00±4.16★▲△19.50±1.60★▲△12.22±1.99★▲△◇■2.17±1.18▲△◇■●17.45±1.75★▲△◇b●■11.64±1.80★▲△◇■■◆10.70±1.64★▲△◇■■◆2.00±1.12▲△◇■●◆#d

從第6 周末開(kāi)始，各造模組大鼠24 h UTP 明顯升高，并且呈現(xiàn)持續(xù)進(jìn)展。第12 周末時(shí)，模型組大鼠24 h UTP仍持續(xù)升高。①與空白組比較，復(fù)高組、雷公藤多苷組尿蛋白定量無(wú)明顯差異，兩組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。②與復(fù)高組比較，化高組、清高組、益高組24 h UTP 偏高（P<0.01）；其中化高組與清高組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），益高組24 h UTP最高，與其他各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。③與復(fù)方組比較，化瘀組、清熱組、益氣組24 h UTP 均偏高（P<0.01）；其中化瘀組與清熱組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），益氣組24 h UTP 最高，與其他各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.01）。④高劑量組與低劑量組比較，表達(dá)均增強(qiáng)（P<0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h UTP定量比較（±s，mg/24 h）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)24 h UTP定量比較（±s，mg/24 h）

注：與空白組比較，★P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01；與益氣組比較，△P<0.01；與化瘀組比較，◇P<0.01；與清熱組比較，■P<0.01；與復(fù)方組比較，●P<0.01；與GTW組比較，■P<0.01；與益高組比較，◆P<0.01；與化高組比較，#P<0.01；與清高組比較，dP<0.01；與復(fù)高組比較，eP<0.01。

組別空白組模型組益氣組化瘀組清熱組復(fù)方組GTW組益高組化高組清高組復(fù)高組n 12 10 9 10 8 9 10 11 11 10 9 0周2.63±0.58 2.80±0.40 2.68±0.59 2.49±0.59 2.95±0.41 2.76±0.56 2.82±0.77 2.83±0.42 2.83±0.70 2.52±0.42 2.54±0.42 2周2.87±0.34 2.99±0.32 3.05±0.46 3.12±0.49 3.08±0.41 3.18±0.33 3.19±0.41 3.16±0.43 3.14±0.50 3.11±0.42 3.21±0.23 4周3.09±0.31 3.19±0.16 3.16±0.36 3.27±0.40 3.22±0.32 3.30±0.26 3.26±0.30 3.29±0.38 3.31±0.27 3.27±0.36 3.36±0.24 6周2.98±0.32 10.70±0.35★10.74±0.65★10.53±0.55★10.46±0.45★10.90±0.60★10.71±0.39★10.67±0.55★10.53±0.41★10.85±0.48★10.68±0.62★8周3.12±0.43 14.01±0.59★14.22±0.73★14.18±0.83★14.59±0.30★14.49±0.64★14.27±0.82★14.04±0.67★14.26±0.79★14.21±0.92★14.14±0.81★10周3.17±0.34 17.92±0.84★17.98±0.71★■e 18.08±0.76★■e 18.43±0.63★■e 17.88±0.47★■e 11.23±0.97★▲17.90±0.48★■e 18.22±0.75★■e 17.96±0.80★■e 10.77±0.59★▲12周3.16±0.43 20.20±0.69★18.50±0.62★▲9.94±0.63★▲△9.98±0.53★▲△7.93±0.52★▲△◇■3.53±0.38▲△◇■●11.58±0.51★▲△◇■●■8.53±0.40★▲△◇■■◆8.31±0.38★▲△◇■■◆3.44±0.38▲△◇■●◆#d

2.2 各治療組對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響

各組大鼠的ALB、TP、BUN、Cr、TG 及TCH 之間無(wú)差異；雷公藤多苷組ALT、AST明顯升高，與其他各組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；其他各組間無(wú)明顯差異。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠血生化指標(biāo)比較（±s）

表3 各組大鼠血生化指標(biāo)比較（±s）

注：與空白組比較，★P<0.01；與模型組比較，▲P<0.01。

組別空白組模型組益氣組化瘀組清熱組復(fù)方組GTW組益高組化高組清高組復(fù)高組n 12 10 9 10 8 9 10 11 11 10 9 TP（g/L）67.86±0.75 67.70±0.66 67.81±0.66 67.90±0.57 68.05±0.36 68.07±0.99 67.93±0.59 67.80±0.71 67.83±0.68 67.86±0.68 68.18±0.74 ALB（g/L）24.86±1.17 25.39±0.97 24.63±1.56 24.91±1.36 25.19±1.00 24.35±1.13 24.89±1.33 25.19±1.14 24.61±0.90 24.56±0.97 25.30±0.99 ALT（U/L）53.16±5.61 48.40±7.49 49.77±5.68 48.77±6.69 48.70±6.31 47.74±6.51 94.19±7.28★▲49.64±5.18 50.40±5.16 50.17±6.16 52.51±6.28 AST（U/L）110.30±5.98 112.08±4.76 112.41±4.88 112.32±6.36 109.96±4.32 110.68±5.31 161.70±4.23★▲110.41±4.65 111.01±5.14 113.65±5.29 112.77±3.00 BUN（mmol/L）4.79±0.15 4.80±0.12 4.86±0.11 4.81±0.16 4.86±0.10 4.83±0.10 4.87±0.09 4.85±0.10 4.87±0.07 4.88±0.11 4.80±0.11 Cr（μmol/L）40.48±1.98 41.29±2.65 40.27±2.19 39.74±1.58 39.63±1.82 40.22±1.62 39.61±2.42 39.37±2.84 39.78±2.56 39.37±2.19 40.30±2.23 TCH（mmol/L）1.62±0.03 1.64±0.06 1.63±0.05 1.63±0.05 1.62±0.04 1.66±0.06 1.64±0.05 1.63±0.05 1.65±0.03 1.66±0.06 1.63±0.04 TG（mmol/L）1.03±0.13 1.00±0.16 1.04±0.14 1.05±0.13 0.98±0.14 0.96±0.16 0.94±0.13 1.01±0.17 1.00±0.12 1.06±0.15 1.06±0.12

2.3 各治療組對(duì)大鼠腎臟病理的影響

空白組腎臟病理及免疫熒光均陰性。模型組病理表現(xiàn)主要為Ⅱ～Ⅲ級(jí)病變，體現(xiàn)在系膜細(xì)胞輕至中度增生，同時(shí)伴有基質(zhì)的輕至中度增寬；免疫熒光鏡下見(jiàn)系膜區(qū)顆粒或塊狀結(jié)構(gòu)的IgA 沉積，強(qiáng)度以（+++）為主。各實(shí)驗(yàn)組中，益氣組病理表現(xiàn)與模型組基本相同，其余各組病變程度均較模型組輕，病理改變以Ⅰ～Ⅱ級(jí)病變?yōu)橹?，系膜?xì)胞輕度增生，基質(zhì)輕度增寬；免疫熒光鏡下見(jiàn)系膜區(qū)IgA 表達(dá)強(qiáng)度較模型組明顯減弱，熒光強(qiáng)度以（+）～（++）為主。

3 討論

建立理想的動(dòng)物模型對(duì)研究IgAN 有重要的意義，目前國(guó)內(nèi)外建造模型的方法大概分為免疫誘導(dǎo)、繼發(fā)病變、自發(fā)病變和糖基因缺陷［5］，其中免疫誘導(dǎo)型因造模要求技術(shù)及成本相對(duì)較低、動(dòng)物存活率相對(duì)較高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好、癥狀與人類相似性高等優(yōu)點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)目前最常應(yīng)用的造模方法。本次實(shí)驗(yàn)中，參考陸慧瑜等［2］及WEI 等［3］報(bào)道的IgAN 造模方法，采用BSA +CCL4+LPS 的造模法。實(shí)驗(yàn)中首先給大鼠灌服一種免疫原BSA，配合尾靜脈注射免疫佐劑LPS，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，形成抗原-抗體復(fù)合物；再給予CCl4皮下注射，減少肝臟對(duì)IgA 的清除能力，同時(shí)劑量減至誘導(dǎo)肝纖維化劑量的1/3，減少對(duì)肝臟的損害。本實(shí)驗(yàn)中，模型組和各治療組大鼠于造模的第1～9 周均有不同程度的精神萎靡、活動(dòng)、飲食減少、鼠毛蓬亂，于皮下注射CCL4后更為明顯；部分大鼠注射處出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)，甚至潰瘍、皮毛脫落；部分大鼠在皮下注射CCL4后出現(xiàn)腹瀉癥狀，此種情況持續(xù)3～5 d 后可自行緩解。在造模的第6 周通過(guò)尾靜脈注射LPS 后，大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)不振，活動(dòng)度減弱，喜臥，飲食水情況變差，鼠毛灰暗無(wú)澤，注射第2 天上述情況最明顯，該狀況持續(xù)1 周左右緩慢好轉(zhuǎn)。在造模過(guò)程中，各組大鼠均有因灌胃、脂多糖尾靜脈注射后或意外出現(xiàn)死亡情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)各組有效大鼠數(shù)量：空白組12只，模型組10只，益氣組9 只，化瘀組10 只，清熱組8 只，復(fù)方組9 只，GTW 組10 只，益高組11 只，化高組11 只，清高組10 只，復(fù)高組9只。

方東行等［6］通過(guò)文獻(xiàn)研究分析發(fā)現(xiàn)，本病治療多采用中西醫(yī)結(jié)合療法，在西藥治療的基礎(chǔ)上結(jié)合中醫(yī)辨證論治，臨床效果明確，但標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一。趙明明等［7］通過(guò)研究2 683 例IgA 腎病患者臨床特征與中西藥聯(lián)合應(yīng)用分析發(fā)現(xiàn)，活血化瘀劑在臨床中應(yīng)用廣泛；呂靜等［8］研究發(fā)現(xiàn)，芪薊腎康顆?？偠嗵强梢燥@著降低IgAN 模型大鼠尿紅細(xì)胞和尿蛋白定量，而芪薊腎康顆粒具有解毒、化瘀的功效；張惜燕等［9］通過(guò)總結(jié)IgAN病因病機(jī)發(fā)現(xiàn)，濕熱瘀毒既是本病病理產(chǎn)物，又是使病情惡化加重的病理因素。

翟文生教授通過(guò)三十余年的臨床實(shí)踐認(rèn)識(shí)到，本病病機(jī)為正虛邪實(shí)，實(shí)邪以熱、毒、濕、瘀為主，是誘發(fā)和加重本病的始動(dòng)因素，在治療中占重要地位，故在治療中多以清熱解毒、活血化瘀之法［10］。益氣化瘀清熱方是翟教授臨床治療IgAN 常用方，由黃芪、黨參、丹參、水蛭、黃芩、蒲公英組成，該方益氣、化瘀與清熱并用，扶正與祛邪兼顧。方中黃芪、黨參益氣健脾生津、補(bǔ)益中氣；丹參、水蛭活血行血祛瘀；黃芩、蒲公英清熱解毒燥濕?，F(xiàn)代藥理研究表明，黃芪、黨參均有提高免疫力的作用［11］，黃芪有效組分還可抑制腎小管上皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞增生，進(jìn)而保護(hù)腎臟［12］；丹參能改善高血脂，降低蛋白尿，水蛭可促進(jìn)血液循環(huán)、抗凝、抗血小板聚集、降血脂；黃芩能抑制過(guò)敏性炎癥滲出，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)、抗炎作用；蒲公英能增強(qiáng)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，并能改善機(jī)體高凝及高脂血癥的狀態(tài)。全方共奏清熱解毒、活血化瘀，兼益氣固腎之功。

在前期的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，翟教授成功制作足細(xì)胞、系膜細(xì)胞損傷模型，在此基礎(chǔ)上，證實(shí)益氣化瘀清熱方及其拆方對(duì)體外培養(yǎng)的足細(xì)胞TRPC6 及Podocin、Podoc?alyxin 的mRNA 及蛋白表達(dá)有肯定影響［13-14］，對(duì)體外培養(yǎng)的系膜細(xì)胞凋亡及NF-κB mRNA 及蛋白的表達(dá)有肯定影響［15-16］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)拆方，把益氣法、化瘀法、清熱法分別作用于IgAN 模型大鼠。通過(guò)實(shí)驗(yàn)筆者發(fā)現(xiàn)，治療后各組血尿、蛋白尿較模型組均有下降，其中復(fù)高組作用最強(qiáng)，益氣組作用最弱，復(fù)方組作用強(qiáng)于化瘀組和清熱組，化瘀組和清熱組作用強(qiáng)于益氣組，復(fù)高組作用強(qiáng)于化高組和清高組，化高組和清高組作用強(qiáng)于益高組，各組藥物高劑量作用強(qiáng)于低劑量。因此通過(guò)本實(shí)驗(yàn)筆者得出，“熱邪”“血瘀”在IgAN 發(fā)生發(fā)展中有重要作用，臨床中運(yùn)用清熱解毒、活血化瘀法有重要意義。