鎘脅迫下兩株產(chǎn)鐵載體/解磷菌株對(duì)黑麥草種子萌發(fā)及幼苗積累鎘的影響

李美芳，張 平，李 倩，廖柏寒，彭佩欽，李 靖，梅金星

（中南林業(yè)科技大學(xué) a.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；b.稻米品質(zhì)安全控制湖南省工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

自改革開放以來，我國(guó)經(jīng)濟(jì)得到快速發(fā)展，但發(fā)展的同時(shí)也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境問題，其中土壤重金屬污染形勢(shì)嚴(yán)峻。鎘元素作為強(qiáng)毒性的重金屬元素，易被作物吸收積累，并通過食物鏈遷移至人體內(nèi)，威脅到植物的生長(zhǎng)發(fā)育和人類的生命健康，且重金屬鎘不能被生物降解，生物半衰期較長(zhǎng)且具有累積效應(yīng)[1-2]。有資料顯示，全國(guó)土壤環(huán)境狀況總體不容樂觀，其中鎘的點(diǎn)位超標(biāo)率達(dá)到7.0%[3]。這一現(xiàn)狀引起了人們的廣泛關(guān)注。因此，如何修復(fù)鎘污染土壤已經(jīng)成為世界的熱點(diǎn)問題之一。

傳統(tǒng)的土壤重金屬污染修復(fù)技術(shù)有物理法、化學(xué)法、生物法等措施。常規(guī)的物理化學(xué)法雖然治理質(zhì)量與處理效率較高，但工藝復(fù)雜，費(fèi)用高，還可能導(dǎo)致土壤退化，破壞土壤生物多樣性[4-6]。生物法主要分為植物修復(fù)和微生物修復(fù)兩種方法，其中，植物修復(fù)技術(shù)因具有原位修復(fù)、無二次污染、投資費(fèi)用低、適合大面積處理重金屬污染土壤等特點(diǎn)成為一種新興的具有廣闊應(yīng)用前景的綠色環(huán)保技術(shù)[7-8]。但植物特別是超積累植物有許多限制性因素，如種類少，只能積累單一重金屬；生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，容易受到外界條件的影響，導(dǎo)致修復(fù)效率不高等[9-10]。而植物-微生物聯(lián)合技術(shù)有望可以解決這些限制性因素，其中微生物中的植物根際促生菌能夠通過產(chǎn)生鐵載體、溶解無機(jī)磷等方式促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的耐受能力，提高植物修復(fù)重金屬污染土壤的效率[11]。微生物產(chǎn)生的鐵載體不僅能夠與鐵發(fā)生螯合作用，也能螯合鋁、鎘、鋅、銅等重金屬，形成重金屬-鐵載體螯合物[12]。目前，關(guān)于產(chǎn)鐵載體菌對(duì)重金屬污染土壤的調(diào)控已有研究，如張璐等[13]通過在甜高粱中接種產(chǎn)鐵載體細(xì)菌T07 后發(fā)現(xiàn)，該菌促進(jìn)了甜高粱對(duì)銅、鋅和鎘3 種重金屬的吸收，接種后地上部分銅、鋅和鎘含量分別比未接種的甜高粱提高了22.1%、26.7%和21.6%；王東升等[14]從龍葵根際土壤篩選出的2 株產(chǎn)鐵載體菌T1、T2 可促進(jìn)龍葵根系土壤難溶性形態(tài)鎘向可交換態(tài)鎘的轉(zhuǎn)化，提高龍葵對(duì)土壤鎘的吸收；除此之外，Sinha 等[15]的研究發(fā)現(xiàn)，接種產(chǎn)鐵載體菌株P(guān)seudomonas aeruginosaKUCd1 使得西葫蘆Cucurbita pepo地下部分和地上部分鎘的含量分別降低了59.2%和4.4%。另外，解磷微生物也是根際促生菌的重要組成部分，如Jeong 等[16]通過在芥菜上接種解磷細(xì)菌Bacillus aryabhattai和Bacillus megaterium后，提高了土壤中鎘的生物有效性，提高了芥菜對(duì)重金屬鎘的修復(fù)效率。

黑麥草Lolium perenne為一年生禾本科牧草，生長(zhǎng)迅速，覆蓋力強(qiáng)，須根發(fā)達(dá)，生長(zhǎng)在土壤表層，能夠改善土壤的物理結(jié)構(gòu)，其對(duì)高溫、嚴(yán)寒和干旱環(huán)境都具有一定的適應(yīng)性[17]。有研究表明，黑麥草對(duì)重金屬污染土壤有一定的潛在修復(fù)能力，能對(duì)重金屬產(chǎn)生抗性和富集作用[18]。關(guān)于黑麥草修復(fù)重金屬污染土壤已有大量的研究：Guo 等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，接種耐鎘的植物根際促生細(xì)菌到黑麥草上，可以降低鎘的毒害作用，提高黑麥草對(duì)鎘的富集；馮海艷等[20]通過盆栽實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，接種叢枝菌根（AM）真菌促進(jìn)了黑麥草對(duì)重金屬鎘的吸收，強(qiáng)化了鎘在根系中的固持作用。

綜上所述，這些產(chǎn)鐵載體菌或溶磷功能菌能夠調(diào)控植物對(duì)土壤重金屬的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)，但菌種不同，其特性可能不同，其與植物結(jié)合可能表現(xiàn)出不同的促生性能。迄今，鮮見有利用同時(shí)具有產(chǎn)鐵載體和溶磷特性的真菌與黑麥草聯(lián)合修復(fù)重金屬鎘污染土壤的研究報(bào)道。因此，本研究以實(shí)驗(yàn)室自主分離的兩株兼具上述特性的菌株ZR1、rL1 為試驗(yàn)菌株，在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，對(duì)菌株ZR1、rL1 進(jìn)行了分子生物學(xué)鑒定及促生性能指標(biāo)檢測(cè)，同時(shí)研究其在不同質(zhì)量濃度的鎘脅迫下對(duì)黑麥草的發(fā)芽率、根長(zhǎng)、株高、生物量及積累轉(zhuǎn)運(yùn)鎘的影響，以期探明兩株根際促生菌對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)及吸收遷移鎘的作用，為后續(xù)的鎘污染土壤的微生物-植物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌 株

從中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)樓旁的一株紫葉李的根際土壤中分離得到菌株。對(duì)菌株ZR1、rL1 進(jìn)行鑒定，將其測(cè)序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST 比對(duì)，菌株ZR1 與Trichoderma yunnanense的同源性達(dá)到100%，菌株rL1 與Aspergillus niger的同源性達(dá)到100%。選取與菌株ZR1、rL1 同源性相近的菌株，用軟件MEGA5.05 采用鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹，初步鑒定ZR1 為云南木霉菌Trichoderma yunnanense，rL1 為黑曲霉菌Aspergillus niger。對(duì)ZR1、rL1 菌株的產(chǎn)鐵載體能力和溶磷能力進(jìn)行測(cè)定[21]，結(jié)果如表1所示。

表1 菌株的促生能力檢測(cè)指標(biāo)?Table 1 Indicators of strains growth promoting ability

1.1.2 供試黑麥草品種

進(jìn)口多年生黑麥草種子購(gòu)自江蘇尚東種業(yè)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

菌種活化采用PDA 固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，超純水1 000 mL，自然pH值。采用上述不添加瓊脂的液體培養(yǎng)基制備菌懸液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化與菌懸液的制備

將4℃低溫保存的ZR1 和rL1 菌株分別接種于PDA 固體培養(yǎng)基上，在生化培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)3～5 d，之后再挑取菌絲轉(zhuǎn)入至含100 mL 液體培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中，放于搖床中于28℃、150 r·min-1條件下持續(xù)培養(yǎng)3～5 d，離心，用無菌水收獲菌體于250 mL 滅菌錐形瓶中，制備成菌懸液，并提取1 mL 菌懸液進(jìn)行稀釋，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)[22]菌懸液的濃度（2×108個(gè)·mL-1），然后依次稀釋成50、100 倍，其中ZR1 的2 組分別以ZR1-1、ZR1-2 表示，rL1 的2 組分別以rL1-1、rL1-2 表示。

1.2.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

試驗(yàn)共設(shè)5 組處理，其中4 組為染菌處理，包括ZR1-1、ZR1-2、rL1-1、rL1-2，另設(shè)1 組對(duì)照組，即不染菌處理，以CK 表示。每組處理設(shè)4 個(gè)鎘處理質(zhì)量濃度，分別為0、1、5、10 mg·L-1（以CdCl2·2.5H2O 配制）。具體的染菌或不染菌鎘溶液配制如下：

1）染菌鎘溶液：分別用以上制得的不同稀釋倍數(shù)的ZR1 菌劑或rL1 菌劑配制鎘質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10 mg·L-1的染菌溶液，以只加ZR1菌劑或rL1 菌劑作為對(duì)照，備用。

2）不染菌鎘溶液：分別以去離子水配制鎘質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10 mg·L-1的不染菌溶液，備用。

選取大小一致、籽粒飽滿的黑麥草種子，用30%的雙氧水浸泡種子10 min，再用無菌水反復(fù)沖洗后，將種子濾干于超凈工作臺(tái)，待用。之后采用濾紙發(fā)芽床法進(jìn)行種子萌發(fā)，將黑麥草種子整齊排列在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)皿中放入80 粒，然后加入上述染菌或不染菌鎘溶液10 mL，完全浸潤(rùn)種子。之后，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)條件為：光照16 h，黑暗8 h，溫度26℃。每天加入無菌水以保持種子濕潤(rùn)。所有處理重復(fù)3 次。

1.2.3 黑麥草樣品的采集與指標(biāo)的測(cè)定

黑麥草種子經(jīng)光照培養(yǎng)7 d 后，以各處理中最低發(fā)芽株數(shù)（49 株）進(jìn)行取樣，取樣時(shí)將整株黑麥草洗凈晾干，測(cè)量株高、根長(zhǎng)，然后將根系和莖葉部分分開，分別稱其鮮質(zhì)量，70℃干燥2 h，再次稱其干質(zhì)量。之后，將黑麥草的根系與莖葉部分加入濃硝酸并在電熱板上濕式消解后，過濾定容至25 mL，采用火焰原子吸收分光光度計(jì)（ICE-3500，Thermo 公司，美國(guó)）測(cè)定濾液中鎘的質(zhì)量濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Microsoft Excel 2007 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，文中數(shù)據(jù)為3 個(gè)重復(fù)樣的平均值。采用顯著性F測(cè)驗(yàn)和Duncan 多重比較法（P＜0.05）分析各處理間的差異，圖采用OriginPro 8.0 軟件進(jìn)行處理。

其中，鎘的積累量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)公式為：

鎘積累量=鎘含量×相應(yīng)器官的干質(zhì)量；

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)=莖葉部鎘含量/根系鎘含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)黑麥草種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為0～10 mg·L-1時(shí)，在CK 處理和ZR1 處理下，黑麥草種子的發(fā)芽率在91.67%～96.67%范圍內(nèi)波動(dòng)，不同鎘質(zhì)量濃度處理間無顯著性差異（P＞0.05）；rL1 處理的發(fā)芽率均隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高呈逐漸下降的趨勢(shì)，且在相同脅迫質(zhì)量濃度下，與CK 處理或ZR1 處理間存在顯著性差異（P＜0.05）（除了脅迫質(zhì)量濃度為0 mg·L-1、rL1-2 處理外）。從表2可以看出，不染菌時(shí)，鎘脅迫對(duì)黑麥草的株高無顯著影響（P＞0.05）；在ZR1 處理下，株高隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高呈下降的趨勢(shì)，特別是當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時(shí)，ZR1-1 處理的株高顯著低于對(duì)照（P＜0.05）；在rL1 處理下，隨著鎘脅迫的加重，株高也是持續(xù)下降，但與相應(yīng)脅迫質(zhì)量濃度下的CK 處理相比，均沒有顯著性差異（P＞0.05）。

圖1 不同處理對(duì)黑麥草種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effects of different treatments on germination rate of Lolium perenne seeds

表2顯示，在0～10 mg·L-1的鎘脅迫下，接種ZR1、rL1 菌株均能促進(jìn)黑麥草根系生長(zhǎng)（除脅迫質(zhì)量濃度為0 mg·L-1、ZR1 處理外）。與同質(zhì)量濃度的CK 處理相比，ZR1-1、ZR1-2、rL1-1、rL1-2 處理的根長(zhǎng)分別提高了40.00%～100.66%、100.66%～125.34%、55.74%～143.62%、66.56%～103.22%；且鎘脅迫質(zhì)量濃度≥1 mg·L-1時(shí)，ZR1的兩個(gè)處理均達(dá)到顯著性水平（P＜0.05）；對(duì)于rL1 處理，當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度≤1 mg·L-1時(shí)，rL1-1 處理的影響顯著（P＜0.05）；當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為0～10 mg·L-1時(shí)，rL1-2 處理的影響均顯著（P＜0.05）。

表2顯示，對(duì)于同一處理，在脅迫質(zhì)量濃度為0～10 mg·L-1下，隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高，CK 處理的根系鮮質(zhì)量和莖葉鮮質(zhì)量均呈下降趨勢(shì)；而接種ZR1 菌株的根系鮮質(zhì)量和莖葉鮮質(zhì)量基本呈上升的趨勢(shì)（除脅迫質(zhì)量濃度為0 mg·L-1，ZR1-1 處理外）；接種rL1 菌株則與CK 處理表現(xiàn)出一致性。與相應(yīng)脅迫濃度下的CK 處理相比，當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度＞1 mg·L-1時(shí)，接種ZR1 菌株基本能提高植株的根系鮮質(zhì)量和莖葉鮮質(zhì)量，且當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時(shí)，對(duì)根系鮮質(zhì)量和莖葉鮮質(zhì)量有顯著性影響（P＜0.05）；rL1 則在脅迫質(zhì)量濃度為0～10 mg·L-1時(shí)均能顯著提高植株的根系鮮質(zhì)量和莖葉鮮質(zhì)量（P＜0.05）。在所有處理中，ZR1-1 處理、ZR1-2 處理的根系鮮質(zhì)量和莖葉鮮質(zhì)量分別提高了20.37%和3.81%～114.29%、6.78%～59.26% 和47.62%～111.69%，rL1-1 處理、rL1-2 處理的根系鮮質(zhì)量和莖葉鮮質(zhì)量分別提高 了33.33%～238.98% 和17.14%～169.72%、68.52%～144.07% 和84.76%～137.73%，說 明感染ZR1、rL1 菌株能在一定程度上增加植株的鮮質(zhì)量。

?析分素因單的標(biāo)指長(zhǎng)生及發(fā)萌子種草麥黑對(duì)理處同2 不表Table 2 Single factor analysis of seed germination and growth index of Lolium perenneunder different treatments量質(zhì)0.002 ab Weight of stem and leaf /g干Dry weight 0.056±量質(zhì)葉莖量質(zhì)0.015 defg鮮Fresh weight 0.109±量質(zhì)0.001 cdef Root weight /g干Dry weight 0.024±量質(zhì)根量質(zhì)0.004 efg鮮Fresh weight 0.059±長(zhǎng)根Root length /cm 3.37±0.18 fghi高株P(guān)lant height /cm 6.61±0.08 abc度質(zhì)Cadmium濃量0鎘concentration /(mg·L-1)理處Treatment 0.003 ab 0.002 a 0.058±0.060±0.010 defg 0.008 defg 0.106±0.105±0.006 cdef 0.002 cdef 0.024±0.023±0.003 efg 0.001 fg 0.059±0.057±3.04±0.33 ghi 3.05±0.08 ghi 6.65±0.37 ab 6.47±0.15 abcde 1 5 CK 0.015 abc 0.002 ab 0.054±0.057±0.025 fg 0.046 fg 0.077±0.075±0.004 efg 0.020±0.002 cde 0.025±0.012 fg 0.003 fg 0.054±0.055±2.17±0.30 i 2.88±0.15 hi 6.08±0.08 abcdef 6.51±0.17 abc 10 0 0.002 cdef 0.001 ef 0.047±0.044±0.019 g 0.063±0.043 defg 0.109±0.001 cd 0.026±0.002 defg 0.021±0.009 fg 0.003 fg 0.044±0.053±6.10±0.60 bcde 5.01±0.53 cdef 6.17±0.17 abcdef 5.96±0.11 bcdef 1 5 ZR1-1 0.005 def 0.003 ab 0.045±0.056±0.047 cde 0.008 g 0.165±0.064±0.001 defg 0.002 defg 0.021±0.021±0.005 defg 0.008 fg 0.065±0.043±4.22±0.89 fgh 3.25±0.34 fghi 5.06±0.30 f 6.48±0.42 abcd 10 0 0.001 bcde 0.002 cdef 0.050±0.047±0.031 efg 0.102±0.038 cde 0.155±0.001 a 0.033±0.004 ab 0.032±0.014 defg 0.008 cdef 0.063±0.074±6.72±1.31 ab 6.12±0.60 bcde 6.54±0.16 abc 5.74±0.27 defg 1 5 ZR1-2 0.004 abcd 0.053±0.002 abcde 0.052±0.078 cde 0.071 a 0.163±0.294±0.005 cdef 0.002 bc 0.023±0.027±0.029 cde 0.043 a 0.086±0.200±4.89±1.36 bcdefg 8.21±0.66 a 5.87±0.35 cdef 6.45±0.13 abcde 10 0 0.002 abcde 0.006 cdef 0.052±0.047±0.033 a 0.267±0.043 defg 0.123±0.003 cdef 0.002 f 0.023±0.016±0.019 b 0.157±0.015 cdef 0.076±6.22±0.17 bcd 4.75±0.15 cdefgh 6.43±0.30 abcde 5.73±0.09 efg 1 5 rL1-1 0.003 cdef 0.005 f 0.047±0.039±0.018 cdef 0.026 ab 0.139±0.257±0.002 f 0.017±0.001 cd 0.026±0.007 cdef 0.012 b 0.079±0.144±3.42±0.31 fghi 6.35±0.28 bc 5.49±0.24 fg 6.72±0.08 a 10 0 0.004 abc 0.002 def 0.055±0.045±0.030 ab 0.025 bc 0.252±0.194±0.003 abc 0.028±0.004 cdef 0.024±0.018 b 0.008 c 0.144±0.098±6.08±0.59 bcde 5.08±0.22 bcdef 6.52±0.20 abc 6.15±0.20 abcdef 1 5 rL1-2 0.002 bcde 0.051±0.015 cd 0.175±0.001 fg 0.019±0.004 cd 0.091±4.41±0.08 defgh 5.71±0.07 efg 10。同下0.05），（P ＜著顯異差間理處同不表代母字寫小同不，株rL1 菌的100 倍釋稀種接表，rL1-2 代株rL1 菌的50 倍釋稀種接表，rL1-1 代株ZR1 菌的100 倍釋稀種接表，ZR1-2 代株ZR1 菌0.05), the same below.的50 倍釋稀種接表? ZR1-1 代ZR1-1 represents a 50-fold diluted ZR1 strain, ZR1-2 represents a 100-fold diluted ZR1 strain, rL1-1 represents a 50-fold diluted rL1 strain, and rL1-2 represents a 100-fold diluted rL1 strain. Different lowercase letters represent significant differences among different treatments (P ＜

CK 處理時(shí)，隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高，根系干質(zhì)量呈下降趨勢(shì)，各質(zhì)量濃度間無顯著性差異（P＞0.05）；莖葉干質(zhì)量變化不明顯，各處理間也不存在顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度＞1 mg·L-1時(shí)，ZR1-2 處理的根干質(zhì)量均比相應(yīng)脅迫質(zhì)量濃度下的CK 處理高，增幅為15.00%～39.13%，且當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為1、5 mg·L-1時(shí)，影響顯著（P＜0.05）。ZR1 處理的莖葉干質(zhì)量基本小于相應(yīng)質(zhì)量濃度的CK 處理，當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為5 mg·L-1時(shí)，ZR1 處理下的影響顯著（P＜0.05）。在rL1 處理下，根干質(zhì)量和莖葉干質(zhì)量均小于相應(yīng)脅迫質(zhì)量濃度下的CK 處理，但對(duì)根系干質(zhì)量無顯著性影響（P＞0.05），當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為5 mg·L-1時(shí)，對(duì)莖葉干質(zhì)量影響顯著（P＜0.05）。

2.2 不同處理對(duì)黑麥草根系及莖葉鎘含量的影響

由圖2可知，隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高，各處理的根鎘含量、莖葉鎘含量均增加。脅迫質(zhì)量濃度為1 mg·L-1時(shí)，與CK 處理相比，4 種染菌處理對(duì)黑麥草的根系和莖葉鎘含量影響均不顯著（P＞0.05）；當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度＞1 mg·L-1時(shí)，接種ZR1、rL1 菌株都影響了黑麥草的根系和莖葉鎘含量，其中ZR1-1 處理、rL1-1 處理、rL1-2 處理的根系和莖葉鎘含量分別提高了5.91%～28.52%和12.64%～15.20%、140.86%～145.63% 和117.16%～191.97%、92.14%～202.78% 和168.48%～226.07%，且當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時(shí)，ZR1-1 處理對(duì)根系鎘含量影響顯著（P＜0.05），當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度＞1 mg·L-1時(shí)，rL1 處理對(duì)根系鎘含量和莖葉鎘含量影響均顯著（P＜0.05）；在脅迫質(zhì)量濃度為5 mg·L-1時(shí)，ZR1-2 處理的根系和莖葉鎘含量分別提高了19.02%和22.66%，而當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為10 mg·L-1時(shí)，ZR1-2 處理的根系和莖葉鎘含量均略有降低，但影響不顯著（P＞0.05）。

圖2 不同處理對(duì)黑麥草根系及莖葉鎘含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on cadmium contents in roots,stems and leaves of Lolium perenne

2.3 不同處理對(duì)鎘遷移轉(zhuǎn)運(yùn)的影響

在本研究中，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)是莖葉部鎘含量與根系鎘含量的比值。表3顯示，當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為1～10 mg·L-1時(shí)，與CK 處理相比，接種ZR1、rL1 菌株能不同程度地提高黑麥草對(duì)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)（除脅迫質(zhì)量濃度為10 mg·L-1、ZR1-1 處理外）。其中在ZR1-1 處理下，鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)提高了7.69%～104.00%，且當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為1 mg·L-1時(shí)，影響顯著（P＜0.05）；ZR1-2 處理、rL1-1 處理、rL1-2 處理則分別使鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)提高了7.69%～52.38%、23.81%～44.00%、9.52%～56.00%。這說明接種ZR1 與rL1 菌株能在一定程度上促進(jìn)鎘從根系向莖葉部轉(zhuǎn)運(yùn)。另外，表3也顯示，隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高，各處理下鎘轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)基本下降，這說明脅迫質(zhì)量濃度越大，黑麥草對(duì)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)能力越低。

表3 不同處理對(duì)黑麥草鎘轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響Table 3 Effects of different treatments on Cd transfer coefficient of Lolium perenne

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

鎘元素能夠從各個(gè)方面對(duì)植物體產(chǎn)生傷害，在植物體內(nèi)會(huì)發(fā)生累積，并且導(dǎo)致蛋白結(jié)構(gòu)功能受損，細(xì)胞代謝平衡被打破。鎘影響黑麥草生長(zhǎng)發(fā)育的可能機(jī)制是重金屬的毒害作用可導(dǎo)致植物光合速率降低，從而減少了植物對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收[23]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)芽率指標(biāo)時(shí)，發(fā)現(xiàn)未染菌時(shí)，黑麥草種子發(fā)芽率沒有受到抑制，這與周秋峰等[24]得出的結(jié)論一致。接種ZR1 菌株時(shí)，隨著鎘脅迫的加重，植株的發(fā)芽率和株高并沒有顯著影響，它和rL1 菌株對(duì)根長(zhǎng)均有明顯的促進(jìn)作用，這與吳麗偉等[25]的研究結(jié)論一致。這可能是因?yàn)檫@兩株菌均屬于能夠產(chǎn)鐵載體和具有溶磷能力的根際促生菌，能夠更好地富集植株根部的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)根部的生長(zhǎng)，特別是ZR1 菌株，它能夠耐受相對(duì)較高質(zhì)量濃度的鎘脅迫，即對(duì)ZR1 菌株來說，0～10 mg·L-1的脅迫質(zhì)量濃度可能屬于低質(zhì)量濃度范圍，在此范圍內(nèi)，鎘并沒有達(dá)到能夠抑制植物合成所需的物質(zhì)和能量，因而在其作用下，黑麥草的發(fā)芽率、株高均未受到鎘質(zhì)量濃度變化的影響，試驗(yàn)設(shè)定的鎘質(zhì)量濃度對(duì)其生長(zhǎng)反而有利。而接種rL1 菌株后，株高雖未受到影響，卻對(duì)發(fā)芽率有抑制作用，這與李紹鋒等[26]研究的7 種內(nèi)生真菌菌株抑制豚草種子發(fā)芽的結(jié)果一致。這可能是rL1 菌株在生長(zhǎng)過程中，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物對(duì)宿主植株產(chǎn)生了影響。在研究生物量指標(biāo)時(shí)，接種ZR1 菌株對(duì)于黑麥草生物量的影響不大，接種菌株rL1 雖然使植株干質(zhì)量減少，但卻顯著提高了鮮質(zhì)量，說明菌株rL1 能夠增加植株體內(nèi)的含水量，這可能也是菌株能夠緩解植株對(duì)鎘脅迫作用的重要原因。另外，對(duì)比菌株ZR1 和rL1 的性質(zhì)可知，菌株rL1 的產(chǎn)鐵載體能力和溶磷能力均比菌株ZR1 強(qiáng)；在菌株rL1 作用下，黑麥草的根系、莖葉鮮質(zhì)量均高于菌株ZR1 作用下的黑麥草，說明菌株rL1 更能促進(jìn)植株根系的生長(zhǎng)，吸收更多的水分，從而提高植株體內(nèi)的含水量，提高其抗旱性。

植物從土壤中吸收重金屬離子的能力同土壤中金屬的生物有效性有很大的關(guān)系，而微生物可以對(duì)土壤中重金屬進(jìn)行固定、移動(dòng)或轉(zhuǎn)化，改變其在土壤中的環(huán)境化學(xué)行為[27]。本試驗(yàn)研究模擬鎘脅迫下ZR1 與rL1 菌株對(duì)植株體內(nèi)鎘含量的變化，發(fā)現(xiàn)隨著脅迫質(zhì)量濃度的升高，植株體內(nèi)鎘含量上升，且接種ZR1 和rL1 菌株能夠使植株體內(nèi)鎘含量增加，更能促進(jìn)植株根系對(duì)鎘的積累。趙光[28]對(duì)芥菜的研究表明，接種凝結(jié)芽孢桿菌讓芥菜根部的鎘含量提高了28%，增強(qiáng)了芥菜對(duì)重金屬鎘的吸收，本研究結(jié)果與其結(jié)論相似，這可能是因?yàn)榫闦R1 和rL1 為產(chǎn)鐵載體菌和溶磷菌，能通過螯合重金屬和產(chǎn)生有機(jī)酸使重金屬活化，從而讓植株能夠吸收更多的鎘。就ZR1 而言，在ZR1-1 處理后，根系鎘含量和莖葉鎘含量均高于同一脅迫下的CK 處理，在ZR1-2 處理后，根系鎘含量與莖葉鎘含量均低于CK 處理，而ZR1-1、ZR1-2 是菌的濃度分別稀釋50、100 倍，這說明菌的濃度對(duì)植物體內(nèi)鎘含量是有影響的。植物對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)表示植物對(duì)重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，與植物本身的因素密切相關(guān)。劉靈芝等[29]研究發(fā)現(xiàn)在萬壽菊上接種AMF 菌株能夠增加對(duì)鎘的吸收，促進(jìn)鎘從地下部向地上部的轉(zhuǎn)運(yùn)，表現(xiàn)出促進(jìn)植物提取的應(yīng)用潛力。在本研究中，發(fā)現(xiàn)接種菌株ZR1、rL1，能夠提高黑麥草對(duì)鎘的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)，將鎘從根系轉(zhuǎn)運(yùn)至莖葉，特別是當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度為1 mg L-1時(shí)，稀釋50 倍的菌株ZR1 能顯著促進(jìn)鎘向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，這可能是由于根系促生菌分泌的有機(jī)酸能夠活化重金屬，富集根部的營(yíng)養(yǎng)礦物質(zhì)，促進(jìn)了重金屬的轉(zhuǎn)運(yùn)[30]。

接種ZR1 菌株對(duì)黑麥草種子的發(fā)芽率沒有抑制作用，且在0～10 mg·L-1脅迫質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)黑麥草根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量均有促進(jìn)作用，表現(xiàn)出一定的耐鎘性，因而可將其應(yīng)用于種子的發(fā)芽、幼苗的生長(zhǎng)；接種rL1 菌株雖對(duì)種子的發(fā)芽率有抑制作用，但能提高黑麥草根系、莖葉的鮮質(zhì)量，大大增加了植株體內(nèi)的含水量，促進(jìn)根系的生長(zhǎng)。因而可將rL1 菌株施用于苗期，應(yīng)用于提高干旱地區(qū)植株的抗旱性，促進(jìn)植株生長(zhǎng)。另外，接種ZR1、rL1 菌株均能活化鎘，提高鎘在植株體內(nèi)的積累，促進(jìn)鎘從地下部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)，可應(yīng)用于鎘污染土壤的微生物-植物修復(fù)。在修復(fù)過程中，通過收割植物地上部分的方式來提取土壤中的鎘，達(dá)到修復(fù)鎘污染土壤的目的。這些研究結(jié)果能為下一步的盆栽試驗(yàn)和實(shí)際應(yīng)用提供初步的理論依據(jù)。但是，本研究只涉及種子萌發(fā)及幼苗生長(zhǎng)、遷移積累鎘的影響，并沒有完整體現(xiàn)出植株全部發(fā)育時(shí)期的生長(zhǎng)狀況以及遷移累積鎘的情況，加之盆栽試驗(yàn)或大田試驗(yàn)的環(huán)境條件復(fù)雜，土壤也可能不是單一的鎘污染，因此，要將其實(shí)際應(yīng)用，還有待下一步的室外盆栽試驗(yàn)或大田試驗(yàn)來驗(yàn)證。

3.2 結(jié) 論

1）當(dāng)脅迫濃質(zhì)量度為0～10 mg·L-1時(shí)，在同一脅迫水平下，接種ZR1 菌株處理的黑麥草發(fā)芽率與CK 處理無顯著差異（P＞0.05），而rL1菌株處理的發(fā)芽率、干質(zhì)量則比CK 處理低。

2）兩株菌均能促進(jìn)黑麥草的根系生長(zhǎng)，提高植株的根系和莖葉的鮮質(zhì)量。從根長(zhǎng)、根系及莖葉鮮質(zhì)量來看，當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度相對(duì)較高（＞1 mg·L-1）時(shí)，建議施用ZR1 菌株；當(dāng)脅迫質(zhì)量濃度跨度相對(duì)較大（0～10 mg·L-1）時(shí)，建議施用rL1 菌株。

3）在同一脅迫水平下，與CK 處理相比，接種ZR1、rL1 菌株能提高黑麥草根系、莖葉鎘含量（除脅迫濃度為10 mg·L-1，ZR1-2 處理），并能促進(jìn)鎘從根部向地上部轉(zhuǎn)運(yùn)。

4）兩種菌株均能表現(xiàn)出一定的促生性，在植物全發(fā)育期，建議施用ZR1 菌株；在植物苗期，建議施用rL1 菌株。