PGPR與外生菌根菌互作對樟子松促生作用及根際微生態(tài)環(huán)境的影響

羅佳煜，宋瑞清，鄧 勛，宋 倩，王俊凱，宋小雙

（1.東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040）

根際促生細(xì)菌（Plant growth promotiong rhizosphere，PGPR）被稱為定殖于植物根際并能夠促進(jìn)植物生長的細(xì)菌。PGPR 主要包括伯克霍爾德菌屬Burkholderiaspp.、芽孢桿菌屬Gemmatimonadetes、假單胞菌屬Pseudomonas、沙雷氏菌屬Serratia和鏈霉菌屬Streptomyces等[1-2]。PGPR 可以促進(jìn)植物的生長，其作用機理可歸為直接和間接作用兩大類。直接作用是PGPR 可以合成促進(jìn)植物生長的激素（如生長素等），使土壤中某些無機元素轉(zhuǎn)化成有機的形態(tài)而利于植物吸收（如固氮、解磷等），促進(jìn)植物的生長發(fā)育；間接作用是PGPR 通過抑制病原菌生長或提高植物抗性，減緩植物病害對植物不利的影響[3]。外生菌根菌（Ectomycorrhizal fungi，ECMF）是植物根部重要的益生菌，可顯著提高宿主植物對礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收，尤其是針葉樹種，在促進(jìn)苗木生長、提高苗木耐脅迫方面具有不可替代的作用[4-5]。溫祝桂等[6]在研究外生菌根菌對黑松幼苗的影響中發(fā)現(xiàn)，接種外生菌根真菌可以有效促進(jìn)宿主松樹幼苗的生長，菌根化使得幼苗的光合能力增強，光合產(chǎn)物增多，增加了植物體內(nèi)脯氨酸含量；增強了K+的吸收，有效地維持了相對較低的Na+/K+比。益生菌互作在植物促生抗逆方面具有協(xié)同增效的作用，復(fù)合益生菌劑能調(diào)節(jié)植物的養(yǎng)分平衡，促進(jìn)植物的生長和養(yǎng)分的吸收。適合的菌株互作能起到加成效應(yīng)，相互間促進(jìn)生長，或者相互提供生長所需的養(yǎng)料和基質(zhì)[7]，部分PGPR 在ECM互作中可發(fā)揮菌根輔助細(xì)菌（Mycorrhizal helper bacteria，MHB）的作用。Hungria 等[8]發(fā)現(xiàn)共接種根瘤菌Rhizobium和巴西固氮螺菌Azospirillam brasilense能提高大豆和菜豆的產(chǎn)量。巴西固氮螺菌和溶磷菌互作能促進(jìn)高粱和大麥以及其他谷類生長，增加作物的產(chǎn)量和N、P 的吸收量[9]。PGPR 菌株與根瘤菌復(fù)合接種，能提高根瘤菌的固氮能力，包括增加根瘤數(shù)以及促進(jìn)根系發(fā)育等[10]。根際溶磷菌多粘芽孢桿菌Bacillus polymyxa也可以作為菌根輔助細(xì)菌，有利于聚叢球囊霉Glomus aggregatum的定殖[11]。有研究表明同時接種摩西球囊霉Glomus mosseae與根際促生菌，如根瘤菌Bradyrhizobium japonicum或溶磷細(xì)菌Burkholderia cepacianBAM-6，不但提高了作物的養(yǎng)分利用效率，還提高了作物的抗逆能力，進(jìn)而促進(jìn)宿主植物的生長[12]。菌根菌與輔助細(xì)菌之間存在協(xié)同進(jìn)化機制，二者相互的選擇特異性較強，Garbaye 等[13]對Pinus radiate-Rhizopogon luteolus菌根際細(xì)菌進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，在菌根際土壤、菌根、菌根菌擔(dān)子果等分離得到的細(xì)菌，多數(shù)菌株對菌根合成具有促進(jìn)作用。菌根菌在提高宿主植物養(yǎng)分吸收和促進(jìn)生長的同時，對菌根際的細(xì)菌種類有定向選擇作用，從而使菌根際的微生物類群更加有利于其菌根合成[14]。

樟子松Pinus sylvestnisvar.mongolica是東北地區(qū)主要速生用材、防護(hù)綠化、水土保持優(yōu)良樹種。樟子松育苗中面臨土傳病害發(fā)生嚴(yán)重、根際土壤微生態(tài)環(huán)境破壞、苗木長勢不好、抗逆性弱等問題，接種根際益生菌可以促進(jìn)樟子松苗木生長，改善根際微生態(tài)環(huán)境，提高苗木抗逆性。本研究以根際促生細(xì)菌（PGPR）和外生菌根菌（ECM）為研究對象，以促進(jìn)樟子松苗木生長、提高后續(xù)造林成功率為目標(biāo)，PGPR 與外生菌根菌復(fù)合接種后，測定樟子松1年生苗的生長指標(biāo)、根際土壤理化性狀和微生物多樣性指標(biāo)，分析PGPR 與外生菌根菌互作在促進(jìn)樟子松苗生長、提高樟子松苗抗病性等方面的核心作用，為開發(fā)植物促生抗逆作用的生物菌肥提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

褐環(huán)乳牛肝菌Suillus luteusN94（GenBank 登錄號：MT652994）分離自遼寧省彰武縣章古臺實驗林場樟子松人工林。

熒光假單胞桿菌Pseudomonas fluorescens1-42（GenBank 登錄號：MK880644）分離自黑龍江省東北林業(yè)大學(xué)實驗林場1年生樟子松苗根際土壤。

菌株保存于東北林業(yè)大學(xué)森林微生物實驗室。

1.2 育苗及菌劑制備方法

育苗基質(zhì)的制備及播種：草炭土、蛭石和河沙按體積比2∶1∶1 混合配制成育苗基質(zhì)，121℃下高溫高壓滅菌2 h，裝入營養(yǎng)缽（15 cm×13 cm）中室溫放置7 d 后進(jìn)行播種[18]。樟子松種子催芽后播入營養(yǎng)缽中，每缽播30 粒種子，置于東北林業(yè)大學(xué)實驗林場溫室中培養(yǎng)，幼苗出土后，每缽定苗至15 株，進(jìn)行常規(guī)的日常管護(hù)[19]。

接種菌劑的制備：4℃保存的褐環(huán)乳牛肝菌N94 接種于PDA 平板培養(yǎng)基上，培養(yǎng)20 d 后用無菌打孔器（直徑10 mm）切取菌餅，接種于盛有PD 液體培養(yǎng)基250 mL 的500 mL 三角瓶中，每瓶接種3 片菌餅，置于搖床上（25℃、150 r·min-1）振蕩培養(yǎng)30 d，接種前用攪拌機將菌絲體攪碎做勻漿處理。

將-20℃保存的熒光假單胞桿菌1-42 劃線接種到牛肉膏蛋白胨（NB）固體培養(yǎng)基上，30℃黑暗條件下培養(yǎng)72 h 后，挑取單菌落接種到牛肉膏蛋白胨（NB）液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)（28℃，180 r·min-1）48 h 后，4℃條件下8 000 r·min-1離心10 min，去掉上清液后無菌水沖洗3 次，接種前調(diào)整終濃度OD600吸光度為0.6。

1.3 接種試驗設(shè)計

樟子松出苗14 d后進(jìn)行接種，共4個接種方式。1）CK：PD 培養(yǎng)基作為對照。2）N94：單接種褐環(huán)乳牛肝菌N94。3）1-42：單接種熒光假單胞桿菌1-42。4）N94+1-42：雙接種褐環(huán)乳牛肝菌N94和熒光假單胞桿菌1-42。采取打孔灌根的方式接種，每盆接種N94 菌劑、1-42 菌劑或PD 培養(yǎng)基50 mL（每盆打直徑10 mm、深5 cm 的5 個小孔，注入菌劑）。每個處理20 次重復(fù)（每個處理20盆300 株樟子松1年生苗），共80 盆，接種完成后在溫室中正常管護(hù)。

1.4 植物及土壤取樣方法

植物取樣：接種處理90 d 后，采集植物及根際土壤樣品，用于相關(guān)指標(biāo)的測定。每個處理隨機選取1年生苗100 株，用無菌水清洗根際，濾紙吸干后用于指標(biāo)的測定。

根際土取樣：每處理采集樟子松苗的同時，輕輕抖動根際土并收集于無菌樣品袋中，2 mm 篩子過篩后放入裝有冰袋的保溫箱中帶回實驗室，用于測定土壤養(yǎng)分指標(biāo)的土壤風(fēng)干后常溫保存；測定土壤酶指標(biāo)的土壤保存于4℃冰箱；測定微生物多樣性的土樣保存于-80℃冰箱。

1.5 樟子松生長指標(biāo)的測定

生物量指標(biāo)：分別測定1年生苗的苗高、地徑、地上部分及地下部分鮮質(zhì)量，85℃干燥箱烘干后測定地上部分及地下部分干質(zhì)量。

苗木養(yǎng)分指標(biāo)：樟子松1年生苗烘干后分為根、莖、葉三部分，研磨成粉狀用于測定植物營養(yǎng)成分，包括全氮、全磷、全鉀、有機質(zhì)含量。全氮（Total nitrogen，TN）采用凱氏定氮儀（K9840）測定；全磷（Total phosphorus，TP）采用Mo-Sb 比色法測定；全鉀（Total potassium，TK）采用火焰光度計法測定；有機質(zhì)（Organic matter，OM）采用重鉻酸鉀外加熱法測定[21]。

1.6 土壤養(yǎng)分及酶活指標(biāo)的測定

土壤養(yǎng)分指標(biāo)：全氮（TN）的測定采用凱氏定氮法；速效氮（Available nitrogen，AN）用堿性水解法測定；全磷（TP）的測定采用Mo-Sb 比色法；速效磷（Available phosphorus，AP）的測定采用雙酸浸出的鉬銻抗比色法；全鉀（TK）的測定采用火焰光度計；速效鉀（Available potassium，AK）的測定采用乙酸銨（CH3COONH4）浸提劑火焰光度計；用重鉻酸鉀氧化加熱法測定有機質(zhì)（OM）。

土壤酶活性的測定：采用南京建成生物土壤酶測定試劑盒，按照說明書測定土壤酸性磷酸酶、過氧化氫酶、蔗糖酶及脲酶活性。

1.7 根際微生物多樣性分析

采用E.Z.N.A.? Soil DNA Kit 提取土壤總DNA，以土壤總DNA 為模板，采用341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′) 和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)對細(xì)菌16 S rRNA 基因的V3-V4 高變區(qū)片段進(jìn)行PCR 擴增，采 用ITS1F (5′-ATATGCTTAAAT TCAGCGGG-3′)和ITS2R (5′-ATATGTAGGATGAAGAACGYAGA A-3′)對真菌rDNA 基因的ITS 區(qū)片段進(jìn)行PCR擴增。擴增后的PCR 產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA Gel Extraction kit進(jìn)行純化，Tris-HCl 洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。利用QuantiFluor ?-ST 進(jìn)行檢測定量，然后根據(jù)測序量需求對各樣品按相應(yīng)比例混合，構(gòu)建Miseq文庫，使用Illumina MiSeq 平臺測序。通過Flash軟件拼接成一條序列，同時使用Trimmomatic 軟件進(jìn)行質(zhì)控過濾。利用UPARSE 軟件對所得序列進(jìn)行分析，按照97%的相似性將序列劃分可操作分類單位OUT (Operational taxonomic units)，使用UCHIME 軟件剔除嵌合體。利用RDP classifier 對每條序列進(jìn)行物種分類注釋，置信度閾值為0.7。

1.8 數(shù)據(jù)處理和分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019 軟件進(jìn)行初步處理，數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SE）表示；每個指標(biāo)設(shè)置3 個重復(fù)，使用SPSS19.0 統(tǒng)計學(xué)分析軟件對植物生物量、土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性、植物營養(yǎng)成分進(jìn)行單因素方差分析，使用Origin 2019軟件處理植物生物量數(shù)據(jù)并繪圖；使用Usearch軟件進(jìn)行OTU 聚類分析；利用mothur 軟件進(jìn)行alpha 多樣性指數(shù)分析和rarefaction 分析，用Coverage 指數(shù)表示測序深度指數(shù)，用Chao1 指數(shù)表示群落豐度，用Shannon 和 Simpson 指數(shù)表示真菌群落物種的豐富度和多樣性；采用Pearson 法進(jìn)行相關(guān)性分析（0.05 水平）；冗余分析（RDA）、ANOSIM 和Heatmap 分析使用R 語言vegan 包作圖；Beta 多樣性采用Unifrac 距離計算，使用R 語言vegan 包完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 1-42 與N94 互作對樟子松生物量指標(biāo)的影響

由圖1得出，1-42 處理組樟子松苗高、地徑、根長、地上部分鮮質(zhì)量、地下部分鮮質(zhì)量、地上部分干質(zhì)量、地下部分干質(zhì)量同對照相比均存在顯著性差異（P＜0.05），分別增加了16.79%、33.17%、66.33%、87.67%、74.55%、42.44%、67.04%；N94 處理組樟子松苗高、地徑、地上部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、地下部分鮮質(zhì)量同對照相比存在顯著性差異（P＜0.05），分別增加了23.29%、20.83%、73.46%、30.97%、99.31%；N94+1-42 處理組苗高、地徑、地上部分鮮質(zhì)量和干質(zhì)量同對照相比存在顯著性差異（P＜0.05），分別增加了35.28%、16.75%、65%、38.31%。1-42處理組的根長、地徑和地下部分干質(zhì)量相對于N94處理組分別增加了70.87%、10.21%和61.46%；N94+1-42 處理組的苗高和地上部分干質(zhì)量相對于N94 處理組分別增加了9.73%、5.60%。結(jié)果說明1-42 與N94 互作可以促進(jìn)樟子松幼苗的生長。

圖1 不同接種處理對樟子松1年生苗生物量的影響Fig.1 Effects of different inoculation treatments on 1-year seedling biomass of P.sylvestris var. mongolica

2.2 1-42 與N94 互作對樟子松1年生苗養(yǎng)分指標(biāo)的影響

如表1所示，樟子松1年生苗主要營養(yǎng)成分指標(biāo)在不同處理間具有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 1-42 與N94 互作對樟子松幼苗養(yǎng)分指標(biāo)的影響Table 1 The interaction between 1-42 and N94 affected the nutrient index of P.sylvestris var. mongolica

同對照（CK）相比，N94 與1-42 單接種和復(fù)合接種處理均可顯著提高樟子松1年生苗根、莖和葉的養(yǎng)分含量。其中N94 單接種處理對幼苗養(yǎng)分指標(biāo)全氮（TK）含量在根、莖、葉上均有顯著提高，分別提高了76.56%、87.21%、42.66%。1-42 單接種幼苗養(yǎng)分指標(biāo)有機質(zhì)（OM）含量在根和葉上提高最顯著，分別提高了28.28%、20.68%。N94+1-42 復(fù)合接種處理幼苗養(yǎng)分指標(biāo)全鉀（TK）含量在根、莖、葉上提高最顯著，分別提高了161.1%、120.88%、206.12%；全氮（TK）含量在根和葉上均有提高，分別提高了145.31%、47.55%；全磷（TP）含量在根、莖上均有顯著提高，分別提高了48.72%、24.77%；有機質(zhì)（OM）含量在莖和葉上顯著提高，分別提高了34.98%、26.31%。其中N94+1-42 復(fù)合接種處理效果優(yōu)于N94 與1-42 單接種處理。

2.3 1-42 與N94 互作對樟子松根際土壤養(yǎng)分和酶活性的影響

如表2所示，同對照（CK）相比，N94 與1-42 單接種和復(fù)合接種處理均可顯著提高樟子松1年生苗根際土壤養(yǎng)分指標(biāo)含量（P＜0.05）。其中N94 單接種處理對根際土壤養(yǎng)分指標(biāo)過氧化氫酶活性（Catalase activity）、速效氮（AN）、全氮（TN）、磷酸酶活性（Phosphatase activity）、速效鉀（AK）含量均有顯著提高，分別提高了109.26%、116.66%、74.29%、24.69%、14.11%。1-42 單接種對根際土壤養(yǎng)分指標(biāo)有機質(zhì)（OM）、脲酶活性（Urease activity）有顯著提高，分別提高了34.78%、25.41%。N94+1-42 復(fù)合接種處理對根際土壤養(yǎng)分指標(biāo)速效氮（AN）、全磷（TP）、全氮（TN）、脲酶活性（Urease activity）、速效磷（AP）、有機質(zhì)（OM）、蔗糖酶活性（Sucrase activity）、磷酸酶活性（Phosphatase activity）均有顯著提高，分別提高了158.33%、96.13%、57.14%、43.77%、40.42%、36.95%、24.29%、23.12%。其中N94+1-42 復(fù)合接種處理效果優(yōu)于N94 與1-42 單接種處理。

表2 1-42 與N94 互作對樟子松根際土壤養(yǎng)分和酶活性的影響Table 2 The interaction between 1-42 and N94 affected soil nutrients and enzyme activities in the rhizosphere of P.sylvestris var. mongolica

2.4 根際土壤細(xì)菌和真菌多樣性分析

2.4.1 alpha 和beta 多樣性分析

物種多樣性是衡量群落生物組成的重要指標(biāo)，可以反映群落內(nèi)物種的多少，能夠客觀地比較各樣品的差異性及相似性。4 組土壤樣品的細(xì)菌、真菌多樣性高通量測序分別獲得229 555 103、393 991 268 條優(yōu)化數(shù)據(jù)的序列條數(shù)，平均長度分別為412.78、256.57 bp。以97% 相似度劃分，分別得到6 009、1 001 個OTU。4 組土壤樣品的Coverage 指數(shù)細(xì)菌、真菌群落分別為0.994 8～0.979 3、0.999 5～0.998 7，表明測序數(shù)據(jù)基本包含了樟子松幼苗土壤中所有微生物類群，能夠反映樟子松幼苗真實土壤環(huán)境中微生物的特性。如圖2～3所示，細(xì)菌群落稀釋性曲線、真菌群落稀釋性曲線趨于平緩，說明試驗對土壤樣本微生物群落的檢測比率接近飽和，目前的測序量能夠覆蓋樣本中的絕大部分物種。

圖2 細(xì)菌群落稀釋性曲線Fig.2 Dilution curve of bacterial community

圖3 真菌群落稀釋性曲線Fig.3 Dilution curve of fungal community

alpha 多樣性分析如表3所示，結(jié)合圖4～圖5群落OTU 分布Venn 圖，比較4 組處理的細(xì)菌OUT，N94+1-42 與其他3 組有差異性（P＜0.05），真菌OUT 無差異性。用chao1 算法估計樣本中所含OTU 數(shù)目的指數(shù)，chao1 在生態(tài)學(xué)中常用來估計物種總數(shù)，比較不同處理的chao1 值，細(xì)菌群落存在差異性（P＜0.05），N94+1-42 處理組和對照組大于單接種N94、1-42 處理組，真菌群落無差異性，說明1-42 與N94 互作的根際土壤細(xì)菌物種總數(shù)最多，但真菌物種總數(shù)差異性不大。Simpson 是用來估算樣本中微生物多樣性指數(shù)，Simpson 指數(shù)值越小，說明群落多樣性越高。Shannon 是用來估算樣本中微生物多樣性指數(shù)，它與Simpson 多樣性指數(shù)常用于反映alpha 多樣性指數(shù)，Shannon 值越大，說明群落多樣性越高。比較不用處理細(xì)菌的Simpson 值，N94+1-42處理組同其它3 組相比Simpson 降低，而真菌的值為N94+1-42 處理組大于對照組和單接種N94、1-42 處理組，比較Shannon 值細(xì)菌群落無差異性，N94+1-42 處理組同其它3 組相比真菌Shannon 降低，兩者相互印證說明1-42 與N94 互作的根際細(xì)菌群落多樣性最高，而N94 和1-42 互作會降低真菌群落的多樣性，可能是N94 在1-42 的互作下，生物量增加，擠占了其它真菌的生長空間，使真菌群落多樣性降低。

表3 α 多樣性數(shù)據(jù)Table 3 α Diversity data

圖4 細(xì)菌群落OTU 分布Venn 圖Fig.4 Bacterial community OTU distribution Venn map

圖5 真菌群落OTU 分布Venn 圖Fig.5 Fungal community OTU distribution Venn map

beta 多樣性分析可分析不同樣本的OTU（97%相似性）組成，用于反映樣本間的差異和距離。PCOA 利用方差分解，將多組數(shù)據(jù)的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，坐標(biāo)軸取能夠最大反映方差值的兩個特征值。樣本組成越相似，在PCOA 圖中的距離越近。如圖6～7所示，4 組不同處理的土壤根際細(xì)菌群落和真菌群落相似性都較高。

圖6 細(xì)菌群落多樣本PCOA 分析Fig.6 Multiple samples PCOA analysis

圖7 真菌群落多樣本PCOA 分析Fig.7 Multiple samples PCOA analysis

2.4.2 根際細(xì)菌群落組成分析

4 組不同處理的樟子松幼苗根際土壤樣品的細(xì)菌群落分屬于48 門120 綱309 目513 科994屬1 522 種，真菌群落分屬于6 門22 綱57 目115科202 屬348 種，為了得到每個OTU 對應(yīng)的物種分類信息，采用RDP classifier 貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，結(jié)果如圖8～9所示。4 組處理組的優(yōu)勢細(xì)菌群落為變形菌門Proteobacteria（57.2%）和酸桿菌門Actinobacteria（13.08%），此外單接種1-42處理組中擬桿菌門Bacteroidetes（7.24%）為優(yōu)勢群落，單接種N94 處理組（5.92%）和對照組（5.75%）中芽單胞菌門Gemmatimonadetes 為優(yōu)勢群落，N94+1-42 處理組中綠彎菌門Chloroflexi（10.8%）為優(yōu)勢群落。子囊菌門Ascomycota（81.78%）是4 組處理組相對豐度最高的真菌群落，其中N94+1-42 處理組中子囊菌門相對豐度高達(dá)93.54%，此外單接種1-42 處理組（9.66%）、單接種N94 處理組（17.85%）和對照組（9.75%）中擔(dān)子菌門Basidiomycota 相對豐度較高。如圖10～11所示，細(xì)菌群落中4 組不同處理中拉姆桿菌屬Ramlibacter（7.87%）、芽單胞菌屬Gemmatimonadetes（4.47%）為最優(yōu)勢菌屬，此外馬賽菌屬Massilia在對照組（3.59%）和N94+1-42處理組（2.31%）中相對豐度較高，鞘脂單胞菌屬Sphingomonas在單接種1-42 處理組（2.99%）和單接種N94 處理組（3.53%）中相對豐度較高。對比4 組不同處理的真菌群落，單接種N94 處理組（21.92%）、N94+1-42 處理組（53.43%）和對照組（25.47%）中芽孢桿菌Sphaerosporella為最優(yōu)勢菌屬，N94+1-42 處理組相對于單接種N94 處理組提高了芽孢桿菌的相對豐度，也說明了N94 在1-42的互作下，擠占了其它真菌的生長空間，使真菌群落多樣性降低；鐮刀菌屬Fusarium（38.05%）是單接種1-42 處理組的最優(yōu)勢菌屬，同時在N94+1-42 處理組（8.06%）和對照組（22.97%）中相對豐度較高；單接種1-42 處理組的盤菌屬Peziza（14.99%）相對豐度較高，單接種N94 處理組的革菌屬Tomentella（14.84%）相對豐度較高。

圖8 細(xì)菌相對豐度的柱狀圖（門水平）Fig.8 Bar chart of relative abundance of bacteria (phylum level)

圖9 真菌相對豐度的柱狀圖（門水平）Fig.9 Bar chart of relative abundance of fungal (phylum level)

圖10 細(xì)菌群落Heatmap 圖（屬水平）Fig.10 Bacterial community Heatmap (genus level)

3 結(jié)論與討論

假單胞桿菌1-42 與褐環(huán)乳牛肝菌N94 互作提高了樟子松幼苗的生物量，同時說明根際細(xì)菌和菌根真菌互作可以提高植物的生物量，促進(jìn)植物生長。Hungria 等[8]發(fā)現(xiàn)共接種根瘤菌和巴西固氮螺菌能提高大豆和菜豆的產(chǎn)量。巴西固氮螺菌和溶磷菌互作能促進(jìn)高粱和大麥以及其他谷類生長，增加作物的產(chǎn)量和N、P 的吸收量[9]。還有試驗表明菌根輔助細(xì)菌（如假單胞菌Pseudomonas）可以通過減少病原菌附著胞的形成，抑制病原菌生長，從而提高植物抗病能力，并引發(fā)JA 和乙烯（ethylene，ET）依賴性誘導(dǎo)的系統(tǒng)抗性反應(yīng)（Induced systemic resistance，ISR），在植物抵御干旱、鹽堿等非生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[22]。菌根輔助細(xì)菌可以提高菌根菌與宿主植物菌根合成的效率，同時菌根菌的存在對輔助細(xì)菌生物量和功能也存在顯著影響[23]。菌根的存在也可以對植物根際土壤細(xì)菌類群起到正向調(diào)控作用，對根際的細(xì)菌尤其是熒光假單胞桿菌類群和功能多樣性的研究表明，菌根菌在提高宿主植物養(yǎng)分吸收和促進(jìn)生長的同時，對菌根際的細(xì)菌種類有定向選擇作用，從而使菌根際的微生物類群更加有利于其菌根合成[24]。根際細(xì)菌和菌根真菌互作對樟子松幼苗根的營養(yǎng)成分如全氮、有機質(zhì)、全鉀、全磷含量都有顯著影響。Plassard 等[25]研究證明低磷狀態(tài)下宿主植物吸收磷主要依靠外生菌根的菌絲體。外生菌根可以增加小分子有機酸分泌量，將土壤中的不溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，磷酸酶將大量無機態(tài)磷元素轉(zhuǎn)化為礦化態(tài)供植物利用[26]，前人從菌根真菌Hebeloma cylindrosporum中分離出磷轉(zhuǎn)運蛋白HPPT1 和Hc PT2，使得宿主植物磷有效吸收率大幅度提高[27]。研究發(fā)現(xiàn)，花旗松Pseudotsuga sinensisDode 菌根化后，根際的溶磷和嗜鐵熒光假單胞桿菌數(shù)量明顯高于未菌根化的根系，相同結(jié)果在Quercussessiliflora-Scleroderma citrinum菌根化根系中得到驗證，根際的溶磷細(xì)菌明顯高于未菌根化根系，菌根化根際細(xì)菌多數(shù)具有釋放礦物元素的能力，菌根菌可以顯著提高植物對磷元素的吸收能力[28]。

圖11 真菌群落Heatmap 圖（屬水平）Fig.11 Fungal community Heatmap (genus level)

試驗結(jié)果說明假單胞桿菌1-42 與褐環(huán)乳牛肝菌N94 對樟子松根際土壤養(yǎng)分如速效氮、速效磷，全氮、全磷、全鉀、有機質(zhì)和速效鉀有顯著影響，對土壤酶中的蔗糖酶活性影響不顯著，但對土壤中磷酸酶、過氧化氫酶和脲酶活性有顯著影響。Landis 等[29]對我國亞熱帶地區(qū)浙江常山縣的3年田間試驗發(fā)現(xiàn)，雜草物種豐富度的增加（0、4、8和12）直接影響土壤碳與氮含量以及顯著提高了植物生物量積累。有研究證明部分內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌可分泌甲酸、乙酸等有機酸，將土壤中的不溶性有機磷和無機磷轉(zhuǎn)換為可溶性的磷酸鹽，供寄主植物吸收和利用[30]。土壤磷酸酶可以水解土壤中的有機磷酯，將土壤中的有機磷轉(zhuǎn)化為植物可吸收的無機磷，土壤脲酶酶促反應(yīng)的產(chǎn)物為氨，其活性代表著土壤氮從有機態(tài)向有效態(tài)轉(zhuǎn)化的能力。蔗糖酶可以表征土壤生物活性強度[31]。過氧化氫酶能通過水解過氧化氫分解為水和氧的反應(yīng)，解除過氧化氫對植物的毒害作用，可以用來表征土壤的生化活性，過氧化氫酶與土壤有機質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，在土壤物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化中占重要地位[32]。本試驗結(jié)果與沈甜等[33]對施用PGPR 混合菌劑的蒲兒根研究結(jié)果一致，施用了PGPR 混合菌劑的蒲兒根株高、根長以及氮、磷、鉀含量均優(yōu)于未施加菌劑的對照組，施加PGPR 混合菌劑可提高植物對養(yǎng)分的利用，例如堿解氮、有效磷、速效鉀均有所增加，并且加入植物根際促生菌處理的土壤脲酶、蛋白酶、蔗糖酶、磷酸酶活性都顯著提高，分別提高了80.28%、217.11%、43.26%、61.89%。

假單胞桿菌1-42 與褐環(huán)乳牛肝菌N94 互作可以提高根際細(xì)菌和真菌群落的多樣性和豐富度。尹大川等[20]在研究復(fù)合接種褐環(huán)乳牛肝菌N94 與綠木霉T.virensT43 對樟子松根際土壤生物活性年際變化的影響時，發(fā)現(xiàn)N94 與T43 互作可以有效提高苗木根際細(xì)菌數(shù)量、真菌數(shù)量以及放線菌數(shù)量。有研究表明無機肥和微生物肥配施可以改良玉米根際土壤環(huán)境，增加土壤酶活性，提高土壤有機質(zhì)和土壤養(yǎng)分含量。同時配施微生物肥料可以影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，促進(jìn)根際優(yōu)勢菌群的定殖,進(jìn)而加快植物的生長發(fā)育[34]。姚曉遠(yuǎn)[35]在研究微生態(tài)調(diào)控對煙草根腐病的田間防治時，發(fā)現(xiàn)哈茨木霉Trichoderma harzianum和多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa均能抑制病原菌生長，對煙草根腐病有顯著防控效果，并均能顯著增加根際中溶桿菌屬Lysobacter、鞘脂單胞菌屬Sphingomonas和芽單胞菌屬Gemmatimonas的相對豐度，抑制紅球菌屬Rhodococcus和鐮刀菌屬Fusarium的相對豐度；能顯著增加根際有益微生物的數(shù)量、抑制病原菌的豐度，促進(jìn)根際土壤微生態(tài)環(huán)境向健康方向發(fā)展。菌根輔助細(xì)菌可以提高菌根菌與宿主植物菌根合成的效率，同時菌根菌的存在對輔助細(xì)菌生物量和功能也存在顯著影響[36]。菌根的存在也可以對植物根際土壤細(xì)菌類群起到正向調(diào)控作用，對菌根際的細(xì)菌尤其是熒光假單胞桿菌類群和功能多樣性的研究表明，菌根菌在提高宿主植物養(yǎng)分吸收和促進(jìn)生長的同時，對菌根際的細(xì)菌種類有定向選擇作用，從而使菌根際的微生物類群更加有利于其菌根合成[37]。本研究僅在盆栽條件下進(jìn)行，未涉及野外林間試驗，PGPR 與外生菌根互作對根際土壤微生物群落的影響僅能說明兩者之間的變化，且對于PGPR與外生菌根菌互作是通過什么途徑來影響宿主植物對其他營養(yǎng)以及微量元素的吸收與利用？PGPR與外生菌根菌的互作機制如何？這些問題還需要進(jìn)一步的研究。本試驗僅以假單胞桿菌與褐環(huán)乳牛肝菌作為代表，涉及菌株單一，但土壤微生物往往互相影響形成叢枝菌根網(wǎng)絡(luò)，PGPR 與外生菌根二者相互的選擇特異性較強，下一步試驗可豐富菌株種類，增加野外林間試驗。除了上述的生理生化影響以外，對于PGPR 對外生菌根菌定植宿主植物的影響是否存在最適方法？接種方式對試驗的最終結(jié)果是否會有影響？如何制備可以量產(chǎn)的菌根肥料將成為后續(xù)菌根技術(shù)應(yīng)用的一個重要方向。