油柿果實成熟過程中生理指標(biāo)的變化規(guī)律

韓衛(wèi)娟，傅建敏，王麗媛，王藝儒，刁松鋒，李華威，孫 鵬，索玉靜

（1.國家林業(yè)和草原局 泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2.經(jīng)濟林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，河南 鄭州 450003）

油柿Diospyros oleiferaCheng為柿科Ebebaceae柿屬Diospyros植物，落葉喬木，廣泛分布于中國中南部，與某些柿品種嫁接親和性好，可引起樹形矮化，提早結(jié)果，是良好的砧木種類[1-2]。油柿又稱洞柿、方柿、油柿子，果實成熟期10月底至12月初，果實未成熟時青綠色，單寧含量高，可用于提取柿漆；成熟時暗黃色，有易脫落的軟毛，既能鮮食，又可加工，風(fēng)味獨特，且兼有營養(yǎng)與藥用價值，開發(fā)潛力巨大[3-4]。

油柿作為二倍體（2n=2x=30）植物，是六倍體（2n=6x=90）柿的最近緣種[5-7]，在研究柿的起源方面具有重要價值，同時也是重要的育種親本。相對于二倍體君遷子，油柿的性別類型、果實發(fā)育特征等更相似于六倍體柿，所以目前已成為研究柿性別決定、果實大小、果實單寧合成等重要性狀的參考樹種。目前，已有報道的油柿相關(guān)研究主要集中在嫁接親和性、植株再生技術(shù)以及形態(tài)學(xué)研究等方面，果實品質(zhì)特征成分及果實發(fā)育過程中生理指標(biāo)的變化規(guī)律等相關(guān)研究尚未見文獻報道。

單寧、多酚、黃酮、可溶性固形物等是柿屬植物果實中最為重要的幾種有效成分，對果實的鮮食和加工品質(zhì)均有重要影響[8]。果膠主要存在于相鄰細(xì)胞間的胞間層中，起著粘連的作用，與果實質(zhì)地有密切關(guān)系[9]；半乳糖醛酸酶（PG）、果膠裂解酶（PL）和果膠甲酯酶（PME）參與果膠的降解[10-11]；質(zhì)地變軟是果實發(fā)育成熟的標(biāo)志之一，可直接影響果實的食用品質(zhì)、貯藏性和商品價值。本研究以不同發(fā)育時期的油柿果實為試驗材料，對成熟軟化過程中單寧、黃酮、總酚、果膠含量以及半乳糖醛酸酶（PG）、果膠裂解酶（PL）和果膠甲酯酶（PE）活性的變化規(guī)律進行研究，并分析其相關(guān)性，以期為油柿果實的深入開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)，以及為六倍體柿果實品質(zhì)特征性狀的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

油柿果實樣品采自中國林業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心原陽試驗基地（112°42′58″E，34°51′38″N），選擇樹勢健壯、無病蟲害的無性系單株，從東南西北4 個方向進行樣品的采集。在果實成熟期，分別于2019年9月25日、10月24日、11月28日、12月5日和12月13日（果實軟熟無澀味）采集油柿果實樣品，低溫冷藏運回實驗室，冰水沖洗后用紗布吸干表面水分，去皮并將果肉切碎經(jīng)液氮速凍于-80℃超低溫冰箱中保存，用于相關(guān)指標(biāo)的測定。

1.2 試驗方法

1.2.1 單寧含量的測定

可溶性單寧和不溶性單寧的測定采用Folin-Ciocalteu 法，參考Oshida 等[12]和余軒等[13]的方法，以單寧酸為標(biāo)準(zhǔn)品，725 nm 處測定吸光度，總單寧含量為可溶性單寧含量和不溶性單寧含量之和。

1.2.2 總酚含量的測定

總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu 法[14]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，765 nm 處測定吸光度，樣品中總酚含量以沒食子酸計。

1.2.3 黃酮含量的測定

黃酮含量的測定采用AlCl3-(HAc-NaAc)方法[14]，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，400 nm 處測定吸光度，樣品中總黃酮含量以蘆丁的含量表示。

1.2.4 可溶性糖含量及糖組分含量的測定

可溶性糖含量采用蒽酮比色法[15]測定。

糖組分的提取方法參照杜改改等[16]的方法并稍作改進。精密稱取5.000 g 果肉，10 mL 超純水80℃水浴中震搖提取60 min，冷卻后15 000 r/m離心20 min，上清液轉(zhuǎn)入25 mL 的容量瓶中，10 mL超純水再次提取殘渣，合并上清液后用超純水定容，搖勻后用0.22 μm 微孔濾膜過濾后上機測定。糖組分的檢測采用高效液相色譜法，色譜柱為Suger-Pak I 色譜柱6.5 mm×300 mm，柱溫為70℃，流動相為超純水，流速為0.5 mL·min-1，檢測器為Waters 410 示差折光檢測器。根據(jù)峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線計算果糖、葡萄糖、蔗糖的含量。

1.2.5 果膠組分含量的測定

參考齊秀東等[17]的方法進行水溶性果膠（WSP）、離子結(jié)合果膠（ISP）、共價結(jié)合果膠（CSP）的提取，以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)，用咔唑比色法測定各果膠組分。

1.2.6 果膠降解酶活性的測定

多聚半乳糖醛酸酶（PG）的提取和測定參考Ren 等[18]的方法并加以改進。PG 活性以每分鐘每克果肉在37℃催化半乳糖醛酸水解生成半乳糖醛酸的質(zhì)量表示，單位為mg·g-1h-1；果膠裂解酶（PL）的提取和測定參考Zhi 等[19]的方法并加以改進，PL 活性被定義為每分鐘作用果膠產(chǎn)生1 μmol 雙鍵所需的酶量，單位為U·g-1；果膠甲酯酶（PE）的提取和測定參考Guo 等[20]的方法并加以改進，PE活性被定義為每克果肉每分鐘吸光度值的變化，單位為ΔOD·g-1min-1。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 2019 軟件計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、線性回歸方程等指標(biāo)；利用SPSS 20.0 軟件進行方差分析、Duncan 多重比較（P＜0.05 水平）、Pearson 相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 油柿果實成熟過程中單寧含量的變化規(guī)律

油柿果實成熟軟化過程中單寧含量的變化規(guī)律如圖1所示。由圖1A 可知，可溶性單寧含量隨著果實的成熟顯著降低，果實軟熟后含量由39.91 mg·g-1降至1.96 mg·g-1，低于可食用閾值（2 mg·g-1）；不溶性單寧含量隨著果實發(fā)育過程逐漸上升，尤其在果實發(fā)育后期，部分可溶性單寧轉(zhuǎn)化為不溶性單寧，最后果實成熟軟化后含量上升至73.13 mg·g-1；總單寧含量在成熟過程中呈顯著下降的趨勢，果實軟熟后含量較軟熟前降低了30.79 mg·g-1，最終降至75.09 mg·g-1。

2.2 油柿果實成熟過程中總酚和黃酮含量的變化規(guī)律

油柿果實成熟軟化過程中總酚和黃酮含量的變化規(guī)律如圖1所示。由圖1B 可知，在成熟初期（9月25 號至10月24 號），油柿果實中總酚和黃酮含量無顯著性變化，隨后呈顯著下降的趨勢，達到可食用狀態(tài)后含量最低，分別為0.05 mg·g-1和5.87 mg·g-1。因此，在以總酚和黃酮為目的成分開發(fā)利用油柿果實時，最佳采收時期在10月下旬。

圖1 油柿果實成熟軟化過程單寧含量（A）和總酚、黃酮含量（B）的變化規(guī)律Fig.1 Changes of tannin content (A) and total phenolics,total flavonoids content (B) during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit

2.3 油柿果實成熟過程中可溶性糖含量及糖組分的變化規(guī)律

油柿果實成熟過程中可溶性糖含量的變化趨勢如圖2所示。由圖2可知，可溶性糖含量呈先下降后上升的變化趨勢，果實軟熟后可溶性糖含量最高，高達88.50 mg·g-1，這可能與果實成熟軟化過程中細(xì)胞壁組分的水解有關(guān)。果糖、葡萄糖和蔗糖含量的變化趨勢如圖2B所示，果糖和葡萄糖含量均表現(xiàn)出顯著增加的趨勢，蔗糖含量呈顯著下降的趨勢，其中葡萄糖含量＞果糖含量＞蔗糖含量，蔗糖與單糖（果糖+葡萄糖）的含量比值小于1，表明油柿果實糖積累類型為己糖積累型。

圖2 油柿果實成熟軟化過程中可溶性糖含量（A）和果糖、葡萄糖、蔗糖含量（B）的變化規(guī)律Fig.2 Changes of soluble sugar content (A) and fructose,glucose,sucrose content (B) during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit

2.4 油柿果實成熟過程中果膠含量的變化規(guī)律

WSP 主要由可溶性的果膠和果膠酸等組成，與細(xì)胞壁連接較疏松。由圖3A 可知，油柿果實成熟初期，WSP 含量緩慢增長，到12月初顯著增長，果實達到可食用程度后WSP 含量最高，達到4.44 mg·g-1。ISP 含量的變化趨勢與WSP 相似，其在成熟初期增長顯著，而到末期不再增加，在油柿果實成熟軟化后，含量達到4.67 mg·g-1（圖3B）。由圖3C 可知，CSP 含量呈先上升后下降的變化趨勢，果實軟熟達到可食用程度后含量顯著下降，因此，難溶型果膠CSP 含量的下降可能是油柿果實軟化的重要生理特征。

圖3 油柿果實成熟軟化過程中WSP（A）、ISP（B）和CSP（C）含量的變化規(guī)律Fig.3 Changes of WSP (A),ISP (B) and CSP (C) content during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit

2.5 油柿果實成熟過程中降解酶活性的變化規(guī)律

果膠降解酶與果實質(zhì)地軟化有著密切聯(lián)系，是果實成熟軟化的重要指標(biāo)。如圖4所示，油柿果實成熟軟化期間，PG 和PL 活性在果實成熟初期（9—11月）無顯著性變化，12月份后顯著上升（P＜0.05），果實軟熟后活性最高，分別為13.02 mg·g-1h-1和134.45 U·g-1。PME 可催化果膠酯轉(zhuǎn)變成果膠酸，為PG 酶提供作用條件。如圖4B所示，PME 活性在油柿果實成熟過程中呈逐漸上升趨勢，至12月初達到頂峰，隨后果實軟化時其含量稍微下降。

圖4 油柿果實成熟軟化過程中PG（A）、PME（B）和PL（C）活性的變化規(guī)律Fig.4 Changes of PG (A),PME (B) and PL (C) activity during ripening and softening of Diospyros oleifera Cheng fruit

2.6 油柿果實各生理指標(biāo)相關(guān)性分析

進一步對油柿果實成熟軟化過程的生理指標(biāo)進行相關(guān)性分析，結(jié)果（表1）表明，作為果實重要品質(zhì)指標(biāo)的可溶性單寧含量與總單寧、總酚和黃酮含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與不溶性單寧、可溶性糖、果糖、WSP、ISP 含量以及PG、PME 和PL 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01）；不溶性單寧含量與可溶性糖、果糖、WSP、ISP 含量及PG、PL 活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與葡萄糖含量、PME 活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），與總單寧、總酚和黃酮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與CSP含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），說明油柿可溶性單寧在油柿果實成熟軟化過程中逐漸轉(zhuǎn)化為不溶性單寧，且轉(zhuǎn)化過程與細(xì)胞壁組分的變化有關(guān)。

果解PL膠酶裂1膠酶果酯甲PME 1 0.421糖乳酶半酸聚醛PG多合結(jié)膠CSP共價果結(jié)膠ISP離合膠子果WSP性?溶果析水分性關(guān)糖Pearson 相蔗Sucrose標(biāo)葡Glucose糖萄指化生理糖生果Fructose中程過可Soluble性熟成溶糖sugar實果柿1 油黃Total Table 1 Pearson correlation coefficients analysis of physiological and biochemical indexes of Diospyrosoleifera Cheng fruit酮flavonoids表總Total酚polyphenols總Total寧單tannin寧溶Insoluble單性tannin不寧溶Soluble單性tannin 1可指Index寧標(biāo)可Soluble tannin單性溶1-0.801**寧單性溶不Insoluble tannin 1-0.676**0.980**寧單總Total tannin 1 0.964**-0.815**0.992**Total polyphenols 酚總1 0.929**0.855**-0.862**0.920**Total flavonoids 酮黃1-0.841**-0.708**-0.533*0.870**Soluble sugar -0.656**糖性溶可1 0.482-0.785**-0.915**-0.924**0.759**-0.943**Fructose 糖果1 0.927**0.293-0.705**-0.790**-0.867**0.599*-0.855**Glucose 糖萄葡1-0.907**-0.798**-0.057 0.428 0.520*0.600*-0.463 0.605*Sucrose 糖蔗1-0.339 0.573*0.711**0.927**-0.945**-0.859**-0.733**0.945**-0.836**WSP 膠果性溶水1 0.872**-0.556*0.736**0.921**0.731**-0.870**-0.949**-0.865**0.900**-0.935**ISP 膠果合結(jié)子離1-0.451-0.646**-0.348 0.197-0.081-0.821**0.479 0.339 0.097-0.622*0.250 CSP 膠果合結(jié)價共1-0.634*0.934**0.915**-0.403 0.581*0.788**0.880**-0.871**-0875**-0.740**0.952**-0.847**PG 酶酸醛糖乳半聚多0.656**0.131 0.773**0.494-0.893**0.903**0.933**0.267-0.563*-0.739**-0.779**0.619*-0.788**PME 酶酯甲膠果0.824**-0.600*0.731**0.880**-0.296 0.526*0.605*0.824**-0.879**-0.763**-0.652**關(guān)0.01 respectively.。性相著顯0.843**平0.05 and P ＜的下0.01 水-0.753**P ＜0.05 和P ＜PL示表酶別解裂**分膠果? *和* and ** show significant correlation in P ＜

總酚、黃酮與可溶性糖、果糖、葡萄糖、WSP、ISP 含量及PG、PME 和PL 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；可溶性糖與WSP、ISP 含量及PG和PL 活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與CSP 呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；果糖、葡萄糖與WSP、ISP 含量及PG、PME 和PL 活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系，說明油柿果實成熟過程中，在細(xì)胞壁降解酶的作用下，細(xì)胞壁多糖和果膠組分降解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)分離，進而導(dǎo)致果實的軟化和可溶性糖含量的升高。果實WSP 含量與ISP 含量、PG活性及PL 活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.872、0.915 和0.880，與CSP 含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為-0.646；PG 活性分別與PME、PL 活性呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)分別為0.656 和0.824，說明油柿果實成熟過程中，PG、PME 和PL 酶參與果膠的降解，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實的軟化。綜上所述，油柿果實的成熟軟化過程與單寧的轉(zhuǎn)化、細(xì)胞壁的完整性有極強的聯(lián)系，具體的軟化機制需進一步探究。

3 討 論

可溶性糖是水果中的重要營養(yǎng)成分，其種類和構(gòu)成比例在很大程度上影響果品的甜度和口感[21-22]。水果中的可溶性糖主要是葡萄糖、果糖和蔗糖[23]。本研究表明，油柿果實中葡萄糖含量最高，果糖次之，蔗糖最低，根據(jù)蔗糖與單糖的含量比值[24]，油柿果實糖積累類型為己糖積累型；油柿果實成熟過程中葡萄糖和果糖含量逐漸增加，使果實逐漸變甜，由于果糖甜度高、葡萄糖甜度低[25]，油柿果實葡萄糖含量高于果糖含量，使其在食用時甜而不膩。單寧和黃酮類物質(zhì)是植物中廣泛存在的次生代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、抗衰老、降三高、提高免疫力等醫(yī)療保健作用[26-28]。本研究表明，油柿果實成熟后可溶性單寧含量降至可食用閾值以下，而仍保留較高水平的總單寧和總黃酮含量，且果實風(fēng)味獨特，甜而不膩，開發(fā)利用潛力巨大。

果膠是構(gòu)成細(xì)胞初生壁和胞間中膠層的主要成分，在果實成熟之前呈不溶狀態(tài)，隨著果實成熟軟化逐步降解，使果膠的平均分子質(zhì)量和果膠多糖交聯(lián)能力下降，細(xì)胞結(jié)構(gòu)隨之受損，導(dǎo)致果實軟化[10]。通過對油柿果實成熟軟化過程中果膠含量的動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)WSP 和ISP 含量在成熟軟化過程中呈上升的變化趨勢，果實達到可食用程度后含量最高；CSP 含量呈先上升后下降的變化趨勢，果實軟熟達到可食用程度后含量顯著下降。齊秀東等[17]對‘京白梨’發(fā)育軟化與果膠關(guān)系的研究表明，WSP 和ISP 含量逐漸增加，而CSP 含量先升后降；羅自生[9]對柿果實采后軟化過程中細(xì)胞壁組分的研究表明，WSP 含量逐漸增加。這些研究結(jié)果均與本研究結(jié)果一致。

PG 是多聚-α-1,4-半乳糖醛酸聚糖水化酶，是可分解果膠或果膠酸酶類中的一種，亦稱果膠酶或果膠解聚酶，能作用于果膠分子，使果膠降解、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實軟化[29]。PME 主要功能是去除果膠中的半乳糖醛酸殘基C-6 酯化基團，催化果膠酯酸轉(zhuǎn)化為果膠酸，只有去酯化的果膠才能被PG 水解，PG 與PME 可協(xié)同發(fā)生作用[30]。果膠裂解酶是一種果膠酶，其主要功能是在果實成熟軟化過程中參與果膠結(jié)構(gòu)的裂解[31]。本研究表明，PME 活性在油柿果實成熟軟化過程中呈逐漸上升的趨勢，PG 和PL 在12月份果實軟熟過程中活性顯著上升。此外，相關(guān)性分析表明，PG、PME 和PL 活性與可溶性單寧、總單寧、總酚及黃酮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，與果糖、葡萄糖含量呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；果實WSP 和ISP含量均與PG、PL 活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，CSP與PG、PL 活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，ISP 含量與PME 呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，說明PG、PME 和PL酶在油柿果實成熟軟化過程中參與催化了細(xì)胞壁多糖和果膠組分降解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)分離，使難溶性果膠（CSP）發(fā)生降解或解聚成可溶性果膠多糖（WSP 和ISP），從而導(dǎo)致油柿果實的成熟軟化、可溶性糖含量升高以及活性成分的變化。果實的成熟軟化是一個復(fù)雜的生理生化過程。本試驗中，油柿果實水溶性果膠和離子結(jié)合果膠含量的上升、共價結(jié)合果膠含量的下降是在PG、PME 和PL 的協(xié)同作用下完成的，而引起油柿果實細(xì)胞壁組分變化的深層機理還有待進一步揭示。下一步研究可基于油柿基因組圖譜開展油柿果實單寧合成及轉(zhuǎn)化的分子機制研究，以及油柿果實成熟的分子調(diào)控機理研究，以期為六倍體柿果實重要性狀分子機理的解析提供參考。

4 結(jié) 論

本研究以不同發(fā)育時期的油柿果實為材料，測定了成熟軟化過程中單寧、總酚、黃酮、可溶性糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、果膠含量以及半乳糖醛酸酶（PG）、果膠裂解酶（PL）和果膠甲酯酶（PME）活性的變化規(guī)律，為油柿果實的深入開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。研究發(fā)現(xiàn)，在油柿果實成熟軟化過程中，可溶性單寧、總酚和黃酮含量持續(xù)降低，不溶性單寧、WSP 和ISP 含量持續(xù)上升，CSP 含量先上升后下降；果糖和葡萄糖含量逐漸上升，蔗糖含量顯著下降，其中葡萄糖含量＞果糖含量＞蔗糖含量，糖積累類型為己糖積累型；PME 活性逐漸上升，PG 和PL 活性在果實成熟后期顯著上升，相關(guān)分析表明難溶型果膠CSP 含量與PG 和PL 活性呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，CSP 含量的下降可能是油柿果實軟化的重要生理特征之一。PG、PME 和PL 酶在油柿果實成熟軟化過程中參與催化了細(xì)胞壁多糖和果膠組分降解，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)分離，使難溶性果膠（CSP）發(fā)生降解或解聚成可溶性果膠多糖（WSP 和ISP），從而導(dǎo)致油柿果實的成熟軟化、可溶性糖含量升高以及活性成分的變化。