馬尾松優(yōu)良家系不定芽誘導(dǎo)及腋芽高效增殖組培體系構(gòu)建與優(yōu)化

尚瑀琪，楊模華，段潤(rùn)梅，徐 萌，張 鈺，陳 藝，李亞婧

（中南林業(yè)科技大學(xué) 林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

馬尾松Pinus massonianaLamb.是我國(guó)南方重要的鄉(xiāng)土造林用材樹(shù)種和工業(yè)原料樹(shù)種，具有適應(yīng)性強(qiáng)、耐干旱瘠薄、速生豐產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)；當(dāng)前，馬尾松松材線蟲(chóng)病嚴(yán)重威脅著馬尾松林產(chǎn)工業(yè)的健康發(fā)展，選育和栽培抗松材線蟲(chóng)病的馬尾松優(yōu)良家系或無(wú)性系，開(kāi)展抗性雜交育種或倍性育種，并對(duì)育種選育成果進(jìn)行擴(kuò)繁利用、栽培推廣，是從根本上防治和減輕松材線蟲(chóng)病及其危害的重要途徑之一。針葉樹(shù)器官發(fā)生組培快繁體系的構(gòu)建是短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)珍貴稀有種質(zhì)快速擴(kuò)繁、保存和利用的生物技術(shù)育種手段之一，構(gòu)建馬尾松優(yōu)良家系種胚不定芽誘導(dǎo)及其腋芽高效增殖的組培快繁植株再生體系在對(duì)馬尾松抗性育種所獲得的珍貴抗性育種材料的擴(kuò)繁利用中將發(fā)揮重要作用。

馬尾松組織培養(yǎng)植株再生已得到林木育種界的普遍關(guān)注，現(xiàn)有的報(bào)道表明，分別采用馬尾松成熟胚、無(wú)菌苗或幼胚等為外植體，應(yīng)用6-BA、KT、NAA 等細(xì)胞分裂素類(lèi)或生長(zhǎng)素類(lèi)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑經(jīng)器官發(fā)生不定芽誘導(dǎo)，已取得馬尾松組培植株再生的成功[1-3]。姚瑞玲等[4-6]以馬尾松組培繼代芽、莖段芽等材料為外植體，經(jīng)不定芽誘導(dǎo)獲得完整再生植株，并將獲得的馬尾松組培苗成功應(yīng)用于造林實(shí)踐。然而，高質(zhì)量不定芽誘導(dǎo)困難仍舊是馬尾松組培快繁應(yīng)用的技術(shù)瓶頸之一，尤其是對(duì)珍貴稀有的育種材料或少量的優(yōu)良抗性種質(zhì)而言，構(gòu)建一個(gè)穩(wěn)定、高效的對(duì)珍貴稀有種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)繁利用的組培體系，是保障優(yōu)良種質(zhì)安全的基本要求。

為穩(wěn)定地誘導(dǎo)出高質(zhì)量的不定芽，一般采用不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及其水平組合來(lái)調(diào)控松屬Pinusspp.樹(shù)種組培不定芽誘導(dǎo)與分化。許多研究已普遍關(guān)注到6-BA 等細(xì)胞分裂素類(lèi)物質(zhì)的濃度水平對(duì)松類(lèi)組培不定芽誘導(dǎo)具有顯著性影響[7-10]，然而僅有少量研究關(guān)注到生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類(lèi)物質(zhì)持續(xù)作用于外植體的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)也會(huì)對(duì)松類(lèi)組培不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著性影響[11-13]。如Pérez-bermúdez 等[11]在濕地松Pinus elliottii不定芽誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，6-BA不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)水平對(duì)濕地松外植體不定芽誘導(dǎo)有顯著的影響；Webb 等[12]在北美喬松Pinus strobus不定芽誘導(dǎo)植株再生研究中發(fā)現(xiàn)，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)均不利于北美喬松不定芽的誘導(dǎo)分化。近些年來(lái)，在火炬松Pinus taeda[13]、意大利松Pinus pinea[8,14]等松屬樹(shù)種的組培研究中也發(fā)現(xiàn)，子葉胚外植體在6-BA 長(zhǎng)時(shí)間持續(xù)作用下對(duì)其不定芽誘導(dǎo)質(zhì)量及其不定芽伸長(zhǎng)均有較大影響，且植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑誘導(dǎo)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，外植體易發(fā)生愈傷化、玻璃化現(xiàn)象，還易產(chǎn)生矮小芽。Cortizo 等[15]開(kāi)展了不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)下意大利松成熟合子胚對(duì)外源6-BA 吸收與代謝的生理響應(yīng)研究，結(jié)果表明外植體對(duì)外源6-BA 的吸收及代謝等生理響應(yīng)在不同時(shí)長(zhǎng)處理下具有顯著性差異。因此在松屬樹(shù)種器官發(fā)生不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，探討獲得一個(gè)適宜的外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑持續(xù)作用的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)誘導(dǎo)獲得高質(zhì)量不定芽也十分關(guān)鍵。為誘導(dǎo)獲得高質(zhì)量的不定芽，對(duì)培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及其處理時(shí)長(zhǎng)的交互作用對(duì)芽誘導(dǎo)影響的研究，值得探討。另外，不定芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)、腋芽增殖發(fā)生、生根誘導(dǎo)等，同樣是培養(yǎng)基環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度與時(shí)長(zhǎng)處理共同作用于培養(yǎng)物的結(jié)果。因此，本研究為構(gòu)建穩(wěn)定、高效的馬尾松成熟胚芽誘導(dǎo)與增殖組培快繁植株再生體系，在馬尾松成熟胚不定芽誘導(dǎo)、不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)、莖段腋芽增殖發(fā)生、莖段腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)與生根誘導(dǎo)過(guò)程中，開(kāi)展植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、IBA 濃度及其誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的優(yōu)化探討，為馬尾松抗性育種、雜交育種或倍性育種獲得的少量珍稀優(yōu)良種質(zhì)的保存利用提供穩(wěn)定、高效的組培擴(kuò)繁利用平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)材料所用的馬尾松成熟種子來(lái)自浙江省淳安縣姥山林場(chǎng)國(guó)家馬尾松良種基地二代種子園的56 號(hào)優(yōu)良家系，由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所饋贈(zèng)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子預(yù)處理

選擇飽滿、完整的馬尾松成熟種子備用，先用自來(lái)水快速?zèng)_洗，撈出飽滿種子瀝干水分，再用鑷子小心地去除外種皮，把去皮種子置于4℃冰箱冷藏備用，不超過(guò)24 h 接種處理。

1.2.2 外植體消毒滅菌處理

馬尾松去皮種子先在燒杯中用 0.5% K2MnO4溶液攪拌浸泡30 min，無(wú)菌水清洗2～3 次，去除K2MnO4殘留液；然后將種子轉(zhuǎn)移至無(wú)菌燒杯中，置于超凈工作臺(tái)上進(jìn)行去皮種子滅菌處理：先用75%的酒精浸潤(rùn)30 s，無(wú)菌水清洗3 次，再用0.1%升汞溶液攪拌浸泡處理6 min，最后用無(wú)菌水沖洗3～5 次；將滅菌處理后的去皮種子轉(zhuǎn)移到無(wú)菌培養(yǎng)皿中備用；外植體接種處理時(shí)，先用無(wú)菌手術(shù)刀片小心劃開(kāi)胚乳，無(wú)菌剝?nèi)》N胚，放置于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)處理的培養(yǎng)基中，進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。

1.2.3 馬尾松成熟胚初代不定芽誘導(dǎo)

馬尾松不定芽誘導(dǎo)以WPM 為基本培養(yǎng)基（WPM1），添加30.0 g·L-1蔗糖和8.5 g·L-1瓊脂，培養(yǎng)基pH 值調(diào)至5.8，裝入組培玻璃瓶中，121℃高溫高壓滅菌20 min，冷卻凝固后使用。6-BA 濃度設(shè)置3 個(gè)水平處理：4.4、11.1、44.4 μmol·L-1。6-BA誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)設(shè)置5 個(gè)水平處理：2、4、8、16、32 d。以上濃度和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)按因素和水平進(jìn)行完全隨機(jī)組合，計(jì)15 個(gè)處理，另加一個(gè)對(duì)照處理CK（6-BA 0.0 μmol·L-1，0 d），共16 個(gè)處理。每處理接種36 個(gè)馬尾松成熟合子胚，每處理3 次重復(fù)。每一濃度與時(shí)長(zhǎng)誘導(dǎo)處理完成時(shí)，該處理下的外植體均及時(shí)轉(zhuǎn)接到WPM 初次繼代培養(yǎng)基（WPM2）（含3.0 g?L-1活性炭，不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）中培養(yǎng)28 d，然后再轉(zhuǎn)接至WPM 繼代培養(yǎng)基（WPM3）（無(wú)活性炭，無(wú)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑）中繼代培養(yǎng)。定期觀察記錄外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)及其變化，接種處理開(kāi)始后40 d 觀察記錄叢生芽誘導(dǎo)數(shù)量、芽長(zhǎng)、芽生長(zhǎng)狀況等，計(jì)算不定芽誘導(dǎo)率及其增殖系數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 馬尾松不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)

將經(jīng)過(guò)6-BA 不同濃度和不同時(shí)長(zhǎng)誘導(dǎo)處理后的外植體，初次轉(zhuǎn)接至WPM2 初次繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)28 d，然后再轉(zhuǎn)接至WPM3 繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代周期為28 d。伸長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，定期拍照、觀察記錄外植體上不定芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，記錄不定芽數(shù)量、長(zhǎng)度、長(zhǎng)勢(shì)等表型數(shù)據(jù)，對(duì)各個(gè)處理自接種后第60 天或連續(xù)繼代3～4 次后的不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)記錄得到的各項(xiàng)觀察指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 馬尾松莖段腋芽增殖培養(yǎng)

以經(jīng)過(guò)伸長(zhǎng)培養(yǎng)后的不定芽為外植體，無(wú)菌條件下切割為單個(gè)不定芽或1.5～2.0 cm 長(zhǎng)的莖段，作為腋芽增殖用外植體。將切割的莖段芽接種至WPM 基本培養(yǎng)基（WPM4）中，進(jìn)行莖段腋芽增殖培養(yǎng)，分別開(kāi)展6-BA 濃度和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的單因素處理試驗(yàn)。6-BA 設(shè)置3 個(gè)水平：4.4、11.1、22.2 μmol·L-1，誘導(dǎo)32 d。誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)設(shè)置3 個(gè) 水平：8、16、32 d。附加6-BA 濃度為11.1 μmol·L-1。莖段腋芽增殖培養(yǎng)結(jié)束后，將莖段外植體轉(zhuǎn)接至伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)（WPM5），見(jiàn)1.2.6處理。自增殖處理開(kāi)始后第40 天觀察記錄從葉腋誘導(dǎo)出的腋芽數(shù)，測(cè)量芽長(zhǎng)，觀察記錄腋芽誘導(dǎo)生長(zhǎng)狀態(tài)，計(jì)算腋芽增殖系數(shù)，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.6 馬尾松莖段腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)

將叢生腋芽于無(wú)菌條件下切割為單芽，進(jìn)行腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)。腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)分別考慮WPM 基本培養(yǎng)基中銨硝比（NH4+/ NO3-）或IBA 與6-BA 的添加對(duì)芽伸長(zhǎng)的影響（WPM5），分別開(kāi)展不同銨硝比（NH4+/ NO3-）或IBA+6-BA處理的單因素試驗(yàn)。銨硝比（NH4+/ NO3-）設(shè)置4 個(gè)水平：0、0.2～0.4、0.5（對(duì)照）、0.8～1.0。IBA+6-BA 設(shè)置5 個(gè)水平（μmol·L-1）：0+0.44（IBA 對(duì)照）、0.49+0.44、0.98+0.44、1.96+0.44、0.98+0（6-BA 對(duì)照）。腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)過(guò)程中，每30 d 觀察記錄腋芽長(zhǎng)度、生長(zhǎng)狀況等，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.7 馬尾松伸長(zhǎng)腋芽生根誘導(dǎo)

將經(jīng)伸長(zhǎng)培養(yǎng)獲得的長(zhǎng)度大于1.5 cm 的單芽轉(zhuǎn)到1/2WPM（大量元素減半）生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)（WPM6），附加IBA 濃度0、4.9、9.8、19.6 μmol·L-1，28 d 后，將已觀察到帶根原基的組培苗轉(zhuǎn)接至無(wú)激素的1/2WPM 培養(yǎng)基（WPM7）中。自生根誘導(dǎo)培養(yǎng)開(kāi)始后第40 天統(tǒng)計(jì)生根情況，包括生根的外植體數(shù)、生根率、不定根數(shù)量、不定根長(zhǎng)度、根系生長(zhǎng)狀態(tài)等。

1.3 培養(yǎng)條件

以上所有處理均放置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)室環(huán)境設(shè)置：培養(yǎng)溫度（23±2）℃，光照強(qiáng)度為2 000～3 000 lx，光暗周期16 h/8 h。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

利用Excel 2010 和SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)分別進(jìn)行雙因素方差分析和單因素方差分析，在ɑ=0.05 水平上進(jìn)行LSD 重比較。每處理中不定芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)按以下公式計(jì)算：

不定芽誘導(dǎo)率=（誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù) /接種成活外植體總數(shù)）×100%；

增殖系數(shù)=誘導(dǎo)出的不定芽總數(shù)/已誘導(dǎo)出不定芽的外植體數(shù)；

生根率=（誘導(dǎo)出根的外植體數(shù)/接種成活外植體總數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬尾松成熟胚芽誘導(dǎo)及腋芽增殖組培快繁體系的構(gòu)建

通過(guò)對(duì)組織培養(yǎng)體系中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、IBA 濃度及處理時(shí)長(zhǎng)影響效應(yīng)的探討，成功優(yōu)化并建立了馬尾松優(yōu)良家系成熟胚不定芽誘導(dǎo)與腋芽增殖的植株再生快繁體系（圖1）。以成熟合子胚為初始外植體進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)（圖1A），經(jīng)高濃度44.4 μmol·L-16-BA 誘導(dǎo)處理中長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)16 d，繼代伸長(zhǎng)培養(yǎng)后可誘導(dǎo)出大量翠綠健壯的不定芽叢（圖1B），其增殖系數(shù)約為8；無(wú)菌條件下將叢生芽切割為 單個(gè)不定芽（圖1C），在低硝銨比WPM 伸長(zhǎng)培養(yǎng)基中獲得較好的伸長(zhǎng)培養(yǎng)效果（圖1D）；待芽長(zhǎng)＞1.5 cm 時(shí)，添加中高濃度22.2 μmol·L-16-BA 誘導(dǎo)32 d 的時(shí)長(zhǎng)處理，進(jìn)行腋芽增殖培養(yǎng)，其增殖數(shù)量平均可達(dá)10 左右，最高可達(dá)36～40（圖1E）；將叢生腋芽分割為單芽進(jìn)行腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)（圖1F），最后對(duì)其進(jìn)行生根誘導(dǎo)，獲得再生植株（圖1G）。

圖1 馬尾松成熟合子胚器官發(fā)生植株再生體系的構(gòu)建Fig.1 Micropropagation via organogenesis using mature zygotic embryo in masson pine tissue culture

2.2 6-BA 濃度及其誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)處理下馬尾松成熟合子胚不定芽誘導(dǎo)發(fā)生的形態(tài)學(xué)觀察

圖2為6-BA 濃度及其誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)不同處理下馬尾松成熟合子胚不定芽誘導(dǎo)與生長(zhǎng)的形態(tài)學(xué)觀察不同階段的表型表現(xiàn)，結(jié)果表明，隨著6-BA 濃度的增加或處理時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng)，不定芽誘導(dǎo)和不定芽生長(zhǎng)狀態(tài)呈現(xiàn)規(guī)律性的增強(qiáng)效應(yīng)，且濃度與時(shí)長(zhǎng)處理間不定芽誘導(dǎo)的交互效應(yīng)明顯（圖2）。低濃度（4.4 μmol·L-1）6-BA 誘導(dǎo)處理4 d 后，種胚開(kāi)始萌動(dòng)，胚軸增粗，顏色由白色變?yōu)榉奂t色，子葉張開(kāi)，其顏色也由淡黃色逐漸變?yōu)辄S綠色（圖2B1）；誘導(dǎo)處理8 d 后的合子胚外植體，子葉為嫩綠色，胚軸膨大量比處理4 d 的更粗，并開(kāi)始彎曲（圖2C1）；誘導(dǎo)處理16 d 的合子胚外植體，子葉完全張開(kāi)，胚軸和子葉均增粗明顯，表面出現(xiàn)顆粒狀突起，胚軸基部出現(xiàn)膨大的粉色團(tuán)狀物（圖2D1）。誘導(dǎo)處理32 d 的合子胚外植體，子葉增粗伸長(zhǎng)，在近子葉的胚軸處發(fā)現(xiàn)有較多明顯突出的芽原基突起（圖2E1）。而在中、高濃度6-BA（11.1,44.4 μmol·L-1）處理下，不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的合子胚外植體狀態(tài)與低濃度處理時(shí)比較，胚軸和子葉均有顯著的增粗、愈傷化逐漸明顯的表 現(xiàn)，尤其在高濃度6-BA（44.4 μmol·L-1）處理32 d 時(shí)，子葉頂端及胚軸處出現(xiàn)明顯的淡黃色愈傷組織（圖2O1）。各個(gè)誘導(dǎo)處理結(jié)束后，將合子胚外植體分別轉(zhuǎn)移至繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)。在低濃度6-BA（4.4 μmol·L-1）誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，短時(shí)長(zhǎng)（2、4 d）誘導(dǎo)處理，對(duì)不定芽誘導(dǎo)無(wú)明顯效果，常出現(xiàn)單芽苗（圖2A2—B2）；中時(shí)長(zhǎng)（8 d）誘導(dǎo)處理，可誘導(dǎo)產(chǎn)生1～2 個(gè)不定芽（圖2C2）；中時(shí)長(zhǎng)（16 d）和長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)誘導(dǎo)（32 d）的處理，其誘導(dǎo)分化出的不定芽數(shù)量明顯增多，不定芽針葉翠綠，莖段粗壯（圖2D2—E2）。在中濃度6-BA（11.1 μmol·L-1）誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)2、4 d 時(shí)，其誘導(dǎo)分化出不定芽數(shù)量較少，單株外植體僅能分化1～2 個(gè)不定芽（圖2F2—G2）；誘導(dǎo)8、16 d 的處理相比于同時(shí)長(zhǎng)的低濃度6-BA 培養(yǎng)條件下，外植體不定芽數(shù)明顯增多（圖2H2—I2）；誘導(dǎo)32 d 時(shí)，其不定芽叢顯著增多，但表面開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織，且芽體矮小（圖2J2）。在高濃度6-BA（44.4 μmol·L-1）誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，與低、中濃度6-BA 短時(shí)長(zhǎng)（2、4、8 d）不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)處理相比較，其高濃度時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽數(shù)量顯著增多（圖2K2—O2）；而在誘導(dǎo)16 d 的中時(shí)長(zhǎng)處理下，外植體上僅有少量不定芽伸長(zhǎng)，更多的是形成密集的增殖芽點(diǎn)（圖2N2）；誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為32 d 的長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)處理中，不定芽的頂端和葉均分化不明顯，僅形成矮小芽叢，且與培養(yǎng)基接觸的基部形成了大團(tuán)狀愈傷組織（圖2O2）。馬尾松合子胚外植體在6-BA 不同濃度與不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)處理下所獲得的不定芽，繼代伸長(zhǎng)培養(yǎng)不定芽生長(zhǎng)狀態(tài)主要可分為三類(lèi)：一是不定芽數(shù)量少，芽體纖細(xì)，生長(zhǎng)較弱；二是不定芽數(shù)量多，芽體粗壯，顏色翠綠，生長(zhǎng)狀態(tài)良好；三是不定芽基部較多愈傷組織，不定芽生長(zhǎng)不良。

圖2 6-BA 濃度一定時(shí)不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)處理下不定芽誘導(dǎo)初期和繼代培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)觀察Fig.2 Morphological observation of adventitious bud induced at a specific concentration of 6-BA with different induction durations in two stages

2.3 不同6-BA 濃度及其誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

以時(shí)長(zhǎng)為分組，分別對(duì)6-BA 低、中、高（4.4、11.1、44.4 μmol·L-1）不同濃度處理下不定芽數(shù)和芽長(zhǎng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖，結(jié)果（圖3A—B）表明，特定時(shí)長(zhǎng)處理下6-BA 不同濃度處理間具有顯著性差異（P＜0.05）。誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)較短時(shí)，6-BA 濃度對(duì)不定芽數(shù)量的誘導(dǎo)起顯著的促進(jìn)作用，但誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)較長(zhǎng)時(shí)，濃度效應(yīng)不太明顯。如誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為4 d時(shí)，6-BA 高濃度處理下不定芽的增殖系數(shù)可達(dá)到低濃度處理下的4.76 倍（5.15 與1.08）；而在中時(shí)長(zhǎng)（16 d）誘導(dǎo)處理時(shí)，低濃度處理也能達(dá)到6.02的增殖系數(shù)，與中濃度處理（6.56）差異不顯著（P＞0.05），與高濃度處理（7.78）有顯著性差異（P＜0.05），但高、低濃度增殖系數(shù)的比值也僅為1.29（7.78 與6.02）。過(guò)短的誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)（2 d）處理下，6-BA 無(wú)論是低、中還是高濃度水平，均只得到了1.0～2.5 倍的不定芽增殖率（1.00、1.47、2.49）；而誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)過(guò)長(zhǎng)（32 d）時(shí)，各濃度處理下所獲得的正常不定芽數(shù)出現(xiàn)減少的現(xiàn)象（圖3A），芽體也較矮小（圖3B）。因此，植物組培高質(zhì)量的不定芽誘導(dǎo)中，既要考慮培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度水平，也要同時(shí)重點(diǎn)關(guān)注外植體置于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的處理時(shí)長(zhǎng)。

圖3 6-BA 濃度及其誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)不定芽誘導(dǎo)及其芽長(zhǎng)生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effects of 6-BA with different concentrations and its durations on induction of adventitious bud and its bud length in masson pine tissue culture

分別以6-BA 低、中、高濃度為分組，展示不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)（2、4、8、16、32 d）處理下不定芽誘導(dǎo)及芽長(zhǎng)的變化趨勢(shì)（圖3C—D）。結(jié)果表明，特定6-BA 濃度處理下，不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)馬尾松不定芽誘導(dǎo)增殖及其芽生長(zhǎng)有顯著性差異（P＞0.05）。在特定濃度內(nèi)，隨著誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng)，不定芽數(shù)量先增加后下降（圖3C），而不定芽的長(zhǎng)度則隨6-BA 濃度的增加呈現(xiàn)規(guī)律性下降（圖3D）。在6-BA 低濃度（4.4 μmol·L-1）處理下，不定芽分化的數(shù)量在兩個(gè)短時(shí)長(zhǎng)（2、4 d）處理間差異不顯著（P＞0.05），但兩短時(shí)長(zhǎng)處理與中、長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)（8、16、32 d）處理間有顯著性差異（P＜0.05），以上4 種處理下，芽長(zhǎng)均在1.0 cm 以上。6-BA 中、高濃度（11.1、44.4 μmol·L-1）處理下，誘導(dǎo)8、16 d 的處理均獲得了比誘導(dǎo)32 d 的處理較好的不定芽誘導(dǎo)增殖效果（圖3C），而在誘導(dǎo)32 d 處理下，其芽長(zhǎng)僅在0.5 cm 左右（圖3D），在后期繼代培養(yǎng)時(shí)芽的生長(zhǎng)勢(shì)嚴(yán)重受限，這說(shuō)明在中高濃度下增加誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)會(huì)嚴(yán)重抑制芽的生長(zhǎng)。在6-BA 不同濃度水平內(nèi)，誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為16 d 的處理均達(dá)到最高的不定芽誘導(dǎo)增殖系數(shù)，分別為6.02、6.56、7.78，且不定芽長(zhǎng)勢(shì)良好，該濃度及其時(shí)長(zhǎng)的處理可以作為今后馬尾松高質(zhì)量不定芽誘導(dǎo)的推薦方案。

6-BA 濃度水平與誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)不定芽誘導(dǎo)具有顯著的交互效應(yīng)（P＜0.05）。6-BA 濃度與時(shí)長(zhǎng)的交互處理，不僅影響成熟胚不定芽的增殖數(shù)量，也極大地影響成熟胚不定芽的芽長(zhǎng)及其生長(zhǎng)勢(shì)。研究發(fā)現(xiàn)6-BA低濃度（4.4 μmol·L-1）、長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)（32 d）處理與6-BA 高濃度（44.4 μmol·L-1）、短時(shí)長(zhǎng)（4 d）處理，不定芽分化效果基本一致，不定芽數(shù)量多，平均增殖系數(shù)均在5 左右，且芽體顏色翠綠，莖段粗壯（圖2E2、L2）；同時(shí)6-BA 濃度與時(shí)長(zhǎng)的交互效在兩個(gè)極值水平的組合上表現(xiàn)得尤為突出。當(dāng)同為6-BA 短時(shí)長(zhǎng)（2 d）處理時(shí)，6-BA低濃度（4.4 μmol·L-1）處理中幾乎沒(méi)有不定芽誘導(dǎo)發(fā)生（圖2A2），而 6-BA 高濃度（44.4 μmol·L-1）則能誘導(dǎo)出少量不定芽（圖2K2），其增殖系數(shù)在1.0～3.0 之間變動(dòng)，具有相對(duì)較高的芽長(zhǎng)生長(zhǎng)量，單芽的芽長(zhǎng)在2.0～2.5 cm 范圍，不定芽生長(zhǎng)狀態(tài)較纖細(xì)；當(dāng)同為6-BA 長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)（32 d）處理時(shí)，6-BA 低濃度就能誘導(dǎo)產(chǎn)生數(shù)量較多、質(zhì)量較高的不定芽（圖2E2），增殖系數(shù)可達(dá)5.12，可芽長(zhǎng)相對(duì)其他誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)下較矮，僅在1.0 cm 左右，而6-BA的高濃度卻誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量愈傷組織團(tuán)，并從愈傷組織團(tuán)上再分化出較多不定芽（圖2O2），然而，盡管此處理下不定芽數(shù)量較多，但芽叢矮小，且這些矮小芽在后期的繼代培養(yǎng)中很難伸長(zhǎng)培養(yǎng)長(zhǎng)成正常的芽苗。因此，在組織培養(yǎng)不定芽誘導(dǎo)中，關(guān)注不定芽誘導(dǎo)數(shù)量多少的同時(shí)，也需考慮不定芽的誘導(dǎo)質(zhì)量高低，而不定芽誘導(dǎo)的數(shù)量和質(zhì)量問(wèn)題，可以通過(guò)調(diào)控誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度及其誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)予以解決。

2.4 馬尾松莖段腋芽繼代增殖

2.4.1 6-BA 濃度對(duì)馬尾松莖段腋芽繼代增殖的影響

在誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為32 d的處理下，不同濃度的6-BA（4.4、11.1、22.2 μmol·L-1）對(duì)馬尾松莖段不定芽繼代增殖有顯著影響（P＜0.05）。由表1可知，腋芽增殖數(shù)隨6-BA 濃度的升高而顯著提高，呈現(xiàn)規(guī)律性地增加，而腋芽長(zhǎng)度卻隨6-BA 濃度升高呈現(xiàn)規(guī)律性地降低。在6-BA 低濃度（4.4 μmol·L-1）和中濃度（11.1 μmol·L-1）處理下，兩者腋芽增殖系數(shù)的比值僅為1.11（4.29 與3.85），腋芽長(zhǎng)度均在1.1～1.3 cm 之間，均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。在6-BA 高濃度（22.2 μmol·L-1）處理下，腋芽增殖系數(shù)最高，為10.15，與6-BA 低濃度和中濃度處理相比，增殖系數(shù)分別明顯提高了2.63、2.37 倍，處理間具有顯著性差異（P＜0.05），但腋芽長(zhǎng)度明顯降低，降低至0.75 cm 左右。這說(shuō)明6-BA 高濃度可以有效促進(jìn)腋芽的增殖分化，但會(huì)抑制其芽伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

表1 一定誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)下不同6-BA 濃度對(duì)馬尾松腋芽增殖的影響?Table 1 Effect of 6-BA concentrations under specific induction duration on the proliferation of axillary buds in masson pine tissue culture

不同6-BA 濃度對(duì)馬尾松腋芽增殖的差異表現(xiàn)見(jiàn)圖4。由圖4可知，6-BA 低濃度（4.4 μmol·L-1）與中濃度（11.1 μmol·L-1）處理下單株外植體的腋芽分化數(shù)量為3～5 個(gè)，每個(gè)葉腋誘導(dǎo)出1～2個(gè)腋芽，腋芽顏色翠綠，生長(zhǎng)正常（圖4B—C）。6-BA 高濃度（22.2 μmol·L-1）處理下，單株外植體腋芽分化數(shù)量均在7 個(gè)以上，最高可達(dá)36～40個(gè)，每個(gè)葉腋誘導(dǎo)出多個(gè)腋芽，且芽體健壯翠綠（圖4D）。通過(guò)圖4不同處理的比較，可以更加直觀地觀察到6-BA 濃度對(duì)腋芽增殖效應(yīng)的差異，高濃度6-BA（22.2 μmol·L-1）對(duì)馬尾松腋芽增殖處理的效果更顯著。

圖4 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)一定時(shí)，不同 6-BA 濃度對(duì)腋芽增殖的差異表現(xiàn)Fig.4 Differential performance of axillary bud proliferation in different 6-BA concentration under an specific induction duration

2.4.2 6-BA 誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)馬尾松莖段腋芽繼代增殖的影響

不定芽單芽在含6-BA 11.1 μmol·L-1的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，結(jié)果（表2和圖5）表明，不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)（8、16、32 d）對(duì)馬尾松腋芽增殖及芽生長(zhǎng)具有顯著性影響（P＜0.05）。隨著誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的延長(zhǎng)，腋芽分化數(shù)量隨之增加，而腋芽長(zhǎng)度卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。短時(shí)長(zhǎng)（8 d）誘導(dǎo)處理下，腋芽增殖系數(shù)僅為3.72，其腋芽長(zhǎng)度在1.43 cm 左右，均與中時(shí)長(zhǎng)（16 d）和長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)（32 d）存在顯著性差異（P＜0.05）。誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為16 d 和32 d時(shí)，其腋芽增殖系數(shù)均較高，分別為5.79 與6.11，此時(shí)腋芽長(zhǎng)度較短時(shí)長(zhǎng)處理下較矮，均在1.1 cm左右。從圖5可以看出，中時(shí)長(zhǎng)（16 d）和長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)（32 d）與較短時(shí)長(zhǎng)（8 d）相比，腋芽增殖數(shù)量明顯增加，差異顯著，且中、長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)（16、32 d）處理下的外植體均未出現(xiàn)愈傷化現(xiàn)象，芽體顏色翠綠，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，這說(shuō)明在該6-BA 濃度（11.1 μmol·L-1）處理下，延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)馬尾松莖段腋芽增殖具有顯著的正向促進(jìn)效應(yīng)。

圖5 6-BA 濃度一定時(shí)不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)馬尾松莖段腋芽增殖的影響Fig.5 Effect of different induction duration with a specific concentration of 6-BA on the axillary bud proliferation in masson pine tissue culture

表2 6-BA 一定濃度下不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)對(duì)馬尾松莖段腋芽增殖的影響Table 2 Effect of different induction durations with a specifci concentration of 6-BA on the proliferation of axillary bud in masson pine tissue culture.

2.5 馬尾松莖段腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)

2.5.1 銨硝比（NH4+/NO3-）對(duì)腋芽伸長(zhǎng)的影響

由表3可知，WPM 基本培養(yǎng)基中不同銨硝比（NH4+/NO3-）對(duì)腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)具有顯著性影響（P＜0.05）。培養(yǎng)30 d 時(shí)，各處理中腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的長(zhǎng)度由高到低的排序?yàn)閃PM52＞W(wǎng)PM53＞W(wǎng)PM51＞W(wǎng)PM54，且WPM52 和WPM53 均與WPM54 具有顯著性差異（P＜0.05），而與WPM51 差異不顯著（P＞0.05），WPM52 和WPM53 之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）；培養(yǎng)60 d 時(shí)，各處理苗高伸長(zhǎng)量由高到低依次為WPM53＞W(wǎng)PM52＞W(wǎng)PM51=WPM54，此 時(shí)WPM52 和WPM53 均 與WPM51 和WPM54 存 在顯著性差異（P＜0.05），而WPM52 與WPM53之間差異不顯著（P＞0.05）。綜合培養(yǎng) 30、60 d的伸長(zhǎng)培養(yǎng)處理的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，WPM 基本培養(yǎng)基中去NH4+處理和低銨硝比水平（NH4+/NO3-：0.2～0.4）處理對(duì)腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)具有更好地促進(jìn)作用，而中銨硝比水平（NH4+/NO3-：0.5）處理和高銨硝比水平（NH4+/NO3-：0.8～1.0）處理均對(duì)腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的效果低于低銨硝比水平，這說(shuō)明低NH4+水平有利于馬尾松腋芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。

表3 不同銨硝比（NH4+/NO3-）對(duì)馬尾松腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的影響Table 3 The effect of NH4+/NO3-ratio on the elongation of axillary bud of masson pine

2.5.2 IBA 與6-BA 處理對(duì)腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的影響

由表4可知，培養(yǎng)基中添加不同濃度的IBA與6-BA處理對(duì)腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)具有顯著性影響（P＜0.05），芽長(zhǎng)排序?yàn)锽3＞B5＞B4＞B2＞B1，較優(yōu)的兩個(gè)處理B3 與B5 之間差異不顯著（P＞0.05），B3 與其他處理B1、B2、B4 之間存在顯著性差異（P＜0.05）；培養(yǎng)60 d 時(shí)，各處理芽長(zhǎng)伸長(zhǎng)量由高到低依次為B3＞B5＞B2＞B4＞B1，B3 與B5 仍為較優(yōu)的兩個(gè)處理，且兩者之間差異不顯著（P＞0.05），與其他處理B1、B2、B4 之間存在顯著性差異（P＜0.05）。綜合培養(yǎng)30、60 d 的腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)腋芽伸長(zhǎng)趨勢(shì)隨IBA 濃度的升高而呈現(xiàn)先升高后下降的現(xiàn)象，這說(shuō)明適宜的IBA 濃度（0.98 μmol·L-1）對(duì)腋芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)生長(zhǎng)具有更好地促進(jìn)作用。

表4 IBA 與6-BA 濃度對(duì)馬尾松腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的影響Table 4 Effects of IBA and 6-BA concentration on the elongation of axillary bud of masson pine

2.6 馬尾松莖段芽生根誘導(dǎo)

把經(jīng)腋芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)獲得的長(zhǎng)度大于1.5 cm 的單芽接種在含IBA 不同濃度的1/2WPM 生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根誘導(dǎo)，約3 周后觀察到部分莖段芽基部開(kāi)始出現(xiàn)乳白色的不定根原基（圖6A）；4 周后不定根逐漸伸長(zhǎng)，長(zhǎng)度為1 cm 左右（圖6B）；5 周后不定根繼續(xù)增粗伸長(zhǎng)至2 cm 左右（圖6C）。生根誘導(dǎo)處理40 d 后，統(tǒng)計(jì)生根率、生根數(shù)、根長(zhǎng)等數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，不同濃度的IBA對(duì)莖段芽不定根誘導(dǎo)具有顯著性影響。生根處理40 d 后觀察，對(duì)照CK 無(wú)不定根發(fā)生（圖7A）；隨著IBA 濃度由低濃度（4.9 μmol·L-1）向高濃度（19.6 μmol·L-1）升高，生根的數(shù)量先增加后降低，不定根的生根狀態(tài)也有差別。具體表現(xiàn)為當(dāng)IBA 濃度為中濃度（9.8 μmol·L-1）時(shí)，單個(gè)莖段生根處理中無(wú)明顯主根，長(zhǎng)出數(shù)量較多的側(cè)根和須根，并出現(xiàn)根系的二級(jí)分支，生根效果較好，培養(yǎng)40 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)其生根率為45.83%，根長(zhǎng)為2 cm左右，且根系發(fā)達(dá)（圖7C）；隨著IBA 濃度的升高，與培養(yǎng)基接觸的莖段基部發(fā)生少量團(tuán)狀愈傷組織，此時(shí)生根率降低。IBA 低濃度（4.9 μmol·L-1）和高濃度（19.6 μmol·L-1）處理時(shí)，生根情況均較差，生根率分別為31.82%和40.91%，且低濃度處理時(shí)根系狀態(tài)較差，白色，細(xì)弱，少側(cè)根（圖7B）；而高濃度處理下，在莖段芽與培養(yǎng)基接觸的基部出現(xiàn)較多愈傷組織，而經(jīng)愈傷組織分化出的不定根其質(zhì)量較差，根數(shù)量少。因此，IBA 濃度為9.8 μmol·L-1時(shí)，有利于馬尾松莖段芽不定根的誘導(dǎo)（圖7D）。

圖6 馬尾松莖段芽生根誘導(dǎo)時(shí)IBA 處理下不定根隨時(shí)間變化的發(fā)生過(guò)程Fig.6 The process of rooting at different stages with the treatment of IBA on rooting induction in masson pine tissue culture.

表5 IBA 濃度對(duì)馬尾松莖段芽生根誘導(dǎo)的影響Table 5 Effect of IBA concentration on root induction in masson pine tissue culture

圖7 馬尾松莖段芽生根誘導(dǎo)不同濃度IBA 處理的生根狀況Fig.7 Rooting performance with different IBA concentrations on rooting induction in masson pine tissue culture

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié) 論

本研究針對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和處理時(shí)長(zhǎng)影響外植體芽分化數(shù)量及質(zhì)量這一問(wèn)題，從6-BA不同濃度及誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)兩方面開(kāi)展了馬尾松不定芽誘導(dǎo)植株再生的研究，主要結(jié)論是：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)之間對(duì)不定芽誘導(dǎo)存在顯著的交互作用，在組培不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，既要關(guān)注植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度效應(yīng)，同時(shí)也需要重點(diǎn)考慮不同誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)下不定芽誘導(dǎo)的時(shí)長(zhǎng)效應(yīng)，合適的濃度和時(shí)長(zhǎng)處理是提高不定芽誘導(dǎo)質(zhì)量的保障，而高質(zhì)量的不定芽誘導(dǎo)也是對(duì)有限的優(yōu)良抗性材料實(shí)現(xiàn)資源擴(kuò)繁以芽繁芽組培快繁體系建立的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究結(jié)果得出，馬尾松成熟胚適宜的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為6-BA 44.4 μmol·L-1+WPM培養(yǎng)基以及誘導(dǎo)處理時(shí)長(zhǎng)8 d 或16 d；不定芽繼代增殖的最適宜培養(yǎng)條件為6-BA 22.2 μmol·L-1+WPM，誘導(dǎo)處理時(shí)長(zhǎng)32 d；WPM 培養(yǎng)基中低銨硝比（0.2～0.4）對(duì)芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)的促進(jìn)效果最佳；生根誘導(dǎo)中，IBA 為9.8 μmol·L-1時(shí)，莖段芽誘導(dǎo)生根的質(zhì)量高，根系狀態(tài)良好。本研究建立了一套對(duì)有限馬尾松優(yōu)良家系種胚開(kāi)展成熟胚不定芽誘導(dǎo)、繼代增殖以芽繁芽的組培快繁體系，理想情況下，單顆成熟種胚的增殖擴(kuò)繁系數(shù)在一年半的時(shí)間內(nèi)可達(dá)到500～1 000 倍，且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，增殖倍數(shù)可呈幾何級(jí)擴(kuò)增。

3.2 討 論

已有研究表明，組培體系中6-BA 濃度水平與誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)的交互作用會(huì)導(dǎo)致外植體細(xì)胞內(nèi)激素環(huán)境發(fā)生變化，而內(nèi)源激素的平衡差異又會(huì)影響到細(xì)胞的分化方向[16]。組培不定芽的發(fā)生無(wú)論是直接器官發(fā)生還是間接器官發(fā)生，其實(shí)質(zhì)是在外源環(huán)境脅迫下細(xì)胞內(nèi)源基因差異表達(dá)重編程的結(jié)果[17]。本研究中發(fā)現(xiàn)，6-BA 低濃度、長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)或高濃度、短時(shí)長(zhǎng)處理下，馬尾松不定芽誘導(dǎo)發(fā)生方式主要是直接器官發(fā)生，而在6-BA 高濃度44.4 μmol·L-1、長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)32 d 誘導(dǎo)處理下，不定芽誘導(dǎo)發(fā)生方式主要轉(zhuǎn)變?yōu)殚g接器官發(fā)生，即先形成愈傷組織再分化出不定芽，可是其芽叢矮小。這說(shuō)明6-BA 高濃度（44.4 μmol·L-1）、長(zhǎng)時(shí)長(zhǎng)處理不利于高質(zhì)量芽的誘導(dǎo)，而高濃度6-BA、短時(shí)長(zhǎng)（4 d）的處理則對(duì)不定芽的誘導(dǎo)形成有利，且不定芽的誘導(dǎo)質(zhì)量較高。

Tereso 等[18]的研究表明，細(xì)胞分裂素類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度對(duì)海岸松Pinus pinasterAit.組培芽誘導(dǎo)與增殖有顯著影響，培養(yǎng)基中6-BA 水平差異會(huì)引起培養(yǎng)物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源激素平衡差異，對(duì)植物的生長(zhǎng)以及形態(tài)變化起到重要的調(diào)節(jié)作用[19]。6-BA 作為應(yīng)用得最為廣泛的外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，已成功地誘導(dǎo)出許多松屬樹(shù)種的不定芽及腋芽增殖[20-21]。松屬樹(shù)種不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)中的6-BA濃度范圍一般為1～50 μmol·L-1[20-22]，本試驗(yàn)中得到的最佳的不定芽初代誘導(dǎo)處理方式（WPM+6-BA 44.4 μmol·L-1，16 d）和不定芽繼代增殖處理方式（WPM+6-BA 22.2 μmol·L-1，32 d）均在此范圍內(nèi)。植物的內(nèi)源激素平衡也的確受到外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑調(diào)控，進(jìn)而影響細(xì)胞的分化方向及芽誘導(dǎo)器官發(fā)生的效應(yīng)[23]。本研究高濃度 6-BA 較低濃度6-BA 對(duì)不定芽誘導(dǎo)促生效果更顯著，馬尾松成熟合子胚在6-BA 44.4 μmol·L-1中培養(yǎng)4 d 與在6-BA 4.4 μmol·L-1中標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)32 d 相比，兩者之間對(duì)不定芽誘導(dǎo)效果無(wú)顯著差異，但可將誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)縮短4 周，這一結(jié)果與Moncaleán 等[14]的研究結(jié)果一致，原因可能是高濃度6-BA 誘導(dǎo)4 d 與低濃度6-BA 誘導(dǎo)32 d 的兩種處理下能使得所培養(yǎng)的外植體細(xì)胞內(nèi)獲得類(lèi)似的植物內(nèi)源激素平衡環(huán)境，而內(nèi)源激素水平可以決定離體組織的器官發(fā)生能力[24]。Nunes 等[10]在濕地松器官發(fā)生植株再生的研究中發(fā)現(xiàn)，在含有較高水平6-BA 的培養(yǎng)基上形成的不定芽具有較低的伸長(zhǎng)速率，而本研究中高濃度6-BA 誘導(dǎo)得到的不定芽也同樣發(fā)生矮小化或愈傷化現(xiàn)象。這表明高水平的6-BA 雖然可以促進(jìn)不定芽的誘導(dǎo)增殖，但可能會(huì)干擾芽的正常發(fā)育，影響芽的伸長(zhǎng)培養(yǎng)效果。

培養(yǎng)基中外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為環(huán)境脅迫因子對(duì)所培養(yǎng)的外植體細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生非生物脅迫效應(yīng)[19]，細(xì)胞分裂素類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作用的時(shí)長(zhǎng)會(huì)持續(xù)影響植物細(xì)胞受刺激的強(qiáng)度，迫使植物內(nèi)源激素動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生持續(xù)性改變。本研究發(fā)現(xiàn)，在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，外源激素誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)過(guò)短（2 d），不同6-BA 水平對(duì)不定芽誘導(dǎo)效果均較差，各處理間無(wú)顯著性差異。Cortizo 等[15]在意大利松不定芽誘導(dǎo)中發(fā)現(xiàn)，不定芽的誘導(dǎo)發(fā)生與合子胚外植體對(duì)6-BA 的吸收與代謝有關(guān)，誘導(dǎo)期較短時(shí)合子胚外植體對(duì)6-BA 吸收率及內(nèi)源代謝物含量均較低，這會(huì)導(dǎo)致較少的細(xì)胞分裂素受體與其結(jié)合，從而芽誘導(dǎo)信號(hào)的敏感性較低[25]。馬尾松合子胚外植體長(zhǎng)時(shí)間（32 d）放置在含高濃度6-BA 的培養(yǎng)基中易出現(xiàn)嚴(yán)重愈傷化現(xiàn)象，這種情況在álvarez 等[26]和Alonso 等[8]的研究中均有發(fā)生，這表明細(xì)胞持續(xù)受到外源和內(nèi)源激素信號(hào)作用會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分化加速向愈傷組織方向分化[27]。此外，Zhang等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松成熟合子胚在6-BA 濃度1.0 mg·L-1（4.4 μmol·L-1）及以上時(shí)，易形成較多玻璃化的不定芽，而本研究結(jié)果顯示6-BA 濃度達(dá) 到44.4 μmol·L-1且誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)為32 d 時(shí)，也 發(fā)生玻璃化現(xiàn)象，而當(dāng)6-BA 濃度為4.4 μmol·L-1和11.1 μmol·L-1時(shí)均未出現(xiàn)此現(xiàn)象。這可能是由于Zhang 等[29-30]研究不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)比本試驗(yàn)中的誘導(dǎo)處理時(shí)長(zhǎng)較長(zhǎng)的緣故，外源植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑長(zhǎng)時(shí)間地持續(xù)供給是外植體形成玻璃化苗的誘發(fā)因素之一，且溫度、光照和蔗糖濃度等其他因素也會(huì)影響玻璃化苗的發(fā)生。因此，在組培不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，不僅需考慮植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度水平，也需重點(diǎn)關(guān)注植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的誘導(dǎo)處理時(shí)長(zhǎng)對(duì)芽誘導(dǎo)數(shù)量和質(zhì)量的影響。

培養(yǎng)基中的銨硝比（NH4+/NO3-）對(duì)植物生長(zhǎng)形態(tài)發(fā)育具有很大的影響。本研究中，低水平的銨硝比（0.2～0.4）對(duì)馬尾松莖段腋芽伸長(zhǎng)促進(jìn)效果最好，同等時(shí)間下獲得最高伸長(zhǎng)量，而高水平的銨硝比（0.8～1.0）處理卻獲得了最低腋芽伸長(zhǎng)量。這可能是與培養(yǎng)基中的NH4+濃度有關(guān)，一般而言，NH4+濃度相對(duì)較高時(shí)，會(huì)對(duì)植物的發(fā)育產(chǎn)生毒害作用，抑制植物的分化及生長(zhǎng)。在野生薔薇Rosa canina的組織培養(yǎng)研究中，得出了較低NH4+濃度可以獲得更好的芽增殖與伸長(zhǎng)效果[31]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致；Heydari 等[32]在林蔭鼠尾草Salvia nemorosa細(xì)胞懸浮培養(yǎng)研究也得出了與此類(lèi)似的結(jié)果。培養(yǎng)基中適宜的銨硝比是植物在組織培養(yǎng)過(guò)程中獲得更好生長(zhǎng)發(fā)育的又一重要因素。馬尾松屬誘導(dǎo)生根困難型樹(shù)種，不定根形成困難[33]。本研究中對(duì)照CK 處理未形成不定根，這說(shuō)明添加一定的生長(zhǎng)素類(lèi)物質(zhì)處理是馬尾松誘導(dǎo)不定根形成的關(guān)鍵。在植物組織培養(yǎng)中，IBA 是生根誘導(dǎo)的常用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其適宜的誘導(dǎo)濃度因植物種類(lèi)不同而不同，杜梨Pyrus betulaefolia不定芽生根組織培養(yǎng)的研究結(jié)果得出，適宜的IBA 濃度為0.5 mg·L-1（2.5 μmol·L-1）[34]。在礬根Heucheraspp.不定芽誘導(dǎo)植株再生組織培養(yǎng)研究中，1.0 mg·L-1（4.9 μmol·L-1）的IBA 對(duì)其不定芽生根誘導(dǎo)效果最佳[35]。Zhang 等[28]和Zhu 等[2]在馬尾松組培生根誘導(dǎo)過(guò)程中，分別添加IBA 2.0 mg·L-1（9.8 μmol·L-1）時(shí)，獲得了較好的生根效果，本研究中馬尾松不定根誘導(dǎo)適宜的IBA 濃度也為9.8 μmol·L-1。本研究得到的最高生根率為45.83%，這可能與統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)時(shí)生根處理后觀察的時(shí)長(zhǎng)有關(guān)，繼續(xù)延后生根數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)時(shí)間，可能會(huì)得到更高的生根率。此外，植物在生根誘導(dǎo)過(guò)程中，除受外源激素種類(lèi)及濃度調(diào)控影響外，蔗糖含量、基本培養(yǎng)基和光照等因素也會(huì)對(duì)植物不定根發(fā)生產(chǎn)生影響[36-37]。

本研究通過(guò)調(diào)節(jié)外源激素濃度及誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)水平，有效地提高了馬尾松成熟合子胚不定芽芽誘導(dǎo)與腋芽增殖系數(shù)，縮短了不定芽誘導(dǎo)時(shí)長(zhǎng)，這一結(jié)果對(duì)建立高效、穩(wěn)定的馬尾松不定芽誘導(dǎo)與腋芽增殖體系十分重要。但本研究仍存在一定的局限性，在馬尾松莖段芽不定根誘導(dǎo)方面，獲得的生根誘導(dǎo)率還不算高，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)僅研究了生長(zhǎng)素類(lèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑IBA 濃度這一因素對(duì)其生根誘導(dǎo)的影響，而培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基成分以及激素組合均起著重要的作用，因而在后續(xù)的試驗(yàn)中應(yīng)從多種因素方面考慮生根誘導(dǎo)的影響因子，以提高馬尾松莖段芽的不定根誘導(dǎo)率，完善馬尾松不定芽誘導(dǎo)與增殖植株再生組織培養(yǎng)快繁體系。