會診組織在免疫組化檢測中的質(zhì)量分析

申敬偉，董芳莉，馬 卓，楊海軍

病理會診是病理科的常規(guī)工作之一，隨著我國各地區(qū)醫(yī)院醫(yī)療技術(shù)操作規(guī)范細則的實施，臨床病理工作中會診病理越來越多，主要包括疑難性病理會診、依懶性病理會診和確認性病理會診[1]。免疫組化技術(shù)是會診工作的重要手段，其有利于提高病理會診的質(zhì)量，減少病理會診帶來的醫(yī)療風(fēng)險。然而，送檢的會診蠟塊或切片常常組織處理欠佳，這給病理會診工作增加了一定難度，同時嚴重影響了免疫組化檢測結(jié)果的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。如何把控會診組織在免疫組化檢測中的染色質(zhì)量，本文結(jié)合我院會診組織免疫組化檢測情況進行分析，總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取2019年1月～2019年12月安陽市腫瘤醫(yī)院接收的行免疫組化檢測的會診組織706例。其中會診蠟塊601例，處理不佳的101例；會診白片105例，質(zhì)量不合格的10例。通過制定會診組織在免疫組化檢測中的規(guī)范化流程，對外院會診蠟塊、切片和白片進行改善。

1.2 儀器Roche Ventana XT全自動免疫組化儀和Leica Bond Max全自動免疫組化儀。

1.3 試劑ER、PR、HER-2和Ki-67為Roche即用型一抗，其余常規(guī)試劑均為邁新即用型一抗，二抗檢測系統(tǒng)為Roche和Leica兩家公司的配套封閉試劑。

1.4 方法不同抗體設(shè)立相應(yīng)的陽性對照組織，3 μm厚連續(xù)切片，65 ℃烤片1 h后進行分片，按Roche Ventana XT和Leica Bond Max免疫組化自動化染色平臺的SOP操作。

2 結(jié)果

按照本實驗室會診組織在免疫組化檢測中的規(guī)范化流程和操作方案，會診蠟塊切片完整，厚薄均勻；會診白片更換黏附載玻片，添加陽性對照。免疫組化染色定位準(zhǔn)確，背景干凈，核復(fù)染適度，陽性對照正確(圖1～3)，質(zhì)量控制分析4例染色合格，其余均為優(yōu)良，優(yōu)良率96.4%。

3 討論

免疫組化是用已知抗體與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，并通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記在與抗原結(jié)合后的特異性抗體上的顯色劑顯色，以確定組織細胞內(nèi)抗原的存在，對其進行定位、定性及半定量分析。免疫組化是一個多步驟、多條件的復(fù)雜過程，其規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化涉及整個免疫組化檢測的全流程，包括組織前處理、檢測步驟、結(jié)果判讀、質(zhì)量控制等各個環(huán)節(jié)。隨著病理會診免疫組化檢測數(shù)量的增多，本實驗室制定了一套會診組織從蠟塊或白片質(zhì)量評估開始，切片、烤片、抗原修復(fù)、抗體濃度、檢測系統(tǒng)、陽性對照等全方面的規(guī)范化操作方案，推進免疫組化技術(shù)在會診組織中的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化檢測，提高檢測的準(zhǔn)確性，具體實施措施如下。

3.1 評估會診蠟塊會診蠟塊多來自基層單位，組織處理欠佳的情況較為普遍。通常表現(xiàn)為組織內(nèi)陷、硬脆、韌等。組織內(nèi)陷主要是組織固定不佳，導(dǎo)致脫水劑難以進入組織，大量水分殘留在組織內(nèi)。對于這些會診蠟塊本科室采用黏片法[2]，即把載玻片盒子里的隔離紙撕成和蠟塊一樣的大小，沾冰水貼在已修好片的蠟塊上再切，切片就黏在紙片上，直接拿出紙片反向放入漂片機內(nèi)，同時嚴格控制水溫不宜太高。在病理會診工作中，蠟塊硬，跳刀，顫痕嚴重，蠟塊易崩裂；蠟塊脆，組織易破碎，出現(xiàn)粉末狀等，這些情況常是由于固定不足和脫水不良引起，對于這類會診蠟塊在切片時將厚度調(diào)薄一點，蠟塊不可太冰，可以在冰水里浸泡1～2 min，或者邊切邊用嘴向蠟片吹氣，使蠟塊切面保持濕潤，利于制片。越來越多的研究表明，不標(biāo)準(zhǔn)的組織固定是導(dǎo)致免疫組化結(jié)果不準(zhǔn)確的主要因素，常導(dǎo)致不同的染色結(jié)果[3]。固定的意義是保存組織或細胞的抗原性，防止抗原丟失或彌散，因此標(biāo)本應(yīng)盡可能保持新鮮并及時進行固定。常用的固定液為10%中性福爾馬林緩沖液(pH 7.2～7.4)，組織離體后盡可能在30～60 min內(nèi)固定。延遲固定可引起蛋白質(zhì)降解，導(dǎo)致背景非特異性著色增加，減弱免疫組化的染色強度。固定時間6～48 h[4]，對于活檢小組織固定時間亦不應(yīng)少于6 h。標(biāo)準(zhǔn)化的組織脫水、透明、浸蠟流程及試劑更換程序是獲得優(yōu)質(zhì)免疫組化制片的前提，脫水、透明等過程應(yīng)在室溫下進行，盡量減少組織抗原的損失。組織塊大小控制在2 cm×1.5 cm×0.3 cm為宜。浸蠟或包埋的石蠟應(yīng)控制在65 ℃或65 ℃以下。組織處理的任何過程中，標(biāo)本干涸組織形態(tài)和抗原都會受到損害，組織處理應(yīng)嚴格按照科室相關(guān)SOP文件的要求進行。

3.2 評估會診白片外院會診白片部分存在玻片黏附質(zhì)量差或非黏附性玻片，組織固定處理不佳，切面有氣泡、皺褶等質(zhì)量問題，易出現(xiàn)脫片和非特異性染色。如果是非黏附性玻片，直接退回玻片，換用黏附性玻片或重新調(diào)取蠟塊重新制片。目前本實驗室有Roche Ventana XT和Leica Bond Max兩種免疫組化自動化染色平臺，Roche Ventana XT采用噴射式清洗技術(shù)均勻而徹底地清洗，降低背景染色，同時也是造成染色會診白片脫片率偏高的主要原因；Leica Bond Max最大特點是試劑側(cè)面滴加，最大限度減少對組織的傷害，脫片率低[5]。因此，為減少脫片率，本實驗室偏向應(yīng)用會診組織在Leica Bond Max上檢測。會診白片多為非親水性，質(zhì)量參差不一，本實驗室ER和HER-2試劑采用Roche即用型，Roche Ventana XT需要玻片為親水性，因此會診白片在檢測前需在脫脂牛奶中浸泡30 min，以改善切片的親水性，保證試劑均一地分布，避免假陰性的產(chǎn)生和“階梯效應(yīng)”。同時，免疫組化檢測應(yīng)盡量使用新鮮切片(1周以內(nèi)的切片視為新鮮切片)，切片長久放置后免疫穩(wěn)定性的丟失會導(dǎo)致染色強度降低、陽性細胞數(shù)量減少。切片厚度為3～5 μm，推薦烤片溫度為63～65 ℃，1～2 h，忌高溫長時間烤片。

3.3 建立陽性對照體系設(shè)置陽性對照體系是免疫組化染色質(zhì)量控制的重要措施之一[6]。陽性對照應(yīng)按照國內(nèi)檢測指南/專家共識設(shè)置，對于與腫瘤靶向藥物治療相關(guān)的檢測項目必須設(shè)置陽性對照。陽性對照是驗證操作步驟是否正確及染色結(jié)果是否準(zhǔn)確的關(guān)鍵，根據(jù)對照染色結(jié)果可以判斷操作的準(zhǔn)確性和試劑的有效性，本實驗室使用已被證明含有靶抗原成分的組織作為外部陽性對照，如ER、PR陽性對照選用ER、PR陽性的乳腺癌、子宮頸癌或子宮內(nèi)膜癌標(biāo)本，HER-2陽性對照選用HER-2 2+及3+的乳腺癌標(biāo)本，同時外部陽性對照組織選擇低表達的檢測組織，低表達的外部陽性對照可以明確由于檢測體系的微弱變化而導(dǎo)致的免疫組化染色不穩(wěn)定，強陽性對照可能導(dǎo)致弱陽性組織出現(xiàn)假陰性結(jié)果。因此，對于外院會診蠟塊組織，在切片的同時加上陽性對照；對于外院會診白片，在黏附載玻片的空白區(qū)再加上陽性對照組織。為確?？乖钚?，陽性對照片現(xiàn)用現(xiàn)切，且不可長時間保存。本實驗室一般備1周陽性對照的切片量，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 儀器設(shè)備的質(zhì)控嚴格遵照全自動免疫組化染色機的操作流程，制定每種儀器的保養(yǎng)計劃，包括日保養(yǎng)、周保養(yǎng)和月保養(yǎng)；記錄每種試劑的克隆號、批號、有效期；更換抗體后，用陽性和陰性組織進行有效性驗證。建立每種抗體的SOP文件嚴格執(zhí)行，并及時更新。最少的背景以及標(biāo)記目標(biāo)抗體的強表達是理想的結(jié)合[7]。

3.5 參加室間質(zhì)控積極參與國際及國內(nèi)免疫組化染色質(zhì)量評估，動態(tài)評價本實驗室免疫組化染色質(zhì)量，不斷改正不足。本科室2014年參加國家衛(wèi)建委病理質(zhì)控中心(PQCC)的免疫組化室間質(zhì)控，2013年開始每年參加河南省病理質(zhì)控中心組織的免疫組化室間質(zhì)評，均順利通過。

總之，病理會診已成為病理科的日常工作，免疫組化技術(shù)已成為病理會診中重要的檢測手段，因此需要建立病理會診在免疫組化檢測中的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化流程，以確保病理會診工作高效優(yōu)質(zhì)完成。