裸花紫珠治療慢性盆腔炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

王紫璇，薛曉鷗，孫 璐

北京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100010

慢性盆腔炎（Chronic pelvic inflammatory disease，CPID）是由女性內(nèi)生殖器及周圍結(jié)締組織、盆腔腹膜發(fā)生慢性炎性病變所引起的癥狀，是目前育齡婦女最常見疾病之一，病情纏綿，易于復(fù)發(fā)。主要表現(xiàn)為慢性盆腔痛（常在勞累、性交后及月經(jīng)前后加?。?、陰道分泌物增多［1］、不孕、異位妊娠［2］，以及月經(jīng)量多、經(jīng)期延長(zhǎng)。近年來，其發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響婦女的身心健康和正常生活。臨床上西醫(yī)使用單一抗生素治療CPID取得的療效一般，且易產(chǎn)生耐藥，副作用大，而采用中醫(yī)中藥治療CPID，可有效地提高治愈率，不良反應(yīng)少［3-4］。裸花紫珠（Callicarpa nudiflora Hook.et Arn.）是海南的地道藥材，為馬鞭草科紫珠屬植物的干燥葉，又名節(jié)節(jié)紅、趕風(fēng)柴、大斑鳩米、賊子葉等，性味苦、微辛、平；歸脾、胃、肝經(jīng)［5］。據(jù)《本草拾遺》記載，裸花紫珠有解諸毒的功效，有研究表明裸花紫珠提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛、止血、抗菌、散瘀消腫、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用［6-7］。臨床上裸花紫珠可用于各種炎癥疾病的治療，尤其廣泛應(yīng)用于婦科炎癥，還可治療各類出血、跌打瘀腫、瘡毒潰爛等［8］。目前關(guān)于裸花紫珠作用機(jī)制的相關(guān)研究較少，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步闡釋裸花紫珠治療CPID的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 裸花紫珠主要活性成分的收集與篩選

基于文獻(xiàn)檢索［9-11］，在中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）、萬方數(shù)據(jù)庫(kù)中以“裸花紫珠”以及“化學(xué)成分”為主題，收集裸花紫珠的化學(xué)成分。通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索其化學(xué)成分的2D分子結(jié)構(gòu)，以SDF格式保存，構(gòu)建裸花紫珠化合物數(shù)據(jù)庫(kù)。將分子結(jié)構(gòu)的SDF文件導(dǎo)入SwissADME平臺(tái)（http：//www.swissadme.ch/）進(jìn)行胃腸道吸收（GIabsorption）、類藥性（Druglikeness）分析。同時(shí)，查閱相關(guān)資料收集經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)成分［11］，經(jīng)分析后納入主要活性成分。

1.2 活性成分靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)和篩選

根據(jù)1.1項(xiàng)篩選的主要活性成分，利用Swiss Target-Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)，將成分的分子結(jié)構(gòu)SDF文件導(dǎo)入Swiss TargetPrediction，設(shè)置屬性為homo sapiens，篩選其中possibility＞0.25的活性成分的靶基因進(jìn)行收集。運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.org/）規(guī)范靶基因名稱。

1.3 CPID靶基因的獲取

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/），以“chronic pelvic inflammatory disease”為關(guān)鍵詞檢索與CPID相關(guān)的基因靶點(diǎn)，篩選Relevence Score＞10的靶點(diǎn)進(jìn)行收集，刪除重復(fù)的靶點(diǎn)。將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得裸花紫珠活性成分治療慢性盆腔炎的共同靶點(diǎn)，利用微生信（http://www.bioinformatics.com.cn/）繪制韋恩圖。

1.4 構(gòu)建藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2 軟件，節(jié)點(diǎn)表示中藥、成分、共同靶點(diǎn)，邊表示活性成分與作用靶點(diǎn)之間的關(guān)系，構(gòu)建藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，更好地闡釋裸花紫珠活性成分與慢性盆腔炎相關(guān)靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

1.5 繪制PPI網(wǎng)絡(luò)

將1.3項(xiàng)下得到的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入String11.0數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//stringdb.org/），選擇物種為“Homo sapiens”，繪制靶標(biāo)蛋白質(zhì)互相作用網(wǎng)絡(luò)（PPI），下載TSV格式，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行可視化。

1.6 GO富集分析及KEGG通路分析

將裸花紫珠治療CPID的關(guān)鍵靶基因?qū)隡etascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http://metascape.org）進(jìn)行基因富集分析。Metascape整合了GO、KEGG、UniProt和DrugBank等多個(gè)權(quán)威的數(shù)據(jù)資源，覆蓋面較為廣泛，且能很大程度地保證檢索數(shù)據(jù)結(jié)果的時(shí)效性［12］。以P＜0.01作為具有統(tǒng)計(jì)差異的篩選條件，設(shè)置min overlap=3，Min Enrichment=1.5，對(duì)獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）富集分析和KEGG（KEGG pathway analysis）代謝通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1 裸花紫珠活性成分的收集及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

基于文獻(xiàn)檢索，共收集144個(gè)化合物成分，經(jīng)SwissADME平臺(tái)篩選，將候選成分的2D分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入SwissTargetPrediction平臺(tái)進(jìn)行靶蛋白預(yù)測(cè)，篩選其中possibility＞0.25的活性成分的靶蛋白，并去除數(shù)據(jù)庫(kù)中沒有預(yù)測(cè)靶點(diǎn)的活性成分，共獲得裸花紫珠的主要活性成分20個(gè)，其中連翹酯苷B、毛蕊花糖苷、木犀草苷雖口服利用度較低，但仍以主要化合物而得以保留（表1），刪除重復(fù)值后共獲得相關(guān)靶標(biāo)蛋白116個(gè)。

表1 裸花紫珠的主要活性成分

2.2 CPID疾病靶點(diǎn)篩選結(jié)果

通過關(guān)鍵詞檢索GeneCards，篩選Relevance Score＞10的CPID相關(guān)靶點(diǎn)，OMIM檢出534個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，經(jīng)整合去重后，共納入2 188個(gè)CPID相關(guān)靶點(diǎn)。利用venny2.1，將CPID相關(guān)靶點(diǎn)2 188個(gè)與所得的裸花紫珠預(yù)測(cè)靶點(diǎn)116個(gè)相映射，繪制韋恩圖，得出裸花紫珠可能與CPID相關(guān)的靶點(diǎn)56個(gè)（圖1）。在2.1項(xiàng)下，成分編號(hào)為zz20的香草醛（vanillin）對(duì)應(yīng)的possibility＞0.25的靶點(diǎn)與疾病無交集，予以剔除，所以共納入裸花紫珠治療CPID的活性成分19個(gè)。

圖1 裸花紫珠活性成分-CPID靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.3 繪制藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2），其中綠色LHZZ代表裸花紫珠，紅色zz1～zz19代表活性成分，黃色代表靶蛋白。經(jīng)統(tǒng)計(jì)degree值較高的有效成分為槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、芹菜素（apigenin），degree值分別為46、44、28。

圖2 裸花紫珠治療CPID的藥物-活性成分-共同靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 繪制PPI圖

將篩選得到的的56個(gè)共同靶點(diǎn)上傳到String數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行蛋白與蛋白的相互作用分析，下載TSV格式，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2 軟件進(jìn)行可視化，得到PPI圖（圖3）。在PPI網(wǎng)絡(luò)圖中，共有56個(gè)節(jié)點(diǎn)，395條邊，網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)蛋白，線條代表靶點(diǎn)蛋白之間的聯(lián)系，節(jié)點(diǎn)越大、顏色越亮表示degree值越大，線條越粗表示關(guān)聯(lián)程度越大。平均節(jié)點(diǎn)degree值為11.5，超過平均度值的靶蛋白有28個(gè)，說明這28個(gè)靶蛋白是PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)，裸花紫珠的藥理作用很可能是通過作用于這些靶點(diǎn)得以發(fā)揮（表2）。

表2 PPI關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白

圖3 裸花紫珠治療CPID的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO功能富集分析

為了進(jìn)一步了解裸花紫珠治療慢性盆腔炎的靶點(diǎn)在生物體中發(fā)揮的作用，利用Matescape對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行BP，MF和CC分析。GO富集分析結(jié)果顯示，裸花紫珠治療CPID的生物學(xué)過程主要包括對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)活性氧物種的細(xì)胞反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)等;分子功能主要包括蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、激酶結(jié)合等；細(xì)胞組成主要包括膜筏、膜微域、蛋白質(zhì)磷酸酶結(jié)合等。

2.6 KEGG信號(hào)通路富集分析

依據(jù)Pvalue以及Count進(jìn)行排序，選擇前10個(gè)具有代表性的通路作為重要通路并進(jìn)行可視化分析（圖4）。裸花紫珠治療CPID的信號(hào)通路涉及癌癥通路、炎癥反應(yīng)、止血、免疫等與CPID密切相關(guān)的病理生理學(xué)過程。

圖4 裸花紫珠治療CPID的KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

慢性盆腔炎的西醫(yī)發(fā)病機(jī)理是病原體感染引起炎癥反應(yīng)，炎性浸潤(rùn)至盆腔器官，致組織充血、廣泛粘連、瘢痕形成，局部血液循環(huán)受阻，機(jī)體組織抗氧化能力與代謝下降，因此西醫(yī)治療主要以抗生素消炎為主，療效欠佳［13］。中醫(yī)古籍中并無“慢性盆腔炎”之名，根據(jù)其臨床特點(diǎn)，可歸于“婦人腹痛”、“帶下病”、“痛經(jīng)”、“癓瘕”、“月經(jīng)失調(diào)”、“不孕”等范疇［14］，發(fā)病部位在胞宮與沖任，但與肝、脾、腎等臟腑密不可分。其病因病機(jī)與腎氣虧虛、正虛邪戀，沖任不調(diào)、氣血失和，情志不暢、臟腑失調(diào)等密切相關(guān)［15］。治療以清熱祛濕、理氣活血為主，扶正祛邪，標(biāo)本同治，臨床療效好、副作用少。

本研究得出裸花紫珠的主要活性成分有槲皮素、木犀草素、芹菜素、5-羥基-3，7，3'，4'-四甲氧基黃酮等，多屬于苯丙素類、黃酮類，相關(guān)研究證明槲皮素、芹菜素能夠抑制巨噬細(xì)胞COX-2的表達(dá)，減少PG的生成，達(dá)到緩解CPID疼痛、減輕炎癥的作用；炎癥的發(fā)生亦與NO炎癥因子有關(guān)，NO能加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)，芹菜素、槲皮素、木犀草素能顯著抑制脂多糖（LPS）引起的巨噬細(xì)胞iNOS的過度表達(dá)，從而降低細(xì)胞內(nèi)NO含量，在治療CPID時(shí)發(fā)揮抗炎作用［16-18］。此外，芹菜素能顯著增強(qiáng)體液免疫應(yīng)答，并顯著提高自然殺傷（nature killer，NK）細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞活性，從而提高機(jī)體免疫力［19］；毛蕊花糖苷等苯丙素苷類成分可能是裸花紫珠止血作用的主要活性成分，在治療CPID中起到止血的功效［10］。

PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示AKT1、TNF、ESR1、PTGS2、MMP2、PIK3R1等靶點(diǎn)的度值排名較前，在治療CPID中起著重要作用，其中AKT1、TNF、PTGS2均參與免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，且互相協(xié)調(diào)。TNF是CPID炎癥反應(yīng)中的重要影響因子，細(xì)菌感染后TNF迅速升高，促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移，激活或擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，引起盆腔周圍結(jié)締組織發(fā)生充血、水腫，逐漸演變成慢性盆腔炎［20-21］；PTGS2又稱環(huán)氧化酶-2（COX-2），在炎癥因子PG的合成途徑中起特殊作用，與CPID炎癥反應(yīng)如充血、水腫、疼痛等顯著相關(guān)［22］；靶點(diǎn)蛋白ESR1編碼一種雌激素受體，該雌激素受體與雌激素結(jié)合，釋放致痛物質(zhì)，導(dǎo)致慢性盆腔痛的發(fā)生［22］。裸花紫珠的活性成分作用于AKT1、TNF、PTGS2、ESR1等

靶點(diǎn)，可逆轉(zhuǎn)異常表達(dá)，抑制炎癥因子、致痛物質(zhì)的產(chǎn)生，從而減輕CPID的炎癥反應(yīng)及疼痛。

KEGG富集分析表明裸花紫珠治療CPID的靶點(diǎn)主要參與PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）、IL-17信號(hào)通路（IL-17 signaling pathway）、NF-κB信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）等。PI3K-Akt信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)最重要的生存信號(hào)之一，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。王杰等實(shí)驗(yàn)證明裸花紫珠提取物可縮短小鼠的出血時(shí)間和凝血時(shí)間，其止血機(jī)制之一可能是促進(jìn)血小板PI3K-Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、刺激血小板的活化［23-24］。IL-17信號(hào)通路與炎癥反應(yīng)相關(guān)，該通路上的IL-17與靶細(xì)胞膜特異性受體IL17RA和IL17RC結(jié)合，通過胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子ACT1和TRAF6，最終激活NF-кB，啟動(dòng)下游炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子（如TNF-α等）、趨 化 因 子和基質(zhì)金屬蛋白酶（如MMP2、MMP9等）的表達(dá)，從而加重CPID炎癥反應(yīng)［25］。NF-κB是調(diào)節(jié)控制細(xì)胞凋亡、增殖、細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)、免疫和炎癥反應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄，相關(guān)文獻(xiàn)表明裸花紫珠中的木犀草素等黃酮類化合物對(duì)巨噬細(xì)胞炎性反應(yīng)的抑制活性可通過抑制NF-κB信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)，可在不同水平抑制NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生［18］，降低炎癥遞質(zhì)的級(jí)聯(lián)爆發(fā)，減輕炎癥病理?yè)p害，松解粘連，從而發(fā)揮裸花紫珠的抗炎與免疫作用，治療慢性盆腔炎。

4 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討裸花紫珠治療慢性盆腔炎的作用機(jī)制，結(jié)果表明，裸花紫珠治療CPID具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，可能通過苯丙素類、黃酮類等活性成分作用于AKT1、TNF、PTGS2、ESR1等關(guān)鍵靶點(diǎn)，激活PI3K-Akt信號(hào)通路或抑制IL-17、NF-κB等相關(guān)通路，產(chǎn)生止血、抑制炎癥、緩解疼痛、調(diào)節(jié)免疫等作用，從而達(dá)到治療CPID的目的。但由于篩選條件限制只能分析得到裸花紫珠治療CPID的主要有效成分，使得研究結(jié)果較為局限，后續(xù)需進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證裸花紫珠治療CPID的潛在藥理作用機(jī)制。