芳香新塔花對動脈粥樣硬化模型小鼠Toll 樣受體-4/核因子-κB 信號通路的影響

張華，馬學(xué)寬，王思靜，張選明，倪昀，王麗，安冬青

芳香新塔花（新塔花）為唇形科半灌木狀植物新塔花的地上部分，又名唇香草，在我國主要分布在新疆、內(nèi)蒙古等地區(qū)。新塔花全草中的化學(xué)成分主要為揮發(fā)油、非揮發(fā)油兩部分，新塔花揮發(fā)油為透明淡黃色油狀液體，約占全草的2%，國外有學(xué)者采用氣質(zhì)聯(lián)用法和氣相色譜法進行化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了其中27 種成分，主要包括胡薄荷酮（44.5%）、萜品醇（14.5%）等，非揮發(fā)油主要以總黃酮類為主[1-2]。近些年，新塔花在國內(nèi)外受到廣泛關(guān)注，大量研究表明，新塔花成分具有抗炎止痛、舒張血管、降血壓、抗氧化、改善心肌缺血等作用[3-9]，主要用于治療失眠、高血壓、冠心病等疾病，但其作用機制尚不明確[5,10]。目前關(guān)于新塔花抗動脈粥樣硬化（AS）的研究國內(nèi)外文獻報道較少，本研究運用蘇木精-伊紅（HE）染色法、實時熒光定量PCR、蛋白免疫印跡法（Western Blot）探討了新塔花防治AS 的炎癥機制。

1 材料與方法

實驗動物：選取40 只8 周齡雄性載脂蛋白E 基因敲除（ApoE-/-）小鼠，10 只同品系C57 普通小鼠，平均體重（18.0±2.0）g，均購于北京維通利華公司；飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)動物中心。

試藥與儀器：新塔花全草購自亳州市中正中藥材飲片有限公司，并由專人鑒定；HE 染色試劑盒、阿托伐他汀購自北京Solarbio 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、蛋白Marker 購自美國Thermo 公司；Trizol 試劑購自美國Invitrogen 公司；熒光定量PCR 試劑盒購自德國Qingen 公司。

新塔花水提物的制備：取干燥新塔花24.0 g，粉碎后置于圓底燒瓶中，加入200 ml 蒸餾水，加熱回流2 h，水提率為75%。洗滌濾渣，將所得有效水提物繼續(xù)真空懸蒸加熱1 h，得新塔花水提物80 ml，定容至100 ml 即為所需新塔花高劑量（含生藥0.18 g/ml），稀釋1 倍為低劑量（含生藥0.09 g/ml）。

模型的建立[11]：所有小鼠SPF 級環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，高脂飼料繼續(xù)喂養(yǎng)12 周用于建立動脈粥樣硬化模型。高脂飼料配方：基礎(chǔ)飼料82.68%，豬油10%，豬膽鹽0.2%，膽固醇2%，蔗糖5%，丙硫氧基嘧啶0.12%。

分組及給藥：適應(yīng)性喂養(yǎng)結(jié)束后，將C57 小鼠設(shè)為空白對照組；ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、他汀組、新塔花高劑量組和新塔花低劑量組，每組10只。同時給予5 組小鼠每天灌胃1 次，持續(xù)12 周：空白對照組和模型組均給予蒸餾水（0.4 ml/10 g），他汀組給予阿托伐他汀[3.0 mg/（kg·d）]，新塔花高劑量組給予新塔花水提物[1.8 g/（kg·d）]，新塔花低劑量組給予新塔花水提物[0.9 g/（kg·d）]。小鼠給藥量根據(jù)公式g/（kg·d）=9.1×成人臨床藥量[g/（kg·d）]換算；每周根據(jù)小鼠體質(zhì)量變化調(diào)整劑量。

體質(zhì)量變化觀察：在小鼠灌胃前及灌胃第2 周、6 周、12 周稱取體質(zhì)量并記錄，后期分析各組小鼠體質(zhì)量變化情況。

標(biāo)本采集：小鼠灌胃第12 周末，禁食不禁水12 h，麻醉后無菌條件取胸主動脈置于4%多聚甲醛固定，之后HE 染色，用于病理切片實驗觀察小鼠主動脈病理變化；腹主動脈置于凍存管中迅速投入液氮，轉(zhuǎn)至-80 ℃冰箱，用于檢測Toll 樣受體-4（TLR4）、核因子-κB（NF-κB）的信使RNA（mRNA）相對表達水平和TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白表達水平。

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）：取凍存管內(nèi)小鼠主動脈組織，依次經(jīng)過Trizol 法提取RNA、濃度測定、逆轉(zhuǎn)錄、qRT-PCR 等步驟。由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計β-肌動蛋白（β-actin）、TLR4、NF-κB 引物序列：β-actin上 游5'-TGGCACCCAGCACAATGA A-3'，下 游5'-CTA AGTCATAGTCCGCCT AGAAGCA-3'；TLR4 上游5' -GTT CTT CTC CTG CCT GAC-3'，下游 5'-TGC TGA GTT TCT GAT CCA T-3'；NF-κB上 游5'-CCCAGGGTATGGCTACTC-3'，下 游5'-CATCACTCTTGGCACAATCT-3'。以 β-actin作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法比較各組小鼠腹主動脈組織中TLR4、NF-κB 的mRNA 相對含量。

Western Blot 法：取凍存管內(nèi)主動脈組織，經(jīng)過提取蛋白、濃度測定、蛋白定量、凝膠電泳制備、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、免疫反應(yīng)、顯色、終止、拍照等實驗步驟。后期運用Image J 處理軟件分析目的條帶的灰度值，計算TLR4、磷酸化NF-κB p65 與內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）的相對表達量。

統(tǒng)計學(xué)方法：數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 和GraphPad Prism 6 軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組比較用單因素方差分析，方差齊兩兩比較LSD 檢驗；方差不齊采用非參數(shù)檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體質(zhì)量變化（表1）

灌胃第2、6、12 周末，空白對照組小鼠飲食、飲水及二便正常，體質(zhì)量增加不顯著；與空白對照組比較，模型組小鼠對外界刺激反應(yīng)遲鈍，飲食、飲水降低明顯，體質(zhì)量增加明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，他汀組、新塔花高劑量組小鼠對外界刺激反應(yīng)有所緩解，飲食、飲水減少，平均體質(zhì)量減少，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.01）；新塔花低劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組減少，但較他汀組增加（P均＜0.05）。

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化（g,±s）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化（g,±s）

注：與空白對照組比**P＜0.01；與模型組比△P＜0.05，△△P＜0.01；與他汀組比▲P＜0.05

2.2 各組小鼠胸主動脈病理形態(tài)結(jié)構(gòu)（圖1）

HE 染色結(jié)果可見，空白對照組小鼠胸主動脈壁未見明顯平滑肌細胞增生，腔內(nèi)未見膽固醇結(jié)晶形成或明顯狹窄（圖1A）；模型組小鼠胸主動脈內(nèi)斑塊增多，動脈壁厚度明顯不均勻，局部發(fā)生鈣化，外膜可見大量炎性細胞浸潤及斑塊形成（圖1B）；他汀組小鼠胸主動脈壁厚度不均，內(nèi)膜增厚較模型組輕，且有少量斑塊形成且穩(wěn)定（圖1C）；新塔花高劑量組小鼠主動脈管壁厚度不均勻，內(nèi)膜增厚較模型組輕，外膜內(nèi)可見少量炎性細胞浸潤及斑塊形成（圖1D）；低劑量組管腔壁厚度不均，內(nèi)膜增厚明顯，可見斑塊形成，病理改變較模型組未見明顯改變（圖1E）。

2.3 各組小鼠腹主動脈TLR4、NF-κB 的mRNA 的相對表達水平情況（圖2）

qRT-PCR 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠主動脈TLR4 mRNA[（1.04±0.38）vs（7.54±1.76），P＜0.01]、NF-κB mRNA[（1.07±0.16）vs（5.93±1.70），P＜0.01]相對表達水平升高；與模型組比較，他汀組、新塔花高劑量 組TLR4 mRNA[（7.54±1.76）vs（2.05±0.57），P＜0.01；（7.54±1.76）vs（3.84±1.06），P＜0.05]、NFκB mRNA[（5.93±1.70）vs（1.79±0.63），P＜0.01；（5.93±1.70）vs（2.04±0.94），P＜0.01]相對表達水平降低，新塔花低劑量組NF-κB mRNA[（5.93±1.70）vs（4.35±1.41），P＜0.01]相對表達水平下調(diào)；與他汀組比較，新塔花高劑量、低劑量組TLR4 mRNA[（2.05±0.57）vs（3.84±1.06）；（2.05±0.57）vs（5.94±2.04）]、NF-κB mRNA[（1.79±0.63）vs（2.04±0.94）；（1.79±0.63）vs（4.35±1.41）]相對表達水平較高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖1 各組小鼠胸主動脈蘇木精-伊紅染色結(jié)果（×200，n=10）

圖2 各組小鼠腹主動脈TLR4、NF-κB 的mRNA 相對表達水平情況（±s,n=6）

2.4 各組小鼠腹主動脈中TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白相對表達水平比較（圖3）

Western Blot 結(jié)果顯示，與空白對照組比較，模型組小鼠腹主動脈TLR4 [（0.68±0.16）vs（1.35±0.11），P＜0.01]、磷酸化NF-κB p65[（0.61±0.08）vs（1.42±0.14），P＜0.01]蛋 白相對表達水平上調(diào)；與模型組比較，他汀組、新塔花高劑量和低劑量組TLR4 [（1.35±0.11）vs（0.90±0.10）；（1.35±0.11）vs（0.81±0.10）；（1.35±0.11）vs（0.84±0.12）]、磷 酸 化NF-κB p65 [（1.42±0.14）vs（0.88±0.08）；（1.42±0.14）vs（0.92±0.14）；（1.42±0.14）vs（1.21±0.13）]蛋白相對表達水平下調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.05）。

圖3 各組小鼠主動脈TLR4、P-p65 蛋白相對表達水平的比較（±s,n=5）

3 討論

近些年，心血管疾病已成為全球人口死亡的首要原因，其發(fā)病率呈升高趨勢，目前我國心血管病現(xiàn)患人數(shù) 2.9 億，而動脈粥樣硬化是缺血性心血管疾病的主要病理因素[12-13]。研究表明，動脈粥樣硬化在不同的病理生理過程始終伴隨炎癥反應(yīng)。當(dāng)組織受損時，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)從而激活TLR4，介導(dǎo)下游因子，激活NF-κB 磷酸化，誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列炎性因子，從而發(fā)生炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，促使動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[14-17]。

眾所周知，他汀類藥物具有調(diào)脂、抗炎等效果，能有效抗動脈粥樣硬化，降低心血管疾病患者心血管事件的發(fā)生風(fēng)險。本研究結(jié)果顯示，高脂飼料喂養(yǎng)可成功建立動脈粥樣硬化小鼠模型，而新塔花高劑量組小鼠體質(zhì)量較模型組降低，主動脈炎性浸潤及脂質(zhì)沉淀減少，未見明顯斑塊，血管內(nèi)皮病理情況緩解，提示新塔花能夠降低動脈粥樣硬化小鼠體質(zhì)量，改善內(nèi)皮功能，減輕炎癥反應(yīng)。本研究還發(fā)現(xiàn)，新塔花高劑量組小鼠腹主動脈TLR4、NFκB mRNA 相對表達水平較模型組降低；TLR4、磷酸化NF-κB p65 蛋白相對表達水平較模型組下調(diào)，與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這提示新塔花可能是通過降低TLR4/NF-κB 信號通路內(nèi)蛋白水平，最終達到抑制炎癥反應(yīng)，防治動脈粥樣硬化的效果。本研究結(jié)果還表明，新塔花作用程度雖然未達到他汀類藥物的效果，但同樣具有抑制炎癥、改善內(nèi)皮作用，且新塔花高劑量組比低劑量組效果更加明顯，提示新塔花作用于小鼠主動脈TLR4/NF-κB 通路時，具有一定的藥物劑量依賴性。

總之，該實驗對新塔花應(yīng)用于防治動脈粥樣硬化性心血管疾病進行了探索和支持。但是，新塔花哪些成分起到了靶向作用，還需進一步對藥效學(xué)和機制展開研究。