西瓜種質(zhì)抗病性的分子標(biāo)記檢測和人工接種鑒定

易麗聰 王運(yùn)強(qiáng) 龔鈺 邱益純 焦春海 徐上軍 戴照義

摘 要：病害是西瓜生產(chǎn)中導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)下降的關(guān)鍵因素。利用已報道的西瓜抗枯萎病、炭疽病和白粉病分子標(biāo)記對230份西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行抗病性鑒定，分別篩選出相應(yīng)的抗性種質(zhì)60份、20份和35份，其中兼抗枯萎病和炭疽病的資源6份，兼抗枯萎病和白粉病的資源8份，兼抗炭疽病和白粉病的資源6份。對其中23份種質(zhì)進(jìn)行抗枯萎病人工接種鑒定，篩選出8份高抗西瓜種質(zhì)，為西瓜抗病育種提供了寶貴的種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞：西瓜;種質(zhì);抗病性;分子標(biāo)記;人工接種

中圖分類號：S651 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）09-007-08

Screening of watermelon germplasm for disease resistance by molecular markers and artificial inoculation

YI Licong1， WANG Yunqiang1， GONG Yu1， QIU Yichun1， JIAO Chunhai2， XU Shangjun3， DAI Zhaoyi1

（1. Hubei Key Laboratory of Vegetable Germplasm Enhancement and Genetic Improvement/Institute of Economic Crops， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 2. Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， Hubei， China; 3. Bureau of Agriculture and Rural Affairs of Shishou City， Shishou 434400， Hubei， China）

Abstract： Disease is a crucial reason leading to yield and quality decline in watermelon production. In this paper， three previously reported molecular markers for resistant to fusarium wilt， anthracnose and powdery mildew were employed to detect the potential disease resistance of 230 watermelon germplasm resources， and 60， 20 and 35 resistant germplasm were identified， respectively. Also， eight watermelon germplasm that highly resistant to fusarium wilt were obtained by artificial inoculation. This work provides valuable germplasm resources for watermelon disease resistance breeding.

Key words： Watermelon; Germplasm; Disease resistance; Molecular marker; Artificial inoculation

西瓜（Citrullus lanatus）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在全球范圍內(nèi)廣泛栽培。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織數(shù)據(jù)庫（FAOSTAT）統(tǒng)計，2018年我國西瓜栽培面積達(dá)151.0萬hm2，占全球總面積的46.58%，總產(chǎn)量超6000萬t，占世界總產(chǎn)量的60.64%。西瓜產(chǎn)業(yè)已成為我國農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)業(yè)之一。

病害是導(dǎo)致西瓜產(chǎn)量和品質(zhì)下降的一個關(guān)鍵因素。西瓜生長過程中常見的病害包括枯萎?。‵usarium wilt）、炭疽?。ˋnthracnose）、蔓枯?。℅ummy stem blight）和白粉病（Powdery mildew）等。在所有病害中，枯萎病是危害西瓜產(chǎn)量和制約西瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的病害?？菸∮砂胫鷣嗛T尖孢鐮孢菌西瓜?；停‵usarium oxysporium）感染引起，是一種土傳性病害，其孢子能在土壤中存活達(dá)10年[1]。炭疽病由半知菌亞門黑盤孢目刺盤孢西瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare Berk. et Mont）感染引起，在西瓜整個生育期及果實(shí)貯運(yùn)過程中均可產(chǎn)生危害，可感染西瓜的幼苗、莖蔓、葉片和果實(shí)[2-3]。白粉病為多循環(huán)真菌性病害，寄主有甜瓜、南瓜、冬瓜、黃瓜等多種葫蘆科作物。白粉病主要侵染葉片，嚴(yán)重時可侵染莖蔓和果實(shí)[4]，導(dǎo)致品質(zhì)下降和大幅度減產(chǎn)。生產(chǎn)上主要通過土壤消毒、噴施化學(xué)藥劑和選用抗病品種等方法防治病害。隨著消費(fèi)者對西瓜品質(zhì)和質(zhì)量安全要求的提高，選用抗病品種已成為防治西瓜病害的首要手段。

在傳統(tǒng)育種中，培育一個抗病品種時間長、工作量大、效率低。隨著生物技術(shù)的進(jìn)步，利用分子標(biāo)記輔助選擇可顯著提高抗病育種和聚合育種的效率[5]。目前已報道多個與西瓜抗病、品質(zhì)、外觀等性狀相關(guān)的分子標(biāo)記[6-8]。在枯萎病抗性方面，張屹[1]、李娜等[9]分別利用不同的遺傳分析群體定位出西瓜抗枯萎病主效基因位點(diǎn)，并開發(fā)出7716_fon、InDel1_fon1等抗病分子標(biāo)記。Jang等[10]對西瓜炭疽病菌生理小種1抗性基因完成定位并開發(fā)出分子標(biāo)記CL14-27-9，該標(biāo)記對41份栽培西瓜的抗性檢測準(zhǔn)確率達(dá)100%。Kim等[11]利用F2抗感分離群體定位1個抗瓜類白粉病菌生理小種1W的主效基因，并開發(fā)出分子標(biāo)記PMR2.1。上述分子標(biāo)記為西瓜抗病種質(zhì)篩選和抗病育種提供了良好基礎(chǔ)。

筆者利用上述報道的抗枯萎病、炭疽病和白粉病分子標(biāo)記進(jìn)行西瓜抗病種質(zhì)初步篩選，并對部分材料開展枯萎病抗性人工接種鑒定，為西瓜抗病育種提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

參試的230份西瓜種質(zhì)主要為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所瓜類課題組自主創(chuàng)制的高代自交系材料，少部分為國內(nèi)外引進(jìn)，包含栽培種、地方種和野生種。所有材料均為二倍體。

1.2 抗病分子標(biāo)記

1.2.1 抗枯萎病分子標(biāo)記 抗枯萎病分子標(biāo)記7716_fon由張屹開發(fā)[12]，針對枯萎病菌生理小種1，引物序列見表1。7716_fon為CAPS標(biāo)記，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為170 bp，感病材料存在堿基C>T的突變，產(chǎn)生1個TaqⅠ酶切位點(diǎn)。感病材料能被TaqⅠ酶切割成2個小片段（104 bp + 66 bp），抗病材料不能被酶切。

1.2.2 抗炭疽病分子標(biāo)記 抗炭疽病分子標(biāo)記是在Jang等[10]開發(fā)的CL14-27-9標(biāo)記上改良而來，命名為CL14-27-9R，針對西瓜炭疽病菌生理小種1，引物序列見表1。CL14-27-9R為CAPS標(biāo)記，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為227 bp，抗病材料存在堿基G>A突變，產(chǎn)生1個新的HindⅢ酶切位點(diǎn)。感病材料包含1個HindⅢ位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生2個片段（213 bp + 14 bp）;抗病材料包含2個HindⅢ位點(diǎn)，酶切后產(chǎn)生3個片段（168 bp + 45 bp + 14 bp）。

1.2.3 抗白粉病分子標(biāo)記 抗白粉病分子標(biāo)記PMR2.1為Kim等[11]開發(fā)，針對白粉病菌生理小種1W，引物序列見表1。PMR2.1為CAPS標(biāo)記，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為527 bp，感病材料存在堿基A>G突變，產(chǎn)生1個Taq Ⅰ酶切位點(diǎn)。感病材料經(jīng)Taq Ⅰ酶酶切后產(chǎn)生2個片段（334 bp +223 bp），抗病材料不能被酶切。

1.3 標(biāo)記檢測

1.3.1 基因組DNA提取 對230份西瓜種質(zhì)資源進(jìn)行浸種催芽，待胚根伸長至1～2 cm時采樣，每份材料至少混合10個單株。采用CTAB法提取基因組DNA（gDNA），DNA樣品溶解在50 μg·mL-1的RNA酶溶液中，隨后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測樣品的完整性和質(zhì)量濃度，將質(zhì)量濃度調(diào)整為約50 ng·μL-1，然后放置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增和酶切檢測 分子標(biāo)記檢測于2019年在蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。采用2×Taq Master Mix（莫納生物）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，包含1.0 μL gDNA 模板，正反向引物各0.4 μL（100 μmol · L-1），10 μL 2×Taq Master Mix，Inc.），ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán);72 ℃延伸5 min;PCR 產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用快速限制性內(nèi)切酶TaqⅠ或HindⅢ酶切（Thermo Scientific?），反應(yīng)體系為20 μL，包含5.0 μL PCR產(chǎn)物，2 μL緩沖液1 μL 內(nèi)切酶，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7 ℃酶切20 min;80 ℃變性10 min。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4 抗枯萎病人工接種鑒定

人工接種試驗(yàn)于2020—2021年在蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

接種鑒定參照耿麗華等[13]的方法，即將種子表面消毒后浸種催芽，發(fā)芽后播種于高溫高壓滅菌的蛭石基質(zhì)中，在子葉平展期，將苗輕輕取出，清水洗凈根系，在濃度為5×106個·mL-1的枯萎菌孢子懸浮液中浸根15 min，對照植株在無菌水中浸根15 min。西瓜枯萎病生理小種1由浙江大學(xué)李大勇教授提供。

接種后幼苗移栽至經(jīng)過高壓濕熱滅菌的蛭石和草炭等體積混合的基質(zhì)中。在室溫為25 ℃條件下培養(yǎng)，3 d后剔除不正常植株，植株出現(xiàn)萎蔫癥狀時開始調(diào)查記錄發(fā)病情況，直至接種后21 d結(jié)束調(diào)查。每種材料接種30株，設(shè)3次重復(fù)。

抗性分級參照Smarty 和 Bruton[14]提出的標(biāo)準(zhǔn)：高抗（HR）病株率≤20%;中抗（MR）病株率為21%～50%;輕抗（LR）病株率為51%～80%;感?。⊿）病株率>80%。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜抗枯萎病的分子標(biāo)記檢測

7716_fon標(biāo)記在西瓜種質(zhì)中擴(kuò)增出目標(biāo)片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)TaqⅠ限制性酶切和電泳后產(chǎn)生預(yù)期的2種帶型（圖1），一種為不能被切割的原始條帶（170 bp），對應(yīng)材料判斷為抗病種質(zhì)，如材料BH1003（編號1）等;另一種新增2個小片段（104 bp + 66 bp），對應(yīng)材料判斷為感病種質(zhì)，如材料QZ26-1（編號8）。在230份材料中共篩選出60份攜帶枯萎病抗性標(biāo)記的種質(zhì)，詳見表2。

2.2 西瓜抗炭疽病的分子標(biāo)記檢測

CL14-27-9R標(biāo)記的PCR產(chǎn)物經(jīng)HindⅢ內(nèi)切酶酶切和電泳后產(chǎn)生2種帶型（圖2），其中2條帶型（213 bp + 14 bp）對應(yīng)材料判斷為感病種質(zhì)，如材料BH1003（編號1）等;另一種新增3個小片段（168 bp + 45 bp +14 bp），對應(yīng)材料判斷為抗病種質(zhì)，如材料XGSN001（編號11）。在230份材料中共篩選出20份攜帶炭疽病抗性標(biāo)記的種質(zhì)，詳見表2。

2.3 西瓜抗白粉病的分子標(biāo)記檢測

標(biāo)記PMR2.1的PCR產(chǎn)物經(jīng)TaqⅠ限制性酶切和電泳后產(chǎn)生2種帶型（圖3），包含2個較小片段（334 bp + 223 bp）的材料判斷為感病種質(zhì)，如材料BH1003（編號1）等;包含1個較大片段（527 bp）的材料判斷為抗病種質(zhì)，如材料XGNR001（編號17）。在230份材料中共篩選出35份攜帶白粉病抗性標(biāo)記的種質(zhì)，詳見表2。

2.4 西瓜抗枯萎病的人工接種鑒定

對23份西瓜種質(zhì)進(jìn)行抗枯萎病人工接種鑒定，其中2份攜帶感病標(biāo)記的材料均表現(xiàn)為高感枯萎病，在21份攜帶抗病標(biāo)記的材料中8份為高抗、2份為中抗、2份為輕抗、9份為高感枯萎病。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，7716_fon標(biāo)記檢測與人工接種鑒定結(jié)果的吻合度為60.87%（表3）。

3 討論與結(jié)論

基因組測序技術(shù)的飛速發(fā)展使得基因定位和克隆越來越高效，大量與基因緊密連鎖或功能分子標(biāo)記被開發(fā)，進(jìn)而推動了分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在育種中的廣泛應(yīng)用。目前，在水稻、玉米、小麥等主糧作物和番茄、黃瓜等蔬菜中，一系列與產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性等相關(guān)的分子標(biāo)記已實(shí)現(xiàn)在育種中的應(yīng)用[15-17]。

分子標(biāo)記輔助選擇可以避免環(huán)境對性狀的影響，提高育種選擇的準(zhǔn)確性，同時可以在育種早期世代中進(jìn)行選擇，以縮短育種周期，提高育種效率。但分子標(biāo)記輔助選擇也有一定的局限性，尤其是對數(shù)量性狀，在不同遺傳背景下的選擇效率可能有較大差異。植物抗病性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，不僅受多個基因調(diào)控，同時也和病原菌存在互作。病原菌一般有多種生理小種，不同地理區(qū)域優(yōu)勢小種不同并且小種分化演替快，因此育種材料抗病性的分子標(biāo)記檢測需更加細(xì)致和有針對性。目前已報道4種枯萎病生理小種[1]，分別為小種0、1、2和3。我國枯萎病致病菌主要為小種1，筆者利用針對小種1的抗性標(biāo)記7716_fon進(jìn)行種質(zhì)抗病性檢測，篩選出60份潛在的抗枯萎病材料，占比26.1%。選擇其中23份種質(zhì)資源進(jìn)行抗枯萎病人工接種鑒定，結(jié)果表明，標(biāo)記檢測和接種鑒定的吻合度為60.87%，低于張屹[1]對164份西瓜資源（98.7%）和李娜等[9]對130份西瓜資源的鑒定結(jié)果（70.8%），主要原因是鑒定材料的遺傳背景不同，其次是本試驗(yàn)中接種鑒定的材料數(shù)量偏少，其他材料的人工接種工作將在后續(xù)展開。經(jīng)人工接種鑒定，23份材料中共有9份材料的枯萎病抗性與分子標(biāo)記檢測不相符：原因一是標(biāo)記7716_fon與抗枯萎病基因之間還存在一定的遺傳距離，標(biāo)記和抗病基因未達(dá)到共分離;二是西瓜枯萎病抗性受多個基因調(diào)控，可能存在其他抗病基因位點(diǎn)的變異。因此，進(jìn)一步對抗枯萎病基因進(jìn)行精細(xì)定位和克隆，開發(fā)檢測準(zhǔn)確度更高的分子標(biāo)記非常有必要。本試驗(yàn)中從材料sugarlee鑒定出的抗性等級與前人試驗(yàn)有一定偏差[18]，但并不相矛盾，可能是不同接種方法和操作人員的試驗(yàn)誤差所導(dǎo)致。

與枯萎病相比，西瓜炭疽病菌和白粉病菌的生理小種類型更多，抗病機(jī)制也更為復(fù)雜。目前已報道7種西瓜炭疽病生理小種（小種1～7），生產(chǎn)上危害最多的是小種1、2和3[2-3]。筆者利用抗炭疽病生理小種1的標(biāo)記CL14-27-9R在230份西瓜種質(zhì)中篩選出20份潛在的抗炭疽病種質(zhì)，占比8.7%。已鑒定出能引起白粉病的真菌有3個屬6個種[4]，危害最嚴(yán)重的二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum）和單囊殼菌（Sphaerotheca fuliginea）分別有2個和11個生理小種。目前西瓜中報道的抗白粉病基因非常少[11]，但在甜瓜和黃瓜中分別鑒定出12個和4個與白粉病抗性相關(guān)的基因[19]。筆者利用Kim等[11]開發(fā)的抗白粉病生理小種1W的分子標(biāo)記PMR2.1在230份西瓜種質(zhì)中篩選出35份抗性種質(zhì)，占比15.2%。孫洪寶等[20]利用接種鑒定從820份美國PI西瓜種質(zhì)資源中篩選出27份抗生理小種2WF的種質(zhì)，其中7份兼抗生理小種1W。由于缺乏炭疽病菌和白粉病菌生理小種的鑒別寄主，筆者不能確定收集的炭疽病菌和白粉病菌的小種類型，因此暫未開展該這2類病害抗病材料的人工接種鑒定。缺乏完整的病原菌生理小種鑒別寄主和標(biāo)準(zhǔn)的接種鑒定技術(shù)規(guī)程也是國內(nèi)大多數(shù)學(xué)者和育種家共同面臨的問題。因此，急需形成一套統(tǒng)一的鑒別寄主和接種鑒定方法，進(jìn)而促進(jìn)對西瓜炭疽病抗性和白粉病抗性的遺傳研究、分子機(jī)制研究和分子標(biāo)記開發(fā)，以滿足西瓜抗病育種需求。

綜上所述，筆者利用分子標(biāo)記篩選出60份抗枯萎病、20份抗炭疽病、35份抗白粉病的西瓜種質(zhì)資源，其中兼抗枯萎病和炭疽病的資源6份（表2）、兼抗枯萎病和白粉的資源8份、兼抗炭疽病和白粉病的資源6份。通過人工接種鑒定篩選出8份高抗枯萎病西瓜種質(zhì)，為西瓜抗病改良和抗病聚合育種中親本材料的選擇提供了依據(jù)。

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