氧化釹暴露對小鼠肺組織炎癥因子及轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smads通路的影響

呂佳玲，王素華，高艷榮，李怡博，宋海燕

內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古 包頭 014040

稀土釹的用途日益廣泛，但是在生產(chǎn)稀土釹的過程中，會產(chǎn)生稀土氧化釹（neodymium oxide，Nd2O3）粉塵，而稀土Nd2O3粉塵會導致一系列的職業(yè)病危害［1］。已有研究發(fā)現(xiàn)，長期在釹及其化合物濃度較高環(huán)境中作業(yè)的工人肺部會產(chǎn)生纖維性病變，最終導致塵肺的形成［2］。

二氧化硅（silicon dioxide，SiO2）粉塵粒徑＜0.5 μm，經(jīng)呼吸道進入肺組織，黏附在肺泡壁上，巨噬細胞吞噬粉塵激活了核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），激活的NF-κB 不僅誘導釋放白介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促進炎癥的細胞因子，還與下游轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）的啟動子結(jié)合，誘導促纖維化因子TGF-β1 的表達［1］，TGF-β1 與特異性受體結(jié)合，激活下游細胞信號轉(zhuǎn)導分子Smad2、Smad3，并使其磷酸化（p-Smad2、p-Smad3）后進入細胞核，將組織纖維化信號傳導入核，激活經(jīng)典致纖維化通路TGF-β/Smads通路［3］。

Nd2O3為粒徑0.2 μm 的粉塵，同SiO2顆粒均屬于細顆粒，通過呼吸道進入肺部后，支氣管和肺泡區(qū)域纖毛的擺動很難將其清除，沉積在肺部的粉塵顆粒大多被肺泡巨噬細胞吞噬［1］，從而激活NF-κB炎性通路，但是否會激活TGF-β/Smads 通路尚不清楚。有學者研究表明巨噬細胞對SiO2的識別是啟動矽肺發(fā)病的關(guān)鍵點，而肺泡巨噬細胞在吞噬粉塵的過程中被活化，產(chǎn)生固有免疫應答反應，其特征表現(xiàn)為細胞因子及生長因子的合成與釋放［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，Nd2O3灌肺后會引起大鼠肺組織急性損傷，前期以炎性損傷為主，晚期形成纖維細胞性結(jié)節(jié)［1］，膠原表達也同時增多，而羥脯氨酸（hydroxyproline，HYP）可反映膠原的代謝情況，因此測定HYP 的含量可換算成膠原含量。流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，稀土粉塵可以導致塵肺，其影像學具有一般塵肺的特點，卻又輕于一般塵肺如矽肺，但其機制不詳［5］。

本研究將C57BL/6 雄性小鼠暴露于不同濃度稀土Nd2O3后，觀察染塵后第7、14、28 天小鼠肺組織病理學變化，檢測小鼠肺組織中HYP、炎癥因子IL-6/TNF-α、促纖維化因子TGF-β1、結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）的含量以及TGF-β/Smads 通路上Smad2、Smad3mRNA 相對表達量、各蛋白表達量，探討TGF-β/Smads通路在Nd2O3致小鼠肺損傷過程中的作用，初步闡明Nd2O3致小鼠肺損傷過程中的機制。

1 對象與方法

1.1 實驗試劑與儀器

Nd2O3購于中國包頭市瑞鑫稀土冶煉廠，麻醉劑三溴乙醇購于中國南京愛貝生物科技有限公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗試劑盒購于中國武漢伊萊瑞特公司，總RNA 提取、反轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR 以及蛋白質(zhì)的檢測試劑盒均購買于美國Promega公司。

低溫高速離心機（TDZ-WS）產(chǎn)于中國上海安亭科學儀器廠，Cycler?96 instrument PCR儀購于美國Applied Biosystems 公司，BAYGENE 電泳儀（BG-Power600k）購于中國北京百晶生物技術(shù)有限公司，多功能微孔板檢測系統(tǒng)（Synergy HT）購于美國Bio Tek 公司，SYNGENE凝膠成像及分析系統(tǒng)購于英國SYNGENE公司。

1.2 動物分組與染塵

SPF 級C57BL/6 雄性小鼠144 只，體重20～22 g，購自中國斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010。所有小鼠均飼養(yǎng)在內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院實驗動物中心，自由攝食及飲水。本研究經(jīng)包頭醫(yī)學院倫理審查委員會的評估［批準號：包醫(yī)倫審2018 第（020）號］。飼養(yǎng)條件：室溫控制在（24±3）℃，室內(nèi)濕度（50±10）%，12 h間斷照明，晝夜交替，定時排風換氣，保持室內(nèi)無噪聲、無強刺激等。

實驗動物隨機分為1 個對照組和3 個染塵組，每組36 只，將121℃、20 min 高壓滅菌后的Nd2O3溶于無菌生理鹽水制成62.5、125、250 mg·mL-1Nd2O3懸液，置于磁力攪拌器上備用。使用三溴乙醇麻醉小鼠后，分別取各濃度Nd2O3懸液各0.1 mL 通過非暴露式一次性氣管注入法灌肺，對照組灌注0.1 mL生理鹽水。染塵后分別于第7、14、28 天三個時間點處死小鼠，每組每個時間點均處死12只，取肺組織進行檢測。

1.3 檢測指標及方法

1.3.1 肺組織病理學檢查稱重之后取小鼠左側(cè)肺組織固定于4%多聚甲醛中，進行HE 染色，在200 倍顯微鏡下觀察。

1.3.2 堿水解法測定肺組織中HYP 含量稱取小鼠右側(cè)肺組織80 mg 于10 mL 比色管，加水解液，水浴。冷卻加指示劑，搖勻加pH 調(diào)節(jié)劑，液體出現(xiàn)黃綠色停止。加雙蒸水至刻度線。取水解液加活性炭，混勻后離心，取上清加底物液，混勻靜置加緩沖液，5 min 后加顯色劑，再次水浴冷卻后離心取上清，雙蒸水調(diào)零后于550 nm波長下測光密度值。

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測肺組織中TNF-α、IL-6、TGF-β1、CTGF 含量取10 mg 小鼠肺組織置于2.0 mL離心管中，與預冷的磷酸鹽緩沖液按照質(zhì)量體積比1 g：9 mL 的比例制成組織勻漿，5 000×g離心10 min，取上清，按試劑盒說明書的操作步驟通過酶聯(lián)免疫吸附法進行測定。

1.3.4 實時熒光定量PCR 法檢測肺組織中Smad2、Smad3 mRNA表達量使用ReliaPrepTMmiRNA Cell and Tissue Miniprep System 試劑盒提取肺組織總RNA，使用北京全式金生物技術(shù)有限公司AT351-01 試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄，之后進行實時熒光定量PCR 反應。每個樣品設(shè)置3 個復孔，以β-actin為內(nèi)參，用2-ΔΔCt計算各樣品的mRNA相對表達量。引物由上海生物工程有限公司合成，各基因引物序列見表1。按照95℃，120 s，循環(huán)1 次；95℃，15 s 循環(huán)50 次；溫度降至75℃后mRNA實時熒光定量PCR 反應完成。

表1 引物序列表Table 1 Gene primer sequence

1.3.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測肺組織Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達量通過對各染塵劑量組小鼠肺組織HE 染色、HYP 的檢測，發(fā)現(xiàn)在250 mg·mL-1Nd2O3劑量下，小鼠肺組織纖維化損傷最為明顯，因此每組選取3 只小鼠，檢測肺組織中Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達量。取小鼠肺組織稱重30 mg，剪碎后加入蛋白裂解液，于冰上破碎組織，靜置離心后取上清液蛋白定量、變性，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育、洗膜后，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內(nèi)參進行Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 蛋白相對表達量的測定。

1.4 統(tǒng)計學分析

應用SPSS 22.0 軟件進行分析，計量資料均以均數(shù)±標準差表示，對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗和方差齊性檢驗。Smad2、Smad3 蛋白相對表達量符合正態(tài)分布且方差齊，采用兩獨立樣本t檢驗。HYP、IL-6、TNF-α、TGF-β1、CTGF、Smad2/Smad3mRNA 表達量采用方差分析，方差齊的數(shù)據(jù)采用LSD-t進行兩兩比較；染塵第7 天HYP、TNF-α、Smad2/Smad3mRNA 表達量、染塵第14 天Smad3mRNA 表達量、染塵第28 天TNF-α含量方差不齊，采用Dunnett’s T3 檢驗進行兩兩比較。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察

灌肺時無動物死亡，各組動物體重隨實驗時間逐漸增加，各組小鼠體重變化如圖1。

圖1 Nd2O3 染塵后小鼠體重變化（n=12）Figure 1 Changes in body weight of mice after Nd2O3 exposure(n=12)

2.2 HE染色病理結(jié)果

生理鹽水對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整；小鼠暴露于Nd2O3后，第7 天肺組織以炎性滲出為主，第14 天有明顯的纖維增生，第28 天時高劑量出現(xiàn)細胞纖維結(jié)節(jié)。見圖2。

圖2 Nd2O3染塵后小鼠肺組織HE染色結(jié)果（×200）Figure 2 HE staining results of the lung tissues in mice after Nd2O3 exposure (×200)

2.3 HYP 含量

染塵后第7、14、28天時，125、250 mg·mL-1Nd2O3染塵組HYP含量均高于對照組（P＜0.05），且在染塵后第28 天時，250 mg·mL-1Nd2O3組HYP 含量達到最高，為（1.87±0.19）μg·mg-1。見表2。

表2 Nd2O3染塵后各組小鼠肺組織HYP含量比較（±s，n=12）Table 2 Comparison of HYP levels in the lung tissues of mice after Nd2O3 exposure (±s, n=12)單位（Unit）：μg·mg-1

表2 Nd2O3染塵后各組小鼠肺組織HYP含量比較（±s，n=12）Table 2 Comparison of HYP levels in the lung tissues of mice after Nd2O3 exposure (±s, n=12)單位（Unit）：μg·mg-1

［注］a：與對照組比較，P＜0.05；b：與62.5 mg·mL-1 Nd2O3 組比較，P＜0.05；c：與125 mg·mL-1 Nd2O3組比較，P＜0.05。

組別 染塵時間第7天 第14天 第28天對照組 0.77±0.01 1.01±0.09 0.94±0.00 62.5 mg·mL-1 Nd2O3組 0.94±0.01a 1.10±0.09 1.24±0.08a 125 mg·mL-1 Nd2O3組 1.49±0.13ab 1.53±0.06ab 1.50±0.02ab 250 mg·mL-1 Nd2O3組 1.54±0.01ab 1.63±0.08ab 1.87±0.19abc F 104.93 43.147 44.36 P＜0.05＜0.05＜0.05

2.4 IL-6、TNF-α、TGF-β1、CTGF含量

除14 天TGF-β1 外，染塵后第7、14、28 天，各Nd2O3染毒組小鼠肺組織中的IL-6、TNF-α、TGF-β1、CTGF 的含量均高于對照組（均P＜0.05）。在染塵后第14 天時，小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 的含量達到最高；促纖維化因子TGF-β1、CTGF 的含量在第28 天達到最高。見表3。

表3 Nd2O3染塵后各組小鼠肺組織IL-6、TNF-α、TGF-β1、CTGF含量（±s，n=12）Table 3 The levels of IL-6,TNF-α,TGF-β1,and CTGF in the lung tissues of mice after Nd2O3 exposure (±s, n=12)

表3 Nd2O3染塵后各組小鼠肺組織IL-6、TNF-α、TGF-β1、CTGF含量（±s，n=12）Table 3 The levels of IL-6,TNF-α,TGF-β1,and CTGF in the lung tissues of mice after Nd2O3 exposure (±s, n=12)

［注］a：與對照組比較，P＜0.05；b：與62.5 mg·mL-1 Nd2O3組比較，P＜0.05；c：與125 mg·mL-1 Nd2O3組比較，P＜0.05。

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2.5 Smad2、Smad3 mRNA的表達

除第7 天Smad3外，染塵后第7、14、28 天各Nd2O3染塵組Smad2、Smad3mRNA 的相對表達量均高于對照組（均P＜0.05），且隨著染塵劑量的升高，染塵后小鼠肺組織中Smad2、Smad3mRNA 的相對表達量呈現(xiàn)增多的趨勢，以250 mg·mL-1Nd2O3組相對表達量最多。染塵第28 天時，250 mg·mL-1Nd2O3組小鼠肺組織中Smad2、Smad3mRNA 相對表達量分別達到10.04±0.61、11.87±0.88。見表4。

表4 Nd2O3染塵后各組小鼠肺組織Smad2、Smad3 mRNA 的相對表達量（±s，n=12）Table 4 The relative expression levels of Smad2 and Smad3 mRNA in the lung tissues of mice after Nd2O3 exposure (±s, n=12)

表4 Nd2O3染塵后各組小鼠肺組織Smad2、Smad3 mRNA 的相對表達量（±s，n=12）Table 4 The relative expression levels of Smad2 and Smad3 mRNA in the lung tissues of mice after Nd2O3 exposure (±s, n=12)

［注］a：與對照組比較，P＜0.05。

組別 Smad2 Smad3第7天 第14天 第28天 第7天 第14天 第28天對照組 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 1.00±0.00 62.5 mg·mL-1 Nd2O3組 3.49±0.40a 4.60±1.00a 4.85±0.88a 1.79±0.43 4.37±0.16a 6.70±0.86a 125 mg·mL-1 Nd2O3組 4.70±0.57a 5.64±0.76a 8.70±0.83a 3.02±0.53a 8.67±0.15a 9.62±0.27a 250 mg·mL-1 Nd2O3組 5.43±0.63a 7.81±0.96a 10.04±0.61a 5.32±0.70a 9.37±0.28a 11.87±0.88a F 78.8 56.91 162.04 58.96 2448.89 261.74 P＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05＜0.05

2.6 Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達

在250 mg·mL-1Nd2O3劑量下，染塵后小鼠肺組織中Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 蛋白相對表達量均高于對照組（P＜0.05），Smad2 蛋白相對表達量在染塵后第28天達到最高，與mRNA檢測結(jié)果一致；而Smad3、p-Smad2、p-Smad3 蛋白相對表達量在第14天達到最高，第28天出現(xiàn)下降。見圖3、圖4。

圖3 250 mg·mL-1 Nd2O3組小鼠肺組織Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3 蛋白表達量條帶圖（n=3）Figure 3 The protein expression bands of Smad2,Smad3,p-Smad2,and p-Smad3 in the lung tissues of mice in the 250 mg·mL-1 Nd2O3 group (n=3)

圖4 250 mg·mL-1 Nd2O3組小鼠肺組織Smad2（A）、Smad3（B）、p-Smad2（C）、p-Smad3（D）蛋白相對表達量（n=3）Figure 4 The relative expression levels of Smad2 (A),Smad3 (B),p-Smad2 (C),and p-Smad3 (D) proteins in the lung tissues of mice in the 250 mg·mL-1 Nd2O3 group (n=3)

3 討論

本研究對雄性健康成年小鼠進行Nd2O3灌肺染塵處理后，小鼠肺組織HE 結(jié)果顯示，在染塵后第28 天時，250 mg·mL-1Nd2O3組小鼠肺組織有細胞纖維結(jié)節(jié)形成。HYP 的檢測結(jié)果表明，染塵組小鼠肺組織HYP含量在各時間點高于對照組，且在染塵第28 天時，250 mg·mL-1Nd2O3組小鼠肺組織中HYP含量達到最高。這一結(jié)果說明Nd2O3染塵后可以引起小鼠肺組織中膠原纖維表達量升高，250 mg·mL-1Nd2O3可導致小鼠肺纖維化。

Nd2O3進入人體后，因其粒徑小，最終會黏附在肺泡腔的表面。Nd2O3顆粒的入侵，會激活巨噬細胞，在清除Nd2O3粉塵異物的同時釋放大量的炎癥因子［6］。在粉塵進入肺組織，引起組織炎癥時，單核巨噬細胞活化后會產(chǎn)生TNF-α、IL-6、TGF-β1 以及CTGF 等細胞因子。TNF-α 是一種可以誘導白細胞在炎癥部位大量聚集的促炎因子，它不僅激活嗜中性粒細胞，還提高其吞噬能力，更與IL-1β 共同放大IL-6 的表達，在免疫調(diào)節(jié)和炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，各種炎癥因子共同促進肺纖維化發(fā)展［7］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在染塵后第7、14、28 天時，各染塵劑量組小鼠肺組織中IL-6、TNF-α 含量均高于對照組，且在第14 天時達到最高。以上結(jié)果表明Nd2O3暴露可引起小鼠炎癥因子水平升高。粉塵進入肺組織，首先會引起肺組織炎癥反應，持續(xù)性的炎癥反應最終會引起肺組織纖維化，在這一過程中TGF-β1 發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在肺纖維化發(fā)生和形成中產(chǎn)生的TGF-β1，在與細胞膜上的特異性受體結(jié)合后，TGF-β1 信號通路中的遞質(zhì)分子Smad2、Smad3活化，磷酸化后的Smad2、Smad3 攜帶纖維化信號進入細胞核，促進纖維蛋白的合成，致使纖維蛋白在肺間質(zhì)和肺泡間過度沉積［8］。有研究發(fā)現(xiàn)，Smad3是TGF-β1 受體激活后起纖維化作用的主要靶點，以Snad3 磷酸化為TGF-β/Smads 通路激活的關(guān)鍵標志［9］。而且TGF-β1 可以與其下游效應分子CTGF 促成肺組織纖維化的發(fā)生［10］。本研究發(fā)現(xiàn)在染塵第7、14、28 天時各染塵劑量組TGF-β1、CTGF 均高于對照組，各染塵劑量組小鼠肺組織中TGF-β/Smads 通路相關(guān)基因Smad2、Smad3mRNA 及蛋白相對表達量較對照組均升高，且250 mg·mL-1Nd2O3劑量組p-Smad2、p-Smad3蛋白表達量較對照組均升高。染塵第28 天時，Smad3mRNA 相對表達量達到最高，但其蛋白相對表達量卻較染塵第14天有所下降。可能是由于從mRNA到蛋白質(zhì)的翻譯過程受多種因素的影響，如mRNA 非翻譯區(qū)序列的差異變化、mRNA 核糖體結(jié)合部位的序列、轉(zhuǎn)運RNA 豐度等，這些因素影響了蛋白質(zhì)的合成，導致mRNA 與蛋白質(zhì)表達水平出現(xiàn)差異［11］。以上結(jié)果表明小鼠暴露于Nd2O3后，肺組織內(nèi)TGF-β/Smads 通路啟動因子TGF-β1、協(xié)同因子CTGF、TGF-β/Smads 通路中的關(guān)鍵基因Smad2、Smad3表達水平升高，p-Smad2、p-Smad3表達水平升高，提示Nd2O3可以激活TGF-β/Smads 通路，最終引起肺組織纖維化。

綜上，本研究顯示稀土Nd2O3暴露可引起小鼠肺組織發(fā)生炎癥反應和纖維化，其機制可能與TGF-β/Smads 通路的激活有關(guān)。