海藻酸鹽基胃黏膜保護膠作為黏膜下注射劑的可行性研究及其安全性

【作 者】何牧野，孫聰慧，王苗苗，曲明悅，王春仁，王涵

1 中國食品藥品檢定研究院，北京市，102629

2 煙臺大學，煙臺市，264000

0 引言

內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)（endoscopic submucosal dissection,ESD）是由最早的針對早期胃癌的內(nèi)鏡下黏膜切除術(shù)（endoscopic submucosal resection,EMR）演變而來。ESD術(shù)與EMR術(shù)相較于普通的外科手術(shù)有創(chuàng)傷小，具有患者術(shù)后生存質(zhì)量高，花費小的優(yōu)點[1]。ESD術(shù)與EMR術(shù)相比[2]實現(xiàn)了對較大較深的腫瘤的摘除，使得腫瘤剝離更加徹底，術(shù)后復發(fā)率大幅降低，然而隨著技術(shù)的不斷改進，黏膜下剝離術(shù)操作的難度越來越大，術(shù)后穿孔現(xiàn)象也越來越多。

在ESD術(shù)中，良好的黏膜下注射液可避免手術(shù)操作穿孔、手術(shù)操作困難等問題。生理鹽水安全性高、價格低廉，是常用的黏膜下注射液，但形成隆起效果差、擴散快需多次注射，這些缺點使得生理鹽水不能成為最佳的黏膜下注射液。本研究所用海藻酸鹽基胃黏膜保護膠是一種新型復合材料，主要用于ESD術(shù)后的潰瘍修復，內(nèi)含有海藻酸鹽[2]、多聚賴氨酸[3]等成分，起到止血、促進潰瘍愈合的作用，是非常創(chuàng)新的醫(yī)療器械產(chǎn)品。筆者前期的研究結(jié)果也證明該胃黏膜保護膠在胃黏膜修復方面有較好的效果。胃黏膜保護膠是一種彈性水凝膠，具備成為黏膜下注射劑的必要條件，本研究主要探究胃黏膜保護膠作為黏膜下注射劑的可行性以及其安全性。

1 材料及方法

1.1 材料與試劑

實驗材料：胃黏膜保護膠（浙江杭州英健生物科技有限公司，中國）；新鮮豬肚（奧博屠宰場，河北），保存于4 ℃冰箱中，實驗結(jié)束到屠宰時間不超過12 h；L929細胞株（來源：中國食品藥品檢定研究院細胞資源中心）。

實驗動物：SD雄性大鼠32只，平均質(zhì)量（250±20）g，術(shù)前禁食不禁水24 h。8～9周齡雄性金黃地鼠5只（中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心），適應性喂養(yǎng)5 d；雄性小鼠30只，平均質(zhì)量（20±2）g。所有動物來源于中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京) 2014-0013；實驗動物使用許可證號：SYXK(京) 2017-0013。獨立通氣籠（IVC）條件下飼養(yǎng)，環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度40%～70%。

試劑：亞甲基藍（國藥集團化學試劑有限公司，中國）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司，中國）；0.9%氯化鈉溶液（石家莊四藥股份有限公司，中國）；MEM培養(yǎng)基（Corning，美國）；胎牛血清（天杭生物科技有限公司，浙江）；0.25%胰酶（Hyclone，美國）；精制玉米油（江蘇康普生物醫(yī)藥科技有限公司，中國）；二甲基亞砜（Sigma-Aldrich，美國）；高密度聚乙烯（日本Hatano研究所，日本）。

1.2 設(shè)備與耗材

使用的設(shè)備與耗材：1 mL注射器；計時器；流變儀（安東帕，奧地利）；白色泡沫板；游標卡尺（蘇測計量儀器有限公司，中國）；手術(shù)器械包；測量隆起裝置。

1.3 方法

1.3.1 可行性研究

離體實驗：10個新鮮豬肚（離體未超過12 h），將其上1/3段切割成小塊并固定于泡沫板上。實驗設(shè)置對照組和實驗組（n=6），其中對照組為0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）組，實驗組為用生理鹽水稀釋成10%、30%、50%、80%四個濃度梯度的胃黏膜保護膠稀釋液組。對照組與實驗組均加入一定量的亞甲基藍粉末配制成含有0.5%的亞甲基藍的生理鹽水或不同濃度保護膠組。用1 mL注射器斜45o在每組豬肚上黏膜下注射對應的試劑。使用專門的測量工具測量黏膜下隆起的高度，記錄對照組及樣品組溶液黏膜下注射后1 min、10 min、30 min、60 min的黏膜下隆起高度[10]。

體內(nèi)實驗：將32只SD大鼠隨機分為4組（n=8），禁食24 h后用10%的水合氯醛（稱取一定量的水合氯醛溶于生理鹽水配成1 mg/mL的水合氯醛溶液）腹腔注射麻醉，固定于無菌手術(shù)臺上，打開腹腔，取出胃并沿胃大彎處割開，清理胃內(nèi)容物，暴露胃黏膜。實驗設(shè)置對照組和實驗組（n=8），對照組為生理鹽水組，實驗組為用生理鹽水稀釋成30%、50%、80%三個濃度梯度的胃黏膜保護膠稀釋液組。在每組大鼠的胃黏膜下用1 mL注射器斜45o注射對應的試劑。用游標卡尺測量胃壁原始厚度，再測量隆起高度，并用測量的隆起厚度減去黏膜厚度為黏膜隆起的實際厚度，記錄黏膜下注射1 min、10 min、20 min、30 min的黏膜隆起厚度[11]。

不同濃度胃黏膜保護膠與生理鹽水黏度測試：將稀釋成10%、30%、50%、80%的胃黏膜保護膠與生理鹽水，在25oC下，采用流變儀在剪切速率1 s-1下進行蠕動掃描，測試其剪切黏度值。

1.3.2 安全性評價

細胞毒性試驗：實驗分為四組，樣品組（胃黏膜保護膠按3 cm2/mL加入含血清的MEM培養(yǎng)基中37oC，120 r/min搖床中浸提24 h）、陰性對照組（高密度聚乙烯）、陽性對照組（含有10%DMSO的含血清培養(yǎng)基）及空白對照組（含血清MEM培養(yǎng)基）溶液，將處于對數(shù)生長期的L929細胞按照國標16886.5使用MTT法測試樣品細胞毒性[5-6]。

急性毒性試驗：實驗分為四組，樣品鹽水組（胃黏膜保護膠按3 cm2/mL加入生理鹽水中37oC，120 r/min搖床浸提72 h）、樣品植物油組（胃黏膜保護膠按3 cm2/mL加入精制玉米油中37oC，120 r/min搖床浸提72 h）、對照油組（植物油）和對照水組（生理鹽水），按國標16886.11進行后續(xù)急性毒性實驗[7]。

口腔黏膜刺激試驗：實驗分為四組，樣品水組（胃黏膜保護膠按3 cm2/mL加入生理鹽水中37oC，120 r/min搖床浸提72 h）、樣品油組（胃黏膜保護膠按3 cm2/mL加入植物油中37oC，120 r/min搖床浸提72 h）、對照油組（植物油）和對照水組（生理鹽水），按GB 16886.10進行后續(xù)口腔黏膜刺激實驗[8-9]。

1.4 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計分析。安全性評價實驗中采用了獨立樣本t檢驗，有效性實驗中采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，檢驗水準為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 可行性研究

離體胃黏膜隆起高度的變化：不同濃度的樣品與生理鹽水在豬胃黏膜下注射隆起效果見表1和圖1，稀釋成不同濃度的黏膜保護膠組隆起高度均顯著高于生理鹽水組（P<0.05）；不同濃度的胃黏膜保護膠組中80%隆起高度均顯著高于30%和10%（P<0.05）；30%和50%在10 min、30 min、60 min時間隆起高度顯著高于10%（P<0.05）；50%和30%隆起高度無統(tǒng)計學差異。10%組與生理鹽水組下降趨勢很大，30%組、50%組和80%組下降趨勢較小，50%組與30%組下降趨勢無統(tǒng)計學差異，80%組隆起下降速度最慢。

表1 各時間點不同濃度溶液注射形成的隆起高度（mm）Tab.1 Elevation of different solution injection at each time point (mm)

圖1 不同溶液所致豬胃黏膜下注射隆起形態(tài)隨時間推移的變化Fig.1 Changes over time in the morphology of submucosal injection ridges of pigs caused by different solutions

體內(nèi)胃黏膜隆起高度的變化：不同濃度的樣品與生理鹽水組在大鼠黏膜下注射隆起效果見表2，稀釋成不同濃度的胃黏膜保護膠組在大鼠胃黏膜上注射時隆起厚度均顯著高于生理鹽水組（P<0.05），不同濃度黏膜保護膠組中80%組和50%組注射隆起厚度均顯著厚于30%組。30%組與生理鹽水組下降趨勢很大，50%組與80%組下降較慢，80%組下降速度慢。

表2 各時間點不同溶液注射形成隆起厚度（mm）Tab.2 Uplift thickness formed by injection of different solutions at each time point(mm)

不同濃度胃黏膜保護膠和生理鹽水黏度值：使用黏度計測試10%、30%、50%、80%以及生理鹽水的黏度值（見圖2），其中不同濃度胃黏膜保護膠黏度值與生理鹽水均形成顯著性差異（P<0.05），黏膜保護膠的濃度越高，黏度越大，注射難度越大。

圖2 不同濃度黏膜下保護膠和生理鹽水黏度值Fig.2 The viscosity values of different concentrations of submucosal protective glue and normal saline

2.2 安全性評價

細胞毒性試驗：不同濃度的樣品浸提液與空白、陽性、陰性對照24 h后的細胞存活率（見表3）。各濃度組樣品細胞存活率均大于70%，樣品無潛在細胞毒性。

表3 不同濃度樣品浸提液下細胞存活率Tab.3 Cell viability of samples at different concentrations

急性毒性試驗：灌胃后的樣品水組、樣品油組、對照水組、對照油組小鼠4 h、24 h、48 h、72 h小鼠未發(fā)現(xiàn)呼吸、肌肉運動、痙攣、反射、心血管、立毛、胃腸不適、皮膚紅腫的異?，F(xiàn)象，也未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。24 h、48 h、72 h后質(zhì)量變化，質(zhì)量呈逐漸增長趨勢，如圖3所示。

圖3 小鼠灌胃后三天質(zhì)量增長Fig.3 Mass gain of mice three days after gavage

口腔黏膜刺激試驗：金黃地鼠口腔頰囊內(nèi)放置各組棉球24 h后，對照生理鹽水組、對照植物油組、樣品生理鹽水組，樣品植物油組肉眼均未有糜爛、潰瘍、充血及腫脹，其中樣品組與對照組不同浸提液組織病理學觀察（見圖4）上皮完整、無白細胞浸潤、未有血管充血，水腫等現(xiàn)象，記分為0分。

圖4 口腔黏膜刺激組織病理圖（5×10）Fig.4 Histopathology of oral mucosa stimulation (5×10)

3 討論

20世紀90年代以來，內(nèi)鏡黏膜下剝離術(shù)的發(fā)展使得早期胃癌存活率大大提高，但其術(shù)后形成的較大較深的潰瘍面容易發(fā)生出血和穿孔等并發(fā)癥[12-13]。海藻酸鹽基胃黏膜保護膠能促進止血和潰瘍愈合并預防穿孔的發(fā)生，但保護膠除了需要關(guān)注其有效性外，其安全性也非常重要，本研究探究了胃黏膜保護膠的安全性，在細胞相容性實驗中樣品組細胞存活率均大于70%，樣品擁有良好的細胞相容性。在急毒和口腔黏膜刺激實驗中，樣品植物油浸提組與樣品生理鹽水浸提組均未出現(xiàn)明顯的急性毒性反應以及對口腔黏膜的刺激反應，有良好的生物相容性。

黏膜下注射劑的應用是ESD術(shù)操作過程中重要的一步，目前臨床常用的黏膜下注射劑有生理鹽水和透明質(zhì)酸[15]，但生理鹽水擴散較快增加了術(shù)中穿孔的風險[14]，而透明質(zhì)酸研究表明長期在創(chuàng)口使用能促進癌細胞增殖[16]。除此以外還有一些新型黏膜下注射劑如異戊烷[17]、熱敏二原水凝膠TBSH[18]、EleviewTM[19]、瑞巴派特溶液[20]等。目前的新型黏膜下注射劑應用途徑較為單一，難以在降低黏膜下注射難度的基礎(chǔ)上促進潰瘍愈合，本研究探究了胃黏膜保護膠的黏膜下注射可行性，結(jié)果顯示80%的胃黏膜保護膠能形成較高較持久的隆起，具有成為黏膜下注射劑的可行性。