微管蛋白β-Tubulin 在二、三倍體虹鱒(Oncorhynchus mykiss)表達與定位分析*

黃天晴 史秀蘭 王炳謙① 鄒作宇 谷 偉 劉恩慧程 琳 劉 洋 董福霖 潘贊宇 徐革鋒①

(1. 中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點實驗室 哈爾濱 150070;2. 哈爾濱市農(nóng)業(yè)科學院 哈爾濱 150029)

β-Tubulin 主要與細胞運動、細胞內(nèi)細胞器的定位及其遷移、細胞內(nèi)的物質(zhì)運輸、保持細胞形狀以及細胞分裂等有關(guān), 在發(fā)生減數(shù)分裂時微管蛋白形成二聚體從而組成紡錘體(Moriet al, 2011)。β-Tubulin微管蛋白屬于結(jié)構(gòu)物質(zhì), 并且作為細胞骨架重要的組成部分廣泛分布于動植物的組織與細胞中。β-Tubulin 微管蛋白有多方面的功能應用, 例如維持細胞形態(tài)和負責運輸細胞內(nèi)物質(zhì)等。在脊椎動物中,迄今為止已經(jīng)在哺乳動物和鳥類中鑒定出六種和七種微管蛋白同種型。兩棲動物和魚類中的微管蛋白的類型鮮為人知(Ludue?a, 1997), β-Tubulin 在不同生物類群之間既有很高的保守性又存在一定的變異性(Arocaet al, 2008), 來自不同脊椎動物物種的正常細胞或組織已經(jīng)闡明了差異表達的復雜模式, 表明細胞和功能的特異性和多樣性, 以及自由混合和適應性表達的能力, 但是, 尚未完全闡明β-Tubulin 同種型的細胞分布和功能(Fultonet al, 1976)。在哺乳動物和禽類的發(fā)育過程中, Ⅲ型β-Tubulin 被認為是最早的與神經(jīng)元相關(guān)的細胞骨架標記蛋白之一(Katsetoset al, 1993)。Stathmin 1 (STMN1), 也稱為癌蛋白18(Op18), 是一種微管失穩(wěn)蛋白, 在脊椎動物中普遍表達。STMN1 結(jié)合β-微管蛋白并調(diào)節(jié)微管蛋白的二聚化和聚合反應。這些是信號級聯(lián)反應中的關(guān)鍵過程,在細胞周期進程和細胞運動過程中控制有絲分裂紡錘體的組裝和解體(Ringhoffet al, 2009)。近來的研究表明了III 型β-Tubulin 在神經(jīng)發(fā)育和疾病中有新的作用, β-Tubulin 的突變可導致腦皮層發(fā)育畸形和神經(jīng)元遷移缺陷、干擾微管的動態(tài)和軸突的導向(Poirieret al,2010; Gumyet al, 2011)。

三倍體雌性虹鱒是利用理化手段抑制第二極體的排出制得(王太, 2010)。在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中, 全雌三倍體虹鱒具備存活率高、生長速度快、出肉率高和持續(xù)生長等優(yōu)勢(朱龍等, 2018)。然而, 通過人工誘導的三倍體虹鱒能否成功, 要面臨和克服的重大問題就是減數(shù)分裂, 多一套染色體會擾亂減數(shù)分裂進程的正常進行, 減數(shù)第一次分裂同源染色體聯(lián)會時, 可能會引起配對與交叉行為同時發(fā)生在三條染色體之間, 導致同源染色體聯(lián)會發(fā)生紊亂(Hollister,2015)。目前關(guān)于三倍體虹鱒性腺發(fā)育已在組織學、細胞化學、血液學、雌性激素表達(徐革鋒, 2016)、細胞自噬等方面進行研究, 關(guān)于三倍體虹鱒性腺發(fā)育減數(shù)分裂進程中微管蛋白β-tubulin 功能研究尚未見報道。前人研究表明, 三倍體雌性虹鱒在240 dpf(受精后天數(shù), days post fertilization, dpf)后, 卵母細胞成熟受阻, 當發(fā)育到300 dpf 后, 完整卵母細胞結(jié)構(gòu)幾乎不存在, 并且染色質(zhì)集中在細胞核中央或偏向一側(cè), 即出現(xiàn)破裂或壞死等敗育現(xiàn)(韓英, 2008;柳廣昊等, 2016)。本研究采用同源性基因克隆得到β-tubulin基因開放閱讀框, 檢測分析了β-tubulin基因在虹鱒卵巢中特異性表達情況, 并顯示了β-tubulin基因在不同發(fā)育階段二倍體與三倍體虹鱒卵巢組織中的表達差異情況。免疫組化方法觀察了在各發(fā)育階段, β-Tubulin 蛋白在二倍體與三倍體的卵巢組織中表達的動態(tài)變化。研究結(jié)果為探明多倍體魚類性腺發(fā)育過程中卵母細胞減數(shù)分裂受阻提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與樣品保存

本實驗用魚二倍體和三倍體雌性虹鱒取自中國水產(chǎn)科學研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗站, 其中三倍體雌性虹鱒由雌核發(fā)育獲得全雌二倍體, 通過激素誘導使其轉(zhuǎn)變成具有產(chǎn)生成熟精子能力的“偽雄魚”, 與二倍體虹鱒交配, 后利用理化方法抑制第二極體排出制得全雌三倍體。養(yǎng)殖缸中飼養(yǎng)平均水溫為(9.0±0.5) °C, 自240—330 dpf 期間, 每30 d 取樣1 次, 共采取全雌二倍體虹鱒48 尾, 全雌三倍體虹鱒36 尾。其中采取3 尾二倍體虹鱒的腎、肝、鰓、肌、腸、脾、卵巢、心、眼組織, 另取二倍體與三倍體虹鱒各6 尾的卵巢組織, 將所得組織均置于RNA 保護液中, 并放入–80 °C 冰箱保存?zhèn)溆谩Ｍ瑫r采取二倍體與三倍體虹鱒各3 尾的卵巢組織, 采取卵巢組織時, 保持其形態(tài)完好度, 即前部的扁三棱狀與后部線狀拖尾, 并展平置于4%多聚甲醛, 常溫備用。胚胎發(fā)育時期卵自受精后2 h 內(nèi), 間隔15 min 采集1 次,在受精后2—48 h, 間隔2 h 采集1 次, 48—72 h, 間隔12 h 采集1 次, 72 h 之后, 每天采集1 次, 直到出膜期,每次所采卵粒個數(shù)為15—25 粒, 將二、三倍體受精卵置于Bouin’s 液, 固定48 h 后, 將受精卵轉(zhuǎn)入75%的酒精中, 常溫備用。將受精卵的黏膜除去使胚體暴露, 易于觀察, 胚胎發(fā)育的時序以鏡檢50%個體出現(xiàn)新特征為劃分發(fā)育階段的標準, 仔稚魚階段則直接使用顯微照像的方法進行觀察。

1.2 總RNA 提取與cDNA 合成

利用Simply P Total RNA Extraction Kit 試劑盒(BioFlux, 中國)提取總RNA, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳以及紫外分光光度計檢驗RNA 的完整度, 同時使用ScanDrop 核酸分析儀(Analytik Jena, 德國)測量RNA 濃度和純度, 即吸光度值OD260/280在1.8—2.0是可接受的范圍, 可以留作備用。按照Bio RT 高靈敏cDNA 第一鏈合成試劑盒(BOER, 中國)說明書合成cDNA, 其反應體系為5 μL Hybrid mix, 0.5 μL Enzyme mix, 根據(jù)所測得的RNA 濃度添加模板量(1 pg—2 μg), 加入Nuclease-free water 補至10 μL。反應程序為37 °C, 20 min; 98 °C, 5 min。獲得的cDNA 置于–20 °C 保存。

1.3 β-tubulin 基因cDNA 克隆

在NCBI 公共數(shù)據(jù)庫中檢索到與虹鱒同源性較高的物種β-tubulin基因的序列信息, 根據(jù)比對其高度保守區(qū)域設計引物, 使用Primer 5.0 軟件設計特異性引物(表1), 引物在蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。核心片段的PCR 擴增體系為10 μL, 反應體系為5 μL 2×Taq mixture; 0.5 μL 上下游引物; 1 μL cDNA; 3.5 μL 無菌水。反應程序設置為94 °C 預變性2 min; 94 °C 變性30 s; 59 °C 退火30 s; 72 °C 延伸30 s;30 個循環(huán); 72 °C 延伸5 min。根據(jù)SMARTer?RACE 5′/3′ Kit Components 說明書的方法和步驟進行 3′UTR 和5′UTR 的RACE 擴增, PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳, 根據(jù)Biospin Gel Extraction Kit (BioFlux公司)純化目的片段, PMD18-T 載體連接, 轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細胞, LB 培養(yǎng)基(含氨芐)挑取圓形亮白色單菌落送公司完成測序。

表1 虹鱒β-tubulin 基因序列擴增引物信息Tab.1 The primers for β-tubulin amplification of O. mykiss

1.4 虹鱒β-tubulin 基因序列生物信息學分析

利用 DNAMAN 軟件拼接克隆片段, 得到β-tubulin基因完整開放閱讀框, 采用 ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進行基因開放閱讀框預測, 用Blast 在線程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)分析基因與其他物種的同源性。使用DNAMAN6.0 軟件對序列進行翻譯以及與其他物種同一蛋白的氨基酸序列多重比對。蛋白質(zhì)基本物理化學參數(shù)分析和結(jié)構(gòu)使用在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/)進行分析, 構(gòu)建氨基酸系統(tǒng)進化樹用MEGA 7.0 軟件的鄰接法(Neighbor-joining, NJ)發(fā)育樹構(gòu)建工具, 進行1000 次自展檢驗(bootstrap)評估進化樹分支可信度。

1.5 實時熒光定量PCR

以各時期采取的二倍體和三倍體雌性虹鱒的腎、肝、鰓、肌、腸等組織和卵巢的cDNA 作為實時熒光定量(RT-PCR)的模板, 根據(jù)已經(jīng)克隆出的虹鱒β-tubulin基因序列, 以β-actin作為內(nèi)參基因, 使用Primer 5.0 軟件設計特異性引物(表1), 在蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成。反應體系采用Roche 公司(瑞士)的SYBR Green Master 10 μL 體系, SYBR Green 5 μL, 上下游引物共0.4 μL, cDNA 模板0.5 μL, 加ddH2O 至10 μL。利用BIO-RAD CFX96 TOUCH 熒光定量儀的2–ΔΔCt法檢測β-tubulin基因在各組織以及不同時期卵巢的相對表達量。反應設置程序為95 °C,10 min; 95 °C, 10 s; 60 °C, 30 s; 共計40 個循環(huán), 熔解曲線從65 °C 上升到95 °C, 每秒增加0.5 °C。

1.6 Western blot

將采取的二倍體和三倍體雌性虹鱒各時期卵巢組織剪切成細小碎塊并勻漿, 按照每100 mg 組織加入1 mL RIPA 裂解液(Beyotime, 中國)和10 μL PMSF(Beyotime, 中國), 在冰上使其充分裂解。12 000 r/min離心5 min 后, 取上清放入新的EP 管。按照1︰5 比例加入蛋白上樣緩沖液, 煮沸10 min, 即獲得各時期卵巢蛋白, 保存于–20 °C 待用。將各時期蛋白樣品進行SDS-PAGE 凝膠電泳, 根據(jù)蛋白Marker, 切下含有目的條帶的下層分離膠, 采用 PVDF 膜進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜時需定流I= 200 mA, 時間為50 min。然后在5%的脫脂乳中封閉2 h。用 PBST 洗膜, 共3 次, 每次10 min。以 β-Tubulin 的抗兔多克隆抗體為一抗(Immunoway, 美國), 按1︰1 000 比例稀釋在4 °C 過夜孵育, 之后用PBST 洗膜三次。使用辣根過氧化物酶標記的(HRP)二抗(抗兔IgG) (Immunoway, 美國)用孵育液1︰1 000 倍稀釋, 37 °C 孵育2 h, 之后利用PBST 洗膜三次。使用1 mL ECL 超敏發(fā)光液(500 μL A+500 μL B)滴到膜上進行顯影, 利用化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD 公司)進行曝光和拍照。

1.7 利用免疫組織化學方法進行切片觀察

采取各時期二倍體與三倍體雌性虹鱒卵巢組織,置于4%多聚甲醛中固定48 h, 然后從50%、70%、80%、85%、90%、95%和100%的乙醇依次進行梯度脫水, 二甲苯透明, 置于硬軟蠟中包埋后, 以5 μm 厚度切片制成石蠟切片, 后進行脫蠟, 在室溫環(huán)境下,將切片避光浸入3%過氧化氫(蒸餾水稀釋) 10 min,以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶, 使用EDTA 溶液進行抗原修復, 在85 °C 下浸泡2 min, 在60 °C 下浸泡4 min。以β-Tubulin 抗兔多克隆抗體為一抗(Immunoway, 美國), 按1︰200 比例稀釋在4 °C 過夜孵育, 后用酶標山羊抗兔IgG 聚合物(中杉金橋公司)為二抗進行孵育,DAB 顯色, 蘇木素復染, 最后用中性樹膠封片, 使用OLYMPUS CX41 的正置光學顯微鏡在物鏡40×和目鏡10×鏡頭下觀察, 利用IC Capture 2.2 軟件獲取圖片。

1.8 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

使用 SPSS 17 軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和Duncan 檢驗進行數(shù)據(jù)處理, 利用Origin 2017 軟件對統(tǒng)計結(jié)果進行作圖,P<0.01 表示具有極顯著差異性,P<0.05 表示具有顯著差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 虹鱒β-tubulin 序列分析與多序列比對

本研究通過克隆得到虹鱒β-tubulin基因開放閱讀框1 533 bp, GenBank 登錄號: MN931398, 編碼424個氨基酸。通過對其編碼的蛋白質(zhì)進行分析, 虹鱒β-Tubulin 蛋白質(zhì)的相對分子量為47.5 kDa, 理論等電點值為4.73, 不穩(wěn)定指數(shù)為38.85, 此蛋白為不穩(wěn)定蛋白。利用ExPASy 在線分析工具, 預測結(jié)果顯示該基因無信號肽, 無跨膜螺旋區(qū), 對虹鱒β-tubulin基因的磷酸化位點進行預測, 結(jié)果表明, 含有絲氨酸(Ser)磷酸化位點 18 個[CK??(24)unsp(47/74/114/123/137/152/264/301/317/361/392/399)、cdc2(144/275)、PKC(167)、DNAPK(257)、PKA(350)], 蘇氨酸(Thr)磷酸化位點18 個 [PKC(32/148/165/193/217/291/345) 、 unsp(34/253/388) 、 cdc2(142/) 、 CK?(378) 、 CK??(175/178/408) 、 PKG(197) 、 p38MAPK(198) 、DNAPK(269)], 絡氨酸磷酸化位點10 個[unsp(58/105/158/201/289/404)、INSR(49/50/162)、EGFR(401)], 其中Ser-301 的得分最高為0.998。

利用BLAST 在線分析軟件對虹鱒β-Tubulin 氨基酸與其他物種β-Tubulin 氨基酸進行同源性比對, 在硬骨魚類中, 虹鱒與銀大馬哈魚(Oncorhynchus kisutch)同源最高, 為 94.37%, 與銀鯽(Carassius auratus)、鯉魚(Cyprinus carpio)、斑馬魚(Danio rerio)相比分別為87.11%、93.22%、92.07%。與哺乳動物和兩棲動物相比, 與雞(Gallus gallus)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)的同源性分別為93.01%、65.05%、61.18%, 與爪蟾(Xenopus tropicalis)的同源性為92.99% (圖1)。

圖1 虹鱒β-Tubulin 氨基酸序列比對Fig.1 Multiple alignments of β-Tubulin amino acid sequences of O. mykiss with other species

2.2 β-Tubulin 系統(tǒng)進化樹分析

為了分析β-tubulin基因在不同物種間的進化關(guān)系, 利用與上述同種方法對15 個物種的氨基酸序列進行進化分析。系統(tǒng)進化樹結(jié)果顯示: 虹鱒β-Tubulin氨基酸序列與其他鮭科魚類比對單獨為一支, 與大西洋鮭(Salmo salar)及大鱗大麻哈魚(Oncorhynchus tshawytscha)的親緣關(guān)系最近, 其次為硬骨魚類與哺乳類基本分為兩支, 其中與雞的親緣關(guān)系最遠, 其他魚類親緣關(guān)系介于兩者之間(圖2)。

圖2 β-Tubulin 氨基酸序列NJ 系統(tǒng)進化樹Fig.2 The neighbor-joining phylogenetic tree for amino acid sequences of β-Tubulin

2.3 虹鱒β-tubulin 基因在mRNA 水平的表達模式

β-tubulin基因在二倍體、三倍體雌性虹鱒在胚胎發(fā)育時期的相對表達量調(diào)查結(jié)果顯示, 從受精卵到桑葚期, 呈先上升后下降的趨勢。2 細胞期的表達量最高, 是受精卵、8 細胞期、16 細胞期和桑葚期的28.4、7.2、7.9 和9.5 倍。值得注意的是, 2 細胞期與8 細胞期的表達量沒有顯著差異(P>0.05), 與16 細胞期、桑葚期、原腸胚期和尾芽期有顯著性差異(P<0.05),在75%外包期之后,β-tubulin基因的表達量又開始上升, 尾芽期的表達量是75%外包期的86.1 倍, 在尾芽期后期出現(xiàn)下降趨勢, 然而差異并不顯著(P>0.05)。與二倍體虹鱒相比, 三倍體虹鱒在受精卵到2 細胞期有相同的上升趨勢且有顯著性差異(P<0.05), 同樣在2 細胞期表達量最高, 是受精卵、8 細胞期、16 細胞期和桑葚期的2.6、4.1、6.2 和6.1 倍, 在2 細胞期后,呈現(xiàn)顯著的下降趨勢, 并且相對表達量較少。在2 細胞期與8 細胞期和16 細胞期表達量有顯著性差異(P<0.05), 與二倍體虹鱒不同, 2 細胞期與桑葚期的表達量無顯著性差異(P>0.05), 在桑葚期之后的發(fā)育時期, 相對表達量無顯著性差異(P>0.05)。同一發(fā)育時期,β-tubulin基因在二倍體虹鱒的表達量均高于三倍體虹鱒, 在受精卵期到桑葚期均有顯著性差異(P<0.05), 然而在2 細胞期, 二倍體和三倍體虹鱒無顯著性差異(P>0.05), 在尾芽期之后的發(fā)育階段, 二倍體與三倍體虹鱒之間均無顯著性差異(P>0.05) (圖3c)。

從實時定量的結(jié)果中可以得出,β-tubulin基因在二倍體雌性虹鱒的鰭、腎、肝、脾、肌、鰓、心、眼、腸、卵巢等10 個組織中均有表達。卵巢組織與其他各組織的表達量相比有極顯著差異(P<0.01), 且β-tubulin基因在卵巢組織中的表達高于其他各組織。在其他各組織之間如腎、肝、脾、肌肉、鰓、眼、腸、鰭之間相對表達量差異不顯著(P>0.05), 但在眼中的表達, 與其他組織有顯著性差異(P<0.05) (圖3a)。

圖3 虹鱒β-tubulin 基因?qū)崟r定量表達情況Fig.3 Real-time quantitative expression of β-tubulin genes of O. mykiss

通過分析β-tubulin基因在二倍體、三倍體雌性虹鱒成魚卵巢組織中不同發(fā)育階段的相對表達量,可得出以下結(jié)論, 在240—330 dpf 發(fā)育階段, 表達量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 270 dpf 表達量最高, 是240、300 和330 dpf 的1.2、2.2 和2.8 倍。270 與240 dpf 表達量有顯著性差異(P<0.05), 與后期表達量之間差異并不顯著(P>0.05)。三倍體虹鱒在240—330 dpf 發(fā)育階段, 總體趨勢與二倍體虹鱒卵巢相對表達量相同, 在240—270 dpf 階段,β-tubulin基因的相對表達量顯著的上升, 在270 dpf 表達量最高, 且240與270 dpf 存在極顯著差異(P<0.01), 在270 dpf 發(fā)育階段后, 呈現(xiàn)下降趨勢, 然而270—330 dpf 之間差異不顯著(P>0.05)。總體而言,β-tubulin基因在同一發(fā)育階段中, 二倍體虹鱒較三倍體虹鱒表達量相對較高,且在240—270 dpf 階段差異顯著(P<0.01), 在270 dpf之后, 二、三倍體虹鱒表達量之間差異并不顯著(P>0.05) (圖3b)。

2.4 二倍體與三倍體虹鱒卵巢組織學觀察結(jié)果分析

在240—330 dpf 階段, 虹鱒卵巢發(fā)育時期處于Ⅱ期(韓英, 2008)。β-Tubulin 蛋白在240—330 dpf 發(fā)育階段, β-Tubulin 蛋白有先升高后降低的表達趨勢, 在270 dpf 發(fā)育階段表達量達到最高, 然而二倍體和三倍體無顯著性差異(P>0.05)。在其他各時期, 二倍體、三倍體虹鱒均有顯著性差異(P<0.05)(圖4)。微管蛋白β-Tubulin 在卵巢組織中的表達和定位分析結(jié)果如下,對于二倍體雌性虹鱒卵巢在240 dpf, 陽性信號主要集中在細胞質(zhì)(圖5A, a), 在270 dpf 時, 在胞質(zhì)的信號減弱, 在核內(nèi)集中且此時信號最強(圖5A, b), 在300 dpf 時期, 核內(nèi)信號持續(xù)增強, 胞質(zhì)信號明顯減弱(圖5A, c), 而330 dpf 時, 核內(nèi)與胞質(zhì)中信號減弱(圖5A, d)。與二倍體雌性虹鱒相比, 三倍體虹鱒卵巢在240—330 dpf 階段, 在卵原細胞中在細胞核的表達信號呈現(xiàn)先增強后減弱的趨勢, 在270 dpf 發(fā)育階段,卵原細胞核上信號最強。信號在其他時期卵原細胞核與胞質(zhì)較弱, 在卵原細胞簇間隙的濾泡細胞存在較強信號(圖5B)。

圖4 β-Tubulin 蛋白在虹鱒二倍體與三倍體卵巢組織中不同發(fā)育時期表達情況Fig.4 β-Tubulin protein expression in different developmental stages in the diploid and triploid ovarian tissues of rainbow trout

圖5 β-Tubulin 蛋白在虹鱒二倍體與三倍體卵巢組織中不同發(fā)育時期表達分布狀況Fig.5 Distribution of β-Tubulin protein in different gonadal stages of diploid and triploid female rainbow trout

3 討論

本文以三倍體虹鱒減數(shù)分裂的發(fā)生進程中微管作用角度切入進行研究, 由于減數(shù)分裂確保了基因組的穩(wěn)定性, 并在所有有性的二倍體生物中創(chuàng)造了遺傳多樣性, 多倍體物種被認為是非常難以完成正常的減數(shù)分裂和減數(shù)分裂重組, 因為它們有超過2 對基因組。在單性脊椎動物多倍體, 存在幾種減數(shù)分裂出現(xiàn)偏差情況, 包括卵原細胞融合, 減數(shù)分裂前的內(nèi)復制(Neaveset al, 2011), 無融合生殖或無絲分裂, 使得獲得不育卵(Monacoet al, 1984)。并且雌核發(fā)育和孤雌生殖被證明是可以繁殖可育子代, 其包含母本的所有染色體基因組, 因此是母本的克隆。在目前的研究中已觀察到正常減數(shù)分裂完整模型, 而且也發(fā)現(xiàn)六倍體克隆單性和有性生殖模式的各種精子應答機制, 表明減數(shù)分裂完成與精子不同應答反應導致多種單性雌核發(fā)育模式和有性生殖(Zhanget al,2015)。事實上, 在不同基因組倍性水平的綠蟾蜍(Bufoviridis 亞群)和水蛙(Pelophylax esculentus)中也觀察到正常的減數(shù)分裂和有性生殖(Christiansenet al,2009; St?cket al, 2010)。同時, 還發(fā)現(xiàn)有性生殖的全三倍體蟾蜍同時發(fā)生孟德爾遺傳和無性基因組傳遞。此外, 兩個對稱的異源四倍體群體在經(jīng)歷了非有性生殖的中間過程后恢復了正常的減數(shù)分裂, 從而導致由二倍體雜交種、三倍體和四倍體組成的小型鯉科魚(Squalius alburnoides)中形成了一個新的有性生殖多倍體(Cunhaet al, 2008)。在由二倍體、三倍體和四倍體的泥鰍復合體中, 也發(fā)現(xiàn)了一些克隆的二倍體系可以通過孤雌生殖來繁殖, 這種多倍體泥鰍雜種可以通過減數(shù)分裂前的內(nèi)復制機制產(chǎn)生未減數(shù)的二倍體卵。與目前分析的異育銀鯽(Carassius gibelio)相似, 以上所有的多倍體譜系都是異源多倍體, 這意味著在這些多倍體動物中可能發(fā)生了類似的進化方式(Araiet al, 2013)。減數(shù)分裂的完成進一步發(fā)展并主要達到有性生殖和單性生殖等多種生殖方式?；蚪M復制植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)最近的一項發(fā)現(xiàn)表明, 適應減數(shù)分裂是成功形成多倍體的必要步驟。因此, 減數(shù)分裂的完成對多倍體脊椎動物的生殖成功和進化潛力具有重要意義(Yantet al, 2013)。

微管是包括紡錘體組裝、線粒體分布、減數(shù)分裂成熟、合配和早期胚胎發(fā)育在內(nèi)的一系列事件所必需(Serraet al, 2018)。其中β-Tubulin 微管蛋白參與各種細胞過程, 包括減數(shù)分裂, 形態(tài)發(fā)生以及纖毛和鞭毛的運動。在發(fā)生減數(shù)分裂時微管蛋白形成二聚體, 向紡錘體和極體聚集, 進而組成紡錘體(張林等, 2014)。一般認為, 進入分裂期時, 胞質(zhì)微管解聚, 重新組裝形成紡錘體微管, 負責細胞中染色體排列、同源染色體與姐妹染色單體分離和極體排放; 分裂結(jié)束后, 紡錘體微管解聚, 重新組裝形成胞質(zhì)微管星體, 胞質(zhì)微管星體在原核遷移和維持細胞亞群中起著至關(guān)重要的作用(Moriet al, 2011)。魚類卵母細胞在減數(shù)分裂的前期I 阻滯, 然后在排卵前恢復減數(shù)分裂, 并在MII 再次停滯(Choiet al, 2017)。研究發(fā)現(xiàn)早期卵母細胞正常進行減數(shù)分裂是促進馴化斑馬魚卵巢發(fā)育的關(guān)鍵生殖細胞階段。若mps1、tdrd1、vasa等基因突變, 會引起卵母細胞減數(shù)分裂異?；蛟缙谏臣毎麃G失。并且雌激素對雌性虹鱒的發(fā)育起重要作用, 激活雌激素通路能抑制卵母細胞凋亡的發(fā)生(Campbellet al, 2015)。

本研究克隆得到了虹鱒微管β-tubulin基因開放閱讀框, 預測編碼蛋白分析發(fā)現(xiàn)不存在信號肽, 且無跨膜螺旋區(qū)。在細胞周期的調(diào)控中, 蛋白磷酸化和去磷酸化發(fā)揮重要作用,β-tubulin基因可能存在的磷酸位點可知, 絲氨酸得分最高。隨著脊椎動物微管蛋白由多個基因編碼的發(fā)現(xiàn), 提出了關(guān)于不同的微管蛋白基因產(chǎn)物對微管功能多樣性的貢獻問題。迄今為止已經(jīng)在哺乳動物和鳥類中鑒定出六種微管蛋白同型。兩棲動物和魚類中的微管蛋白同種型的cDNA 庫與功能驗證的研究較少。β-Tubulin 在組織分布中研究可知, II 型β-Tubulin 主要在腦中, 在其他體細胞組織中仍處于較低水平。III 型β-Tubulin 在嚙齒動物的腦和睪丸中有高水平表達, 例如豬精子鞭毛的細胞骨架(Ludue?a, 1997; Pěknicováet al, 2001), β-Tubulin 存在于人腫瘤亞群中, 但不存在于正常分化的神經(jīng)膠質(zhì)、體細胞或上皮細胞中(Katsetoset al, 2003)。在本實驗實時定量結(jié)果證實,β-tubulin基因在卵巢中有特異性高表達, 且與其他組織有顯著性差異。微管β-tubulin基因在虹鱒胚胎發(fā)育時期, 2 細胞期二倍體虹鱒顯著高于其他各時期, 在2 細胞期后呈現(xiàn)無差異顯著性低表達, 三倍體虹鱒一直呈現(xiàn)低表達狀態(tài)。虹鱒紡錘體因子Spindlin基因在胚胎發(fā)育階段, 二倍體虹鱒在受精期表達顯著高于三倍體虹鱒, 且三倍體虹鱒同樣呈現(xiàn)低表達狀態(tài)(史秀蘭等, 2021)。推測三倍體虹鱒β-tubulin和Spindlin基因低表達如何影響減數(shù)分裂及早期胚胎發(fā)育還未有定論。研究表明, 微管異常是由衰老、體外成熟、化學暴露和突變引起的。秋水仙堿等藥物會造成微管異常, 進而影響卵母細胞減數(shù)分裂成熟過程(Zhanget al, 2017)。在魚類三倍化過程中, 是否打破了微管形成的動態(tài)平衡, 從而造成微管異常還需進一步研究。在 240—330 dpf,β-tubulin基因在三倍體虹鱒中的表達顯著低于二倍體虹鱒。由于三倍體虹鱒存在第三套染色體, 在同源染色體聯(lián)會階段發(fā)生紊亂, 使得減數(shù)分裂不能正常進行, 卵母細胞成熟受阻, 推測與三倍體虹鱒的β-tubulin基因低表達有關(guān)。在黃天晴(2017)的研究中發(fā)現(xiàn),β-tubulin基因在此發(fā)育階段與腫瘤抑制基因p53(Tumor suppressor gene,p53)在二倍體、三倍體虹鱒卵巢組織的表達量變化趨勢一致,p53對調(diào)控細胞自噬的機制有重要作用,p53的靶基因是 DRAM(Damage-regulated autophagy modulator), 其編碼的溶酶體蛋白能夠誘導細胞自噬, 是p53誘導細胞凋亡的效應器,p53通過DRAM 途徑來調(diào)節(jié)細胞自噬, 由此引起細胞凋亡(黃天晴, 2017)。紡錘體是一個動態(tài)的微管結(jié)構(gòu), 對于正常體細胞, 有絲分裂染色體錯誤分離可能引起腫瘤, 對于生殖細胞, 減數(shù)分裂染色體的分離異常, 引起不育(Marlow, 2018)。然而β-Tubulin微管蛋白與腫瘤發(fā)生和細胞自噬調(diào)節(jié)機制關(guān)系, 與三倍體虹鱒性腺敗育的關(guān)聯(lián)還需進一步探討。

在三倍體虹鱒在300 dpf 以后發(fā)育階段,β-tubulin基因表達有上升趨勢, 在前期的研究中表明, 由于發(fā)生性腺敗育而形成的卵原細胞簇, 進行再分化形成類生精細胞囊, 此時與卵原細胞簇并存, 且類生精細胞囊成為性腺結(jié)構(gòu)的主要組成成分, 卵巢呈現(xiàn)類雄性化, 無法排出精子, 最終會出現(xiàn)大量敗育的精子細胞(韓英等, 2010), 推測為上升的主要原因。虹鱒卵母細胞內(nèi)的骨架結(jié)構(gòu), β-Tubulin 蛋白主要集中于卵細胞細胞質(zhì)及濾泡細胞和支持細胞中, 研究表明, 在240—330 dpf 發(fā)育階段, 二倍體虹鱒卵巢發(fā)育時期處于Ⅱ期, β-Tubulin 蛋白呈現(xiàn)與Spin 較一致的變化趨勢, 這證實了β-Tubulin 微管蛋白在減數(shù)分裂期間,微管集中分布在紡錘體組裝區(qū)域, 這與哺乳動物卵母細胞成熟中微管的分布模式基本一致, 生發(fā)泡期在細胞質(zhì)中分布均勻, 發(fā)生生發(fā)泡破裂后, 迅速向卵母細胞皮層集中; 減數(shù)分裂紡錘體和極體形成時, 微管向紡錘體和極體聚集, 推測這可能與維持紡錘體和中心體位于細胞周邊位置有關(guān)。

4 結(jié)論

本文研究了微管β-tubulin基因在二倍體與三倍體虹鱒胚胎與240—330 dpf 時期在卵巢中的表達與定位情況, 結(jié)果表明三倍體虹鱒中β-Tubulin 微管蛋白的異常表達可能是導致性腺敗育的原因之一, 研究結(jié)果為探明多倍體魚類性腺發(fā)育過程中卵母細胞減數(shù)分裂受阻提供基礎(chǔ)理論。