病毒性反復(fù)呼吸道感染患者Toll樣受體、D?二聚體及分泌型免疫球蛋白A/白蛋白的表達(dá)及預(yù)后意義

巴提曼·克烈斯 買爾巴提·哈德爾

新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥中心呼吸功能檢查室（烏魯木齊830001）

反復(fù)呼吸道感染（repeated respiratory infections，RRTIs）是常見的呼吸系統(tǒng)疾病，多由病毒或細(xì)菌等病原微生物感染引起［1］。臨床常采用降鈣素原（procalcitonin，PCT）、C反應(yīng)蛋白（C?reactive protein，CRP）等作為感染的輔助診斷和鑒別，雖有較高的靈敏度，然特異性較低，通常需要結(jié)合其他的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確的鑒別［2］。Toll 樣受體（Toll?like receptor，TLR）可快速激活機(jī)體天然免疫系統(tǒng)，屬于天然免疫受體，機(jī)體的獲得性免疫系統(tǒng)對(duì)病原菌的識(shí)別依賴于病原體相關(guān)分子模式（pathogen?related molecular patterns，PAMP），后者刺激機(jī)體分泌多種細(xì)胞因子，誘發(fā)獲得性免疫［3］。TLR2、TLR9是TLR家族的重要成員，對(duì)病原菌有特異性的識(shí)別能力。有研究［4］指出，肺部感染可影響機(jī)體凝血系統(tǒng)功能，血漿D?二聚體（D?dimer，D?D）水平異常升高，但其在RRTIs 患者中的研究并不多見。RRTIs與呼吸系統(tǒng)黏膜免疫功能紊亂有關(guān)，分泌型免疫球蛋白A（secreted immunoglobulin A，sIgA）/白蛋白（albumin，ALB）可直接反映呼吸道黏膜免疫功能，且在不同疾病時(shí)期sIgA/ALB 表達(dá)差別較大［5］。本研究以由病毒感染引起的RRTIs 患者為研究對(duì)象，探討TLR、血漿D?二聚體及唾液中sIgA/ALB 在病毒性RRTIs 患者中的表達(dá)情況，并分析其表達(dá)水平與患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2017年9月至2020年2月在我院住院且有明確診斷的75 例病毒性RRTIs 患者作為病例組，根據(jù)病情嚴(yán)重程度將其分為輕、中、重3 組，分別為25 例，30 例，20 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《內(nèi)科學(xué)》（第8 版）［6］中RRTIs 診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查明確為病毒性感染者；年齡1 ～ 12 歲者；患者家屬簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：顱內(nèi)感染者；入院時(shí)已經(jīng)發(fā)生驚厥者；入組前1 個(gè)月內(nèi)使用免疫增強(qiáng)劑者；先天性臟器功能障礙者；伴有凝血功能障礙或其他血液系統(tǒng)疾病者；營(yíng)養(yǎng)不良者等。另選取同期在我院體檢的健康兒童30 例作為對(duì)照組。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：2017024）。

1.2 方法TLR 檢測(cè)［7］：入院時(shí)抽取受試者靜脈血約1 mL 與枸櫞酸鈉抗凝管中，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)外周血TLR2、TLR9 表達(dá)水平（試劑盒均購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：ml057760 和ml057770，原產(chǎn)地：中國(guó)）。

血漿D?二聚體水平檢測(cè)［8］：抽取受試者靜脈血3 mL于枸櫞酸鈉抗凝管中，混勻，離心（3 000 r/min，10 min），吸取血漿備用。采用全自動(dòng)血凝分析儀（美國(guó)Beckman Coulter 公司，型號(hào)：ACLTOP 300CTS）以免疫比濁法檢測(cè)血漿D?二聚體水平（STA?Liatest D?Di 試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：JK3086，原產(chǎn)地：法國(guó)），以含有乳膠顆粒的懸濁液的吸光度反應(yīng)待檢樣本中D?二聚體水平。

唾液中sIgA/ALB 檢測(cè)［9］：讓受試者反復(fù)漱口后，使用一次性注射器抽取口腔唾液約5 mL 于試管中，離心（3 000 r/min，10 min），取上清于EP 管中備用。采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher公司，型號(hào)：Multiskan FC，原產(chǎn)地：美國(guó)）以ELISA（試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：ml10580，原產(chǎn)地：中國(guó)）檢測(cè)唾液中sIgA 水平。采用ELISA檢測(cè)ALB 水平（試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司，貨號(hào)：ml059979，原產(chǎn)地：中國(guó)）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，三組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK 法（q檢驗(yàn)），檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較病例組和對(duì)照組性別、年齡等比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），75 例病例組中輕、中、重3 組患者性別、年齡、病程等基礎(chǔ)資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05），組間可進(jìn)行對(duì)比，見表1-2。

表1 病例組和對(duì)照組一般資料比較Tab.1 Comparison of general information between the case group and the control group ±s

表1 病例組和對(duì)照組一般資料比較Tab.1 Comparison of general information between the case group and the control group ±s

性別（例）男女年齡（歲）BMI（kg/m2）病例組（n=75）34 41 8.76±1.96 23.02±1.94對(duì)照組（n=30）18 12 8.60±2.39 23.40±1.52 χ2/t 值1.844 0.325 1.067 P 值0.174 0.746 0.289

表2 病例組中輕、中、重3 組患者一般資料比較Tab.2 Comparison of general data of patients in the 3 groups of mild，moderate and severe group ±s

表2 病例組中輕、中、重3 組患者一般資料比較Tab.2 Comparison of general data of patients in the 3 groups of mild，moderate and severe group ±s

性別（例）男 女年齡（歲）病程（d）體溫（℃）輕度組（n=25）12 13 8.86±2.03 8.78±2.39 39.16±1.18中度組（n=30）13 17 9.06±1.79 9.29±2.20 39.04±1.02重度組（n=20）9 11 8.61±2.58 10.02±2.37 39.25±0.98 χ2/F 值0.121 0.526 1.604 0.242 P 值0.941 0.621 0.208 0.786

2.2 病例組和對(duì)照組TLR2、TLR9、D?D 及sIgA/ALB表達(dá)情況比較病例組患者外周血TLR2、TLR9及血漿D?二聚體水平均明顯高于對(duì)照組，唾液中sIgA/ALB 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組（P< 0.001），見表3。

表3 病例組和對(duì)照組TLR2、TLR9、D?二聚體及sIgA/ALB 表達(dá)情況比較Tab.3 Comparison of the expression of TLR2，TLR9，D?D and sIgA/ALB between the case group and the control group±s

表3 病例組和對(duì)照組TLR2、TLR9、D?二聚體及sIgA/ALB 表達(dá)情況比較Tab.3 Comparison of the expression of TLR2，TLR9，D?D and sIgA/ALB between the case group and the control group±s

組別病例組對(duì)照組t 值P 值例數(shù)75 30 TLR2（ng/mL）3.83±1.14 2.66±0.85 5.757<0.001 TLR9（ng/mL）6.31±1.50 5.13±1.14 4.363<0.001 D?二聚體（mg/L）0.56±0.36 0.34±0.11 4.791<0.001 sIgA/ALB（×10-3）4.45±0.71 6.89±1.18 10.568<0.001

2.3 輕、中、重3 組患者TLR2、TLR9、D?D 及sIgA/ALB表達(dá)情況比較輕、中、重3組患者外周血TLR2、TLR9 及血漿D?二聚體水平均呈逐漸升高趨勢(shì)，唾液中sIgA/ALB 表達(dá)水平呈逐漸降低趨勢(shì)，且3 組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001），見表4。

表4 輕、中、重3 組患者TLR2、TLR9、D?二聚體及sIgA/ALB 表達(dá)情況比較Tab.4 Comparison of the expression of TLR2，TLR9，D?D and sIgA/ALB between the 3 groups of mild，moderate andsevere group ±s

表4 輕、中、重3 組患者TLR2、TLR9、D?二聚體及sIgA/ALB 表達(dá)情況比較Tab.4 Comparison of the expression of TLR2，TLR9，D?D and sIgA/ALB between the 3 groups of mild，moderate andsevere group ±s

組別輕度組中度組重度組F 值P 值例數(shù)25 30 20 TLR2（ng/mL）3.28±0.94 3.82±1.03 4.53±1.17 8.017<0.001 TLR9（ng/mL）5.66±1.02 6.33±1.10 7.10±1.21 9.445<0.001 D?二聚體（mg/L）0.49±0.10 0.55±0.12 0.66±0.14 11.376<0.001 sIgA/ALB（×10-3）5.23±1.10 4.33±1.21 3.66±0.96 11.375<0.001

2.4 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組患者TLR2、TLR9、D?D 及sIgA/ALB 表達(dá)情況比較依據(jù)《內(nèi)科學(xué)》（第8 版）［6］中患者預(yù)后的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)，將病例組患者分為預(yù)后良好組（治療后癥狀明顯改善，且1 個(gè)月內(nèi)未復(fù)發(fā)）和預(yù)后不良組（出現(xiàn)呼吸衰竭癥狀）［6］，其中預(yù)后良好者66 例，預(yù)后不良者9 例，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，預(yù)后良好組患者外周血TLR2、TLR9 及血漿D?二聚體水平均明顯低于預(yù)后不良組，唾液中sIgA/ALB 表達(dá)水平明顯高于預(yù)后不良組（P<0.01），見表5。

表5 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組TLR2、TLR9、D?二聚體及sIgA/ALB 表達(dá)情況比較Tab.5 Comparison of the expression of TLR2，TLR9，D?D and sIgA/ALB between the good prognosis group andthe poor prognosis group ±s

表5 預(yù)后良好組和預(yù)后不良組TLR2、TLR9、D?二聚體及sIgA/ALB 表達(dá)情況比較Tab.5 Comparison of the expression of TLR2，TLR9，D?D and sIgA/ALB between the good prognosis group andthe poor prognosis group ±s

組別預(yù)后良好組預(yù)后不良組t 值P 值例數(shù)66 9 TLR2（ng/mL）3.65±0.97 5.16±1.10 3.911<0.001 TLR9（ng/mL）5.95±1.13 8.95±1.85 4.729<0.001 D?二聚體（mg/L）0.52±0.10 0.85±0.29 3.369 0.001 sIgA/ALB（×10-3）4.63±1.40 3.13±1.17 3.526<0.001

3 討論

天然免疫系統(tǒng)通過(guò)PAMP 刺激機(jī)體分泌多種細(xì)胞因子，進(jìn)而誘發(fā)獲得性免疫，天然免疫系統(tǒng)可以通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）識(shí)別PAMP，進(jìn)而識(shí)別侵入到機(jī)體的病原體，TLR2、TLR9等均是重要的PRR。研究［10］顯示，TLR2中和性單抗可下調(diào)人單核細(xì)胞可溶性CD14 mRNA的表達(dá)，促進(jìn)致炎因子如白介素類及TNF?α等的釋放，引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)。研究指出TLR2 在顱內(nèi)感染［11］、新生兒敗血癥［12］等感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色。TLR9 是主要表達(dá)于細(xì)胞膜的一種膜結(jié)合受體，可介導(dǎo)并激活固有免疫系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體獲得性免疫，其在調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為方面有重要作用［13-14］，也有研究［15］顯示，TLR9 可參與多種呼吸系統(tǒng)感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展。本研究中，病例組患者外周血TLR2、TLR9 水平均明顯高于對(duì)照組，且輕、中、重3 組患者外周血TLR2、TLR9 水平均呈逐漸升高趨勢(shì)，提示TLR2、TLR9 可能參與了病毒性RRTIs 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，且其表達(dá)水平與病情嚴(yán)重程度有密切關(guān)系，病情越嚴(yán)重，外周血TLR2、TLR9 表達(dá)水平越高，這一研究結(jié)果與GOWIN 等［16］報(bào)道結(jié)果相似，其研究也認(rèn)為TLR2、TLR9 的表達(dá)與呼吸系統(tǒng)感染性疾病的發(fā)生有一定關(guān)系，并認(rèn)為其可預(yù)測(cè)疾病病情嚴(yán)重程度。隨后本研究對(duì)比了不同預(yù)后的兩組患者外周血TLR2、TLR9 表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好組患者外周血TLR2、TLR9 水平均明顯低于預(yù)后不良組，該結(jié)果提示外周血TLR2、TLR9表達(dá)水平不僅可預(yù)測(cè)病毒性RRTIs 病情的嚴(yán)重程度，還可評(píng)估患者預(yù)后情況，這與HOTZ 等［17］研究結(jié)果基本一致。

呼吸系統(tǒng)感染性疾病本就屬于炎癥反應(yīng)性疾病，加之機(jī)體受缺氧等因素的影響，可不同程度地?fù)p害機(jī)體血管內(nèi)皮功能，大量組織因子生成，激活凝血系統(tǒng)，機(jī)體處于高凝狀態(tài)，繼發(fā)纖溶亢進(jìn)，嚴(yán)重者可導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血，危及患者生命［18］。血漿D?二聚體水平已成為近些年臨床感染性疾病的重要篩查指標(biāo)之一，D?二聚體是纖溶酶降解交聯(lián)蛋白后生成的產(chǎn)物，其水平越高，提示機(jī)體纖維活性越強(qiáng)，故D?二聚體的高水平可反映機(jī)體高凝狀態(tài)和繼發(fā)纖溶亢進(jìn)［19］。BOUDEWIJNS 等［20］研究指出，D?二聚體水平檢測(cè)可用于肺部感染性疾病的初步診斷，本研究亦有相似的研究結(jié)果，病例組患者血漿D?二聚體水平均明顯高于對(duì)照組，且輕、中、重3 組患者血漿D?二聚體水平均呈逐漸升高趨勢(shì)，提示病毒性RRTIs 的發(fā)生可使機(jī)體處于高凝狀態(tài)，且根據(jù)血漿D?二聚體水平可預(yù)測(cè)病毒性RRTIs 的病情嚴(yán)重程度有密切關(guān)系，V?GELI 等［21］研究也指出，呼吸系統(tǒng)感染性疾病患者血漿D?二聚體水平較正常人群明顯升高，本研究與之結(jié)果相似。隨后本研究對(duì)比了不同預(yù)后的兩組患者血漿D?二聚體水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好組患者血漿D?二聚體水平明顯低于預(yù)后不良組，說(shuō)明隨著病毒性RRTIs 疾病的有效控制，血漿D?二聚體水平亦逐漸下降，這與LIU 等［22］報(bào)道究結(jié)果一致。

支氣管黏膜免疫功能異常是RRTIs 的主要原因之一，sIgA 是機(jī)體黏膜免疫系統(tǒng)的重要抗體，若選擇性sIgA 不足，可導(dǎo)致機(jī)體循環(huán)免疫復(fù)合物水平異常增高，進(jìn)而增加呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)感染性疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［23］。唾液中sIgA 可直接反映機(jī)體黏膜免疫功能狀態(tài)，但考慮到血液IgA 漏出的因素，不宜將其作為直接檢測(cè)指標(biāo)；ALB 是重要的功能蛋白，主要用于維持血漿膠體滲透壓，故ALB 水平可反映黏膜滲透性，因此，可將唾液中sIgA 與血中ALB 水平比值作為反映機(jī)體黏膜免疫功能狀態(tài)的指標(biāo)，以減少血液IgA 漏出引起的測(cè)量誤差［24］。本研究與之也有部分相似，病例組患者唾液中sIgA/ALB 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，且輕、中、重3 組患者唾液中sIgA/ALB 表達(dá)水平呈逐漸降低趨勢(shì)，提示病毒性RRTIs 患者存在明顯的黏膜免疫功能下降，且病情越嚴(yán)重，黏膜免疫功能下降越明顯，這或許也是導(dǎo)致該疾病發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制之一，黏膜免疫功能下降，抵御外來(lái)病原微生物的能力減弱，故而易引發(fā)病毒或細(xì)菌等的感染，誘發(fā)感染性疾病的發(fā)生［25］。此外，本研究發(fā)現(xiàn)預(yù)后良好組患者唾液中sIgA/ALB 表達(dá)水平明顯高于預(yù)后不良組，提示隨著病毒性RRTIs 疾病的有效控制，機(jī)體黏膜免疫功能也逐漸恢復(fù)。

本研究首次分析了TLR、血漿D?二聚體及唾液中sIgA/ALB 表達(dá)水平與病毒性RRTIs 患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后的關(guān)系，但本研究不能明確病毒性RRTIs 患者病情嚴(yán)重程度、預(yù)后與病毒類型是否有關(guān)，這也是以后需要進(jìn)一步研究的方向。

綜上，病毒性RRTIs 患者血漿D?二聚體水平升高，黏膜免疫功能下降，且TLR2、TLR9 可能參與了疾病的發(fā)生、發(fā)展，臨床可根據(jù)上述指標(biāo)表達(dá)情況預(yù)測(cè)患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后。