青蒿琥酯調(diào)節(jié)BCL?2家族蛋白平衡誘發(fā)肌成纖維細(xì)胞凋亡

曾高淳 吳苗 曾令基 王雅文 羅瓊 賴沛龍 杜欣 翁建宇

1華南理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院（廣州510006）；2廣東省人民醫(yī)院（廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）血液內(nèi)科（廣州510080）

閉塞性細(xì)支氣管炎（bronchiolitis obliterans，BO）是異基因造血干細(xì)胞移植后的嚴(yán)重晚期并發(fā)癥，以小氣道纖維化為主要病理機(jī)制，現(xiàn)有治療方法效果不佳，患者5年病死率達(dá)50%，仍需探索新的治療策略［1-3］。

肌成纖維細(xì)胞（myofibroblasts，MFB）是纖維化的核心效應(yīng)細(xì)胞，MFB 凋亡逃逸是纖維化發(fā)生發(fā)展的重要機(jī)制，與BCL?2 家族失衡密切相關(guān)［4］，近年來研究［5］表明靶向BCL?2 失衡表達(dá)誘導(dǎo)MFB 凋亡，可逆轉(zhuǎn)已形成的皮膚纖維化，因此靶向MFB 凋亡可能是改善BO 的新治療策略。

青蒿琥酯（artesunate，ART）抑制多種器官纖維化［6］。王昌明等［7-11］證實(shí)：ART 可通過誘導(dǎo)人肺成纖維細(xì)胞（fibroblasts，F(xiàn)B）凋亡、抑制FB 分泌功能、抑制FB 向MFB 轉(zhuǎn)化，發(fā)揮抗肺纖維化作用。FB 是MFB 眾多來源之一，調(diào)控纖維化核心細(xì)胞——MFB 凋亡可能是遏制和逆轉(zhuǎn)纖維化的更高效靶點(diǎn)。ART 通過調(diào)控BCL?2 家族平衡誘導(dǎo)FB 及多種腫瘤細(xì)胞凋亡［7，12-14］，筆者前期發(fā)現(xiàn)ART 可以減輕小鼠BO 病理損傷［15］，但其對(duì)MFB 的作用及機(jī)制鮮有報(bào)道。本研究就ART 能否直接誘導(dǎo)MFB 細(xì)胞凋亡及其可能的相關(guān)機(jī)制展開研究和探索，以期為ART 治療BO 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞來源正常人胚肺成纖維細(xì)胞系MRC?5（ATCC 公司）。

1.1.2 主要試劑α?MEM 培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清（美國Gibco 公司），TGF?β1（美國PeproTech 公司），青蒿琥酯（美國Sigma 公司），細(xì)胞增殖及毒性檢測（CCK?8）、AnnexinV?AF647/PI（上海奕杉生物公司），JC?1 線粒體膜電位熒光探針（上海翊圣生物公司），逆轉(zhuǎn)錄及RT?qPCR 試劑盒（湖南艾科瑞生物公司），兔抗人α?SMA、兔抗人GAPDH 和HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG（英國Abcam 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 構(gòu)建MFB 模型取10～12 代FB 細(xì)胞，以2× 104/孔接種于六孔板各孔中，分別加入0、2.5、5、10、20、40 ng/mL TGF?β誘導(dǎo)48 h，根據(jù)α?SMA 的表達(dá)水平選擇最佳濃度進(jìn)行MFB 模型構(gòu)建。

1.2.2 ART濃度探索CCK?8法檢測細(xì)胞活性：將FB細(xì)胞以5×103/孔接種于96孔板中，加入TGF?β誘導(dǎo)48 h，然后于各孔分別加入0、50、100、200 μmol/L ART 處理24 h，更換含10% CCK?8 的培養(yǎng)基，同時(shí)加設(shè)空白組，于培養(yǎng)箱中孵育1 h，測定450 nm 吸光度，根據(jù)半數(shù)抑制濃度（IC50）選擇ART 濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及流程（1）MFB 組：不加ART 的對(duì)照組；（2）MFB?ART組：加入100 μmol/L ART處理24 h，見圖1。每組設(shè)計(jì)3 個(gè)復(fù)孔，后續(xù)各檢測指標(biāo)均復(fù)測3 次。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Experimental procedure

1.3 檢測指標(biāo)

1.3.1 RT?qPCR檢測α?SMA及BCL?2家族基因用TRIzol 法提取MFB 組和MFB?ART 組細(xì)胞的總RNA，按照說明書合成cDNA 并構(gòu)建20 μL RT?qP?CR 反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)。引物序列見表1，以2?ΔΔCt計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.2 Western blot檢測α?SMA的蛋白表達(dá)情況提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行定量和變性，取20 μg 上樣，電泳90 min，電轉(zhuǎn)2 h，室溫封閉1 h，TBST 洗膜三次，以GAPDH 抗體作為對(duì)照，加入α?SMA 抗體于4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜三次，加入二抗于室溫下孵育1 h，TBST 洗膜三次，加入顯色液進(jìn)行曝光，使用Image J 軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算α?SMA/GAPDH 比值。

1.3.3 JC?1檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化情況（1）熒光顯微鏡觀察：細(xì)胞JC?1 染液孵育20 min，PBS清洗后，鏡下觀察。（2）酶標(biāo)儀檢測：將FB 細(xì)胞以5 × 103/孔接種于96 孔板中，加入TGF?β誘導(dǎo)48 h形成MFB 細(xì)胞，按照1.2.3 進(jìn)行分組，分別于0、24、36、48、60、72、84、96 h 進(jìn)行JC?1 染液孵育，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)陰性及陽性對(duì)照組，酶標(biāo)儀檢測綠色（波長510/529 nm）和紅色熒光（波長577/595 nm）數(shù)值，并計(jì)算最終熒光數(shù)值。

1.3.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況將FB 細(xì)胞以1×104/孔接種于24孔板中，加入TGF?β誘導(dǎo)48 h形成MFB 細(xì)胞，按照1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及流程進(jìn)行分組，消化、離心、PBS 清洗后重懸細(xì)胞，進(jìn)行Annexin V和PI雙染色，室溫避光孵育5 min，立即流式檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)結(jié)果均采用GraphPad Prism 8 作圖。

2 結(jié)果

2.1 MFB細(xì)胞模型構(gòu)建FB細(xì)胞加入TGF?β培養(yǎng)48 h 后：細(xì)胞形態(tài)與FB 組無明顯差異，細(xì)胞生長更為密集。見圖2A；α?SMA mRNA和蛋白水平均呈濃度相關(guān)性遞增，α?SMA mRNA 在TGF?β 20 ng/mL 達(dá)峰，但TGF?β 10、20、40 ng/mL 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；α?SMA 蛋白在TGF?β 10 ng/mL 達(dá)峰，但TGF?β 10、20 ng/mL 組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖2B、C。故此，本研究確定10 ng/mL TGF?β刺激FB 細(xì)胞48 h 為MFB 細(xì)胞模型的構(gòu)建體系。

圖2 MFB 模型的構(gòu)建Fig.2 Construction of the model of MFB

2.2 ART抑制MFB活性實(shí)驗(yàn)CCK?8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：ART 濃度為50、100、200 μmol/L 時(shí)，細(xì)胞活性呈濃度依賴性降低，分別為（68.33±2.31）%、（48.00 ±3.61）%、（19.33±8.02）%，且較基線和對(duì)照組明顯降低（P< 0.001），見圖3。在ART 濃度100 μmol/L 時(shí)最接近IC50，因此選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 流式檢測ART 對(duì)MFB 細(xì)胞凋亡情況的影響流式結(jié)果表明：MFB 組細(xì)胞早期凋亡（Annexin V+PI-）比例為（2.94 ± 0.28）%，晚期凋亡（Annexin V+PI+）比例為（0.51 ± 0.10）%；而MFB?ART 組分別為（13.40 ± 0.87）%和（2.12 ± 0.39）%；MFB?ART組細(xì)胞總體凋亡率（15.52 ± 1.23）%高于MFB 組（3.45±0.34）%，見圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)：ART 可促進(jìn)MFB 細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.4 JC?1 檢測ART 處理后細(xì)胞線粒體膜電位變化情況

2.4.1 熒光顯微鏡鏡下可見MFB 組細(xì)胞胞質(zhì)紅綠熒光共存，而MFB?ART 組細(xì)胞數(shù)量減少，且大部分細(xì)胞紅色熒光減弱，胞質(zhì)中僅有綠色熒光（白色箭頭所示），見圖5A。

圖3 CCK?8 檢測不同濃度ART 對(duì)MFB 細(xì)胞活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of ART on cell viability of MFB cells by cell counting kit?8 assay

圖4 ART 對(duì)MFB 細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of ART on the apoptosis of MFB cells

2.4.2 酶標(biāo)儀（1）MFB 組：細(xì)胞紅色和綠色熒光強(qiáng)度在8 個(gè)時(shí)間點(diǎn)存在一定波動(dòng)，但組間無顯著變化，見圖5B、C。（2）MFB?ART 組：0 ～ 96 h 紅色熒光強(qiáng)度明顯下降［從（17.58 ± 1.08）降至最低峰（1.28±0.35）］，36、48、60、72 h（P<0.01）和84、96 h（P<0.05）比基線明顯下降，雖然60～96 h 的紅色熒光強(qiáng)度稍有回升，但組間變化無差異。各時(shí)間點(diǎn)綠色熒光的強(qiáng)度變化無差異。見圖5B、C。以上結(jié)果表明：ART 可降低MFB 細(xì)胞線粒體膜電位，其作用高峰出現(xiàn)于ART 處理后24～36 h。

圖5 ART 對(duì)MFB 細(xì)胞線粒體膜電位的影響Fig.5 Effects of ART on the mitochondrial membrane potential of MFB cells

2.5 RT?qPCR 檢測ART 處理后MFB 線粒體凋亡相關(guān)基因的表達(dá)情況RT?qPCR 結(jié)果表明：相較于MFB 組，MFB?ART 組抗凋亡的BCL?2 表達(dá)明顯降低（P< 0.001），而BCL?W、BCL?XL、MCL?1 表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；具凋亡激活功能的BIM（P< 0.01）表達(dá)升高，而BID 表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；增敏功能的PUMA、BMF、HRK（P<0.05）表達(dá)升高，而BAD、NOXA 表達(dá)變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；效應(yīng)功能的BAX 和BAK 表達(dá)變化差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖6。

圖6 ART 對(duì)MFB 細(xì)胞線粒體凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of ART on mitochondrial apoptosis related gene expression in MFB cells

3 討論

BO 是異基因造血干細(xì)胞移植后肺部慢性移植物抗宿主病（chronic graft versus host disease，cGVHD）嚴(yán)重并發(fā)癥，小氣道纖維化是關(guān)鍵病理改變［1，16］：氣道上皮損傷引起炎癥、免疫紊亂，進(jìn)而引起MFB 的活化、增殖、凋亡逃逸，進(jìn)一步引發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）沉積，最終導(dǎo)致不可逆性瘢痕形成。cGVHD?BO 目前治療以抗炎、免疫調(diào)節(jié)為主，但效果不盡人意。貝伐珠單抗［17］、糖皮質(zhì)激素［18］等可改善肺纖維化及炎癥，但無法克服移植患者排斥、免疫重建不穩(wěn)定導(dǎo)致的氣道反復(fù)損傷和慢性炎癥的體質(zhì)因素。靶向纖維化細(xì)胞因子通路的新藥如“尼達(dá)尼布”和“吡非尼酮”在特發(fā)性肺纖維化的臨床試驗(yàn)中療效未達(dá)預(yù)期，且無法逆轉(zhuǎn)已形成病理纖維化損傷，探索BO治療新策略極為迫切。

MFB 是纖維化過程中的關(guān)鍵效應(yīng)細(xì)胞，高表達(dá)α?SMA，正常組織中沒有或極少M(fèi)FB，但損傷和炎癥刺激可使局部的FB、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞等轉(zhuǎn)化為MFB，驅(qū)使MFB 激活、增殖、分泌、收縮，致使局部組織機(jī)械壓力增大、ECM 沉積及促纖維化細(xì)胞因子的釋放，加劇纖維化的進(jìn)程。病理纖維化中MFB 通過凋亡逃逸在組織中持續(xù)存活，造成靶器官不可逆損傷［19-21］。靶向MFB凋亡，比靶向復(fù)雜的炎癥通路或某一細(xì)胞向MFB轉(zhuǎn)化途徑更具高效性。LAGARES 等［4-5］發(fā)現(xiàn)在硬皮病小鼠模型中，MFB 促凋亡激活蛋白BIM 表達(dá)升高，伴隨抗凋亡蛋白BCL?XL更高水平表達(dá)的現(xiàn)象，導(dǎo)致BCL?2 家族蛋白天平最終向抗凋亡方向傾斜，MFB 發(fā)生了凋亡逃逸；利用BCL?2 蛋白家族（BCL?XL、BCL?2、BCL?W）抑制劑ABT?263 可糾正BCL?2 家族蛋白的表達(dá)失衡，成功誘導(dǎo)MFB 細(xì)胞發(fā)生線粒體凋亡，并逆轉(zhuǎn)皮膚的病理纖維化。另外，二甲雙胍可經(jīng)AMPK途徑促M(fèi)FB的凋亡和失活，從而逆轉(zhuǎn)肺纖維化［22］；異羥肟酸可經(jīng)下調(diào)BCL?XL和上調(diào)BAK 誘導(dǎo)特發(fā)性肺纖維化患者的MFB 凋亡，并可改善博來霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化［23］；過表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞蛋白CCN5 可激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)MFB 凋亡并部分逆轉(zhuǎn)已形成的心臟纖維化［24］等發(fā)現(xiàn)，提示啟動(dòng)MFB 線粒體凋亡的分子基礎(chǔ)取決于BCL?2 家族蛋白中促凋亡/抗凋亡力量組合的天平傾向，因此，靶向MFB 凋亡逃逸——調(diào)節(jié)MFB的BCL?2 家族蛋白失衡，可能是延緩甚至逆轉(zhuǎn)纖維化的一種有效策略。

ART 是經(jīng)典的抗瘧疾藥物，其安全性在眾多臨床研究中已被驗(yàn)證。近來研究［6］發(fā)現(xiàn)：ART 在肺、腎臟、肝臟、皮膚等許多器官中皆可發(fā)揮抗纖維化作用，可誘導(dǎo)局部組織細(xì)胞凋亡、抑制局部組織細(xì)胞向MFB 轉(zhuǎn)化及其抗炎、免疫調(diào)節(jié)等。本研究團(tuán)隊(duì)既往工作基礎(chǔ)顯示［15］：ART 可延長cGVHD小鼠的生存時(shí)間，改善肺臟、肝臟、皮膚病理損傷，減輕BO 小鼠小氣道損傷和α?SMA+MFB 細(xì)胞浸潤，提示ART 可能通過抑制MFB 改善cGVHD?BO病理進(jìn)程。

本研究通過TGF?β誘導(dǎo)FB 構(gòu)建MFB 體外模型，證實(shí)ART 可調(diào)節(jié)MFB 的BCL?2 家族抗凋亡（BCL?2↓）/促凋亡（BIM↑、PUMA↑、BMF↑、HRK↑）平衡向促凋亡方向傾斜，觸發(fā)MFB 發(fā)生線粒體膜去極化，并直接誘導(dǎo)MFB 細(xì)胞凋亡。ART 作用于MFB 的線粒體凋亡機(jī)制與FB 不同，ART 誘導(dǎo)FB 凋亡（BAX↑、BCL?2↓）［7］，而不能促進(jìn)MFB 的BAX 表達(dá)，說明對(duì)于不同細(xì)胞，ART 靶向BCL?2 家族中抗凋亡/促凋亡分子的作用機(jī)制不同及組合存在差異［25］。

本研究首次證實(shí)ART 可直接誘導(dǎo)MFB 凋亡，并且ART 通過調(diào)控MFB 的BCL?2 家族平衡傾向，誘導(dǎo)MFB 發(fā)生線粒體凋亡，這些結(jié)果為ART 治療cGVHD?BO 提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。本研究也存在一些局限性：體外實(shí)驗(yàn)與體內(nèi)環(huán)境存在差異，需進(jìn)一步完善體內(nèi)研究；有關(guān)ART 調(diào)節(jié)MFB 線粒體BCL?2家族蛋白失衡的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。筆者將繼續(xù)探索ART 調(diào)控MFB 的BCL?2 家族蛋白表達(dá)分子機(jī)制，并通過對(duì)cGVHD?BO 小鼠模型和臨床病例的深入研究，確定cGVHD?BO 特異性BCL?2 家族蛋白失衡組合?？偟膩碚f，ART 調(diào)控MFB 凋亡逃逸可能是其抗纖維化的重要機(jī)制之一，對(duì)于血液系統(tǒng)腫瘤合并cGVHD 的移植患者，ART 可能是一個(gè)具有抗纖維化，又能兼顧抗腫瘤、抗感染作用的潛在候選藥物，有望成為cGVHD?BO 治療的新方法。