PRKAA2基因在腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞中表達(dá)差異研究

孫春霞 陳書坤 鄭磊

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州510515）

癌癥已經(jīng)成為全球最嚴(yán)重的致死性疾病之一。據(jù)全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)估計(jì)，2020年全球癌癥發(fā)病人數(shù)和死亡人數(shù)分別達(dá)到1 930 萬和1 000 萬［1］。研究［2］表明轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是癌癥患者死亡的主要原因，血行播散則是癌癥轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的主要途徑，因此檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cells，CTCs）對癌癥患者的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的預(yù)測及療效監(jiān)測具有重要的臨床意義。CTCs 是由實(shí)體瘤脫落進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，作為“液體活檢”的主要標(biāo)本之一，具有無創(chuàng)、便捷和可實(shí)時監(jiān)測的特點(diǎn)，有助于實(shí)體瘤的早期檢測與預(yù)后評估，在個體化治療及療效監(jiān)測中具有重要臨床意義［3］。然而，CTCs 數(shù)量十分稀少，從數(shù)以萬計(jì)的血細(xì)胞中準(zhǔn)確識別CTCs 成為了一項(xiàng)主要技術(shù)難題，極大阻礙其臨床應(yīng)用［4］。目前，聯(lián)合多種上皮標(biāo)志物及間質(zhì)標(biāo)志物檢測已經(jīng)成為提高CTCs 檢出率的一個有效策略［5-6］，但該策略存在特異性不足的問題。因此，迫切需要開發(fā)特異性高的標(biāo)志物，方便實(shí)體瘤外周血的CTCs 的鑒定。

本研究利用腫瘤細(xì)胞與血細(xì)胞脂質(zhì)代謝水平差異的特點(diǎn)，使用原位鎖式探針雜交技術(shù)原位檢測腫瘤細(xì)胞和白細(xì)胞（WBC）的脂代謝相關(guān)基因PRKAA2 的差異表達(dá)，為PRKAA2 用于CTCs 的鑒定提供可靠的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系人肝癌細(xì)胞HepG2，宮頸癌細(xì)胞Hela，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87 和前列腺癌細(xì)胞PC?3 均購自上海中科院細(xì)胞研究所細(xì)胞資源中心。

1.1.2 主要試劑與儀器LightCycler 480 實(shí)時熒光定量PCR 儀（瑞士Roche 公司）、倒置共聚焦熒光顯微鏡（日本尼康公司）、細(xì)胞涂片離心機(jī)（中國上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（中國Tiangen 公司）、Fast?Fire qPCR PreMix（中國Tiangen 公司）、Ampligase?DNA Ligase（美國Lucigen 公司）、Rnase H，Rever?taid H Minus Rt Ea，Ribolock Rnase Inhibitor Ea，Phi29 DNA Polymerase Ea（美國Thermo Fisher Scien?tific 公司）、LymphoprepTM（加拿大Stemcell 公司）、qRT?PCR 引物（中國BGI 公司）、原位雜交引物和探針（中國BGI 公司）、CellTrace CFSE Cell Prolifer?ation，CFSE，Slowfade gold antifade reagent，2?（4?Amidinophenyl）?6?indolecarbamidine dihydrochlori?de，DAPI（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。

1.1.3 引物和探針原位鎖式探針實(shí)驗(yàn)的熒光檢測探針來源于文獻(xiàn)［7］，引物和檢測探針使用Inte?grated DNA technology 網(wǎng) 站（https：//sg.idtdna.com/pages）進(jìn)行設(shè)計(jì)，并在Blastn（https：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）網(wǎng)站的refseq_rna 數(shù)據(jù)庫中行序列比對以獲取特異性的引物（引物，鎖式探針和檢測探針序列見表1-2）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，并將細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2孵箱中，待細(xì)胞匯合度為80%～90%時采用0.25%胰蛋白酶消化收獲細(xì)胞。

1.2.2 提取WBC按照說明書使用Lymphoprep試劑提取健康體檢者外周血WBC，具體操作如下：在15 mL離心管中加入Lymphoprep分離液2 mL，取2 mL 3%FBA?PBS 稀釋等量全血，稀釋后血液疊加在Lymphoprep分離液上，1 200 g離心10 min后棄上清，3%FBS?PBS 離心洗滌后收集WBC 沉淀。

1.2.3 腫瘤細(xì)胞和WBC 的PRKAA2 mRNA 定量檢測按照TRIZOLTM 試劑說明書步驟分別抽提腫瘤細(xì)胞和WBC 的總RNA。使用FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒逆轉(zhuǎn)錄RNA，取1 μg RNA 合成cDNA。采用FastFire qPCR PreMix試劑盒用于qRT?PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL。引物序列見表1，GAPDH 作為內(nèi)參基因。反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火/延伸15 s，共40個循環(huán)。使用LightCycler 480實(shí)時熒光定量PCR儀檢測樣本熒光信號。使用2?ΔΔCT法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

表1 熒光定量PCR 引物序列Tab.1 Primer sequences of fluorescence quantitative PCR

1.2.4 原位鎖式探針雜交實(shí)驗(yàn)（1）制片：摻入實(shí)驗(yàn)中，將對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞消化成單個細(xì)胞，加入終濃度為5 μmol/L 的細(xì)胞追蹤染料CFSE（溶于1 mL PBS 中）后37 ℃水浴20 min，加5 mL 完全培養(yǎng)基37 ℃水浴30 min，PBS 清洗3 次，獲取細(xì)胞沉淀。腫瘤細(xì)胞、WBC和WBC混合CFSE標(biāo)記腫瘤細(xì)胞置于細(xì)胞甩片離心機(jī)，1 600 r/min 離心3 min，制成細(xì)胞玻片樣本，3.7%多聚甲醛固定10 min，-20 ℃冰箱保存。（2）雜交實(shí)驗(yàn)：詳細(xì)過程參照文獻(xiàn)［9］，主要程序包括以下步驟：（1）加入Revertaid H minus RT 酶逆轉(zhuǎn)錄體系，45 ℃孵育3 h；（2）加入Rnase H，Ampligase?DNA Ligase 酶體系37 ℃孵育30 min，45 ℃孵育45 min；（3）加入Phi29 DNA polymerase 酶體系室溫滾環(huán)擴(kuò)增過夜；（4）加熒光標(biāo)記檢測探針置于37 ℃孵箱雜交30 min；（5）最后用1∶5 000 DAPI 復(fù)染細(xì)胞核，再滴加Slowfade gold antifade reagent 抗淬滅封片劑封片，4 ℃保存；（6）共聚焦熒光顯微鏡成像和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，正態(tài)分布兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，方差不齊時則采用校正t檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 原位鎖式雜交實(shí)驗(yàn)的引物和探針序列Tab.2 Primer and probe sequences for in situ padlock hybridization experiments

2 結(jié)果

2.1 PRKAA2 在WBC 與多種腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平THPA 數(shù)據(jù)庫（https：//www.proteinatlas.org/）的RNA 測序數(shù)據(jù)［8］顯示PRKAA2 基因在WBC 中幾乎不表達(dá)（圖1A）。應(yīng)用qRT?PCR 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證該基因在HepG2、U87、Hela、PC?3 細(xì)胞系和WBC 中的表達(dá)差異，結(jié)果見圖1B、表3，HepG2、U87、Hela和PC?3 細(xì)胞系中的PRKAA2 mRNA 水平顯著高于WBC，差異具有統(tǒng)計(jì)意義（均P<0.05）。

圖1 PRKAA2 在WBC 與多種腫瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平Fig.1 The mRNA level of PRKAA2 in WBC and multiple tumor cell lines

表3 PRKAA2 mRNA 在Hela、U87、PC?3、HepG2 和WBC細(xì)胞中相對表達(dá)量（2?ΔΔCT）Tab.3 PRKAA2 mRNA levels in Hela，U87，PC?3，HepG2 cancer cells and WBC（2?ΔΔCT）±s

表3 PRKAA2 mRNA 在Hela、U87、PC?3、HepG2 和WBC細(xì)胞中相對表達(dá)量（2?ΔΔCT）Tab.3 PRKAA2 mRNA levels in Hela，U87，PC?3，HepG2 cancer cells and WBC（2?ΔΔCT）±s

注：P 值均為與WBC 比較所得

?ΔΔCT 樣本W(wǎng)BC Hela U87 PC?3 HepG2 PRKAA2（2）1.12±0.73 429.40±109.6 206.18±15.5 57.11±7.67 778.70±156.9 P 值0.002 0.002<0.001 0.013

2.2 PRKAA2 基因在HepG2、U87、Hela、PC?3 細(xì)胞中特異性高表達(dá)使用ACTB基因作為陽性對照，原位鎖式探針技術(shù)檢測HepG2、U87、Hela、PC?3 細(xì)胞系和WBC的PRKAA2 mRNA，結(jié)果見圖2，HepG2、U87、Hela 和PC?3 細(xì)胞顯示為DAPI+/PRKAA2+/ACTB+，而WBC 顯示為DAPI+/PRKAA2-/ACTB+，表明PRKAA2 基因在HepG2、U87、Hela 和PC?3 細(xì)胞中特異性高表達(dá)。

圖2 腫瘤細(xì)胞HepG2、Hela、U87、PC?3 與WBC 的PRKAA2 mRNA 信號熒光圖 標(biāo)尺：10 μM（放大倍數(shù)400×：目鏡10×，物鏡40×）Fig.2 Fluorescent images of PRKAA2 mRNA in cancer cells（HepG2，Hela，U87，PC?3）and WBC（magnification power：400×：eyepiece 10×，objective 40×）

2.3 檢測PRKAA2mRNA 熒光信號可準(zhǔn)確鑒定腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用原位鎖式探針雜交技術(shù)檢測PRKAA2 以識別CTCs。HepG2、U87、Hela 和PC?3腫瘤細(xì)胞被預(yù)先標(biāo)記CFSE 熒光染料并摻入1 mL健康體檢者外周血中以模擬臨床樣本，內(nèi)參基因ACTB 作為陽性對照。結(jié)果見圖3，WBC（DAPI+/CFSE-）未檢測到PRKAA2 信號，而幾乎所有腫瘤細(xì)胞（DAPI+/CFSE+）均檢測到PRKAA2 信號。CFSE 和PRKAA2 在共聚焦熒光顯微鏡下實(shí)現(xiàn)良好的熒光信號共定位，表明檢測PRKAA2 mRNA 熒光信號可準(zhǔn)確鑒定腫瘤細(xì)胞。

圖3 PRKAA2 mRNA 與CFSE 共定位熒光圖（放大倍數(shù)400×：目鏡10×，物鏡40×）Fig.3 Fluorescent images show co-localization of PRKAA2 mRNA and CFSE（magnification power：400×：eyepiece 10×，objective 40×）

3 討論

脂肪由磷脂、脂肪酸、甘油三酯、鞘脂、膽固醇和膽固醇酯等分子組成，是所有細(xì)胞膜的重要組成部分，也是特定條件下細(xì)胞的重要能量來源［9-10］。脂質(zhì)代謝異常是眾多代謝性疾病，如心血管疾病、非酒精性脂肪肝、糖尿病、胰腺炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素［11-14］。越來越多的證據(jù)［15-17］表明，脂肪代謝異常即脂代謝重編程有利于癌細(xì)胞的存活、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，在腫瘤惡性生物學(xué)行為中起著關(guān)鍵的作用。因此，靶向脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)相關(guān)通路已成為一種新的抗癌策略［18-19］。

本實(shí)驗(yàn)室長期致力于CTCs 的富集和鑒定的研究，經(jīng)脂代謝基因芯片篩選發(fā)現(xiàn)PRKAA2 在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著高于WBC。本研究發(fā)現(xiàn)，除了肝癌細(xì)胞，在前列腺癌、宮頸癌、膠質(zhì)瘤等細(xì)胞中其表達(dá)量均和WBC 有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這和PRKAA2 的功能密切相關(guān)：PRKAA2 基因編碼腺苷酸活化蛋白激酶（AMP?activated protein kinase，AMPK）的α2 催化亞基蛋白，該蛋白通過磷酸化乙酰輔酶A 羧化酶1（ACC1）、磷酸化線粒體相關(guān)亞型ACC2 和介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36 轉(zhuǎn)位到質(zhì)膜，達(dá)到抑制脂肪酸合成、上調(diào)脂肪酸氧化水平、激活脂肪酸攝取的效果，從而在應(yīng)激條件下維持腫瘤細(xì)胞的代謝穩(wěn)態(tài)［20］。由于腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的脂代謝差異，PRKAA2 作為一個潛在的“通用型”腫瘤細(xì)胞標(biāo)志物的優(yōu)勢如下：（1）可從細(xì)胞代謝功能上直接辨別癌與非癌，特異性高；（2）不局限于某種特定腫瘤細(xì)胞，有望提高CTCs 檢測通量，并且省時、經(jīng)濟(jì)。因此，PRKAA2 有望成為極具潛力的CTCs 鑒定標(biāo)志物。

本研究使用的原位鎖式探針雜交技術(shù)整合了滾環(huán)擴(kuò)增法，可在細(xì)胞原位檢測單個PRKAA2 mRNA 信號，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和信噪比高的特點(diǎn)［7］，為得到準(zhǔn)確可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供堅(jiān)實(shí)的技術(shù)保障。我們將腫瘤細(xì)胞摻入外周血模擬CTCs，采用原位鎖式雜交技術(shù)可視化檢測PRKAA2熒光信號，結(jié)果表明對PRKAA2 的熒光信號檢測可從大量背景WBC 中準(zhǔn)確識別腫瘤細(xì)胞，為PRKAA2 用于CTCs 的鑒定提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)保障。

總之，本研究初步證實(shí)，檢測標(biāo)志物PRKAA2可特異鑒定多種類型的腫瘤細(xì)胞，并有望準(zhǔn)確定量多種癌癥起源CTCs，對腫瘤的輔助診斷、治療檢測和預(yù)后評估等提供重要的臨床價(jià)值。然而，本課題局限于體外實(shí)驗(yàn)，尚未進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，后續(xù)的研究中會納入多腫瘤類型及擴(kuò)大樣本量，來進(jìn)一步驗(yàn)證PRKAA2 作為泛癌CTCs 鑒定標(biāo)志物的臨床應(yīng)用價(jià)值。