高效液相色譜一測多評法同時測定益肺膠囊中苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的含量

邵 艷，黃 英，浦錦寶

（1.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院藥劑科，浙江 杭州 311201；2.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院推拿科，浙江 杭州 311201；3.浙江省中醫(yī)藥研究院，浙江 杭州 310007）

益肺膠囊是由炒苦杏仁、知母、桑白皮等8味中藥加工而成，用于久病咳喘、胸滿多痰等病癥的治療，現(xiàn)行質(zhì)量標準[1]和文獻報道[2-3]僅對該制劑單一成分進行定量控制，難以全面體現(xiàn)中成藥復方制劑多成分-多靶點-多通道相互作用的整體特點和質(zhì)控要求。筆者依據(jù)中藥配伍基礎(chǔ)理論，結(jié)合中藥質(zhì)量標志物新概念，采用高效液相色譜一測多評法，對益肺膠囊中君藥炒苦杏仁特征成分苦杏仁苷，臣藥知母主要藥效成分新芒果苷、芒果苷和異芒果苷，佐藥桑白皮代表性成分桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素含量同時測定，建立益肺膠囊多指標成分質(zhì)量控制方法，以期為全面評價益肺膠囊的整體質(zhì)量提供數(shù)據(jù)參考。

1 儀器與試藥

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），LC-2010A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司），AG-135型電子天平（德國Mettler Toledo公司），KEL-600型數(shù)控超聲波清洗機（濟南克林自動化設備有限公司）。對照品苦杏仁苷（批號：110820-201808）和芒果苷（批號：111607-201704）來源于中國食品藥品檢定研究院；對照品新芒果苷（批號：PRF9070941）和異芒果苷（批號：PRF9092642）來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；對照品桑皮苷A（批號：CFS202001）、桑辛素M（批號：CFS201901）和二氫桑色素（批號：CFS201902）來源于武漢天植生物技術(shù)有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純；益肺膠囊（山西華元醫(yī)藥生物技術(shù)有限公司，規(guī)格：0.3 g，批號：190101、190201、190401、190402、190702、190901、190902、190903、191202、200302）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 取苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素對照品適量，精密稱定，用稀乙醇溶解并制成質(zhì)量濃度分別為9.532、4.878、2.594、0.228、0.306、0.192、0.116 mg·mL-1的混合貯備液；精密量取上述貯備液1.0 mL，用稀乙醇稀釋至20 mL，制得質(zhì)量濃度分別為476.6、243.9、129.7、11.4、15.3、9.6、5.8 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取益肺膠囊10粒，傾出內(nèi)容物，研成細粉，取2.0 g精密稱定，加稀乙醇20 mL，超聲30 min，放冷后用稀乙醇稀釋至25 mL，搖勻，過濾，得益肺膠囊供試品溶液。取適量按益肺膠囊質(zhì)量標準處方比例及工藝制備缺炒苦杏仁、缺知母、缺桑白皮的陰性供試品，按上述方法制備陰性供試品溶液。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性實驗

流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0 ～ 10 min，8.0%A；11 ～ 16 min，8.0%→12.0%A；17 ～ 27 min，12.0%→23.0%A；28 ～ 44 min，23.0%→65.0%A；45 ～ 50 min，65.0%→8.0%A），流速：1.0 mL·min-1；色譜柱：UltiMate AQ-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫：30 ℃；檢測波長分別為207 nm（0 ～ 16 min檢測苦杏仁苷）[4-5]、258 nm（17 ～ 27 min檢測新芒果苷、芒果苷和異芒果苷）[6-8]和305 nm（28～ 50 min檢測桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素）[9]；進樣量：10 μL。理論塔板數(shù)以各成分色譜峰計應≥4500。

2.3 專屬性考察

分別精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液及“2.1.2”項下溶液各10 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測分析，記錄所檢測色譜圖（見圖1）。結(jié)果顯示，混合對照品和益肺膠囊供試品色譜圖中苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素與相鄰色譜峰均能良好分離，分離度均> 1.5；陰性供試品對益肺膠囊中7種成分的同時測定無干擾。

圖1 HPLC色譜圖1 - 苦杏仁苷，2 - 新芒果苷，3 - 芒果苷，4 - 異芒果苷，5 - 桑皮苷A，6 - 桑辛素M，7 - 二氫桑色素；A - 混合對照品，B - 益肺膠囊，C -苦杏仁陰性供試品，D - 知母陰性供試品，E - 桑白皮陰性供試品Fig 1 HPLC chromatogram1 - amygdalin, 2 - neomangiferin, 3 - mangiferin, 4 - isomangiferin, 5 -mulberroside A, 6 - moracin M, 7 - dihydromorin; A - mixed control, B -Yifei capsules, C - sample without of semen armeniacae amarae, D - sample without of rhizoma anemarrhenae, E - sample without of mori cortex

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關(guān)系 精密量取“2.1.1”項下貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，分別用稀乙醇稀釋至20 mL，制得系列濃度溶液，各精密吸取10 μL，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積，以峰面積對質(zhì)量濃度進行線性回歸，計算得7種成分的回歸方程和線性范圍，見表1。

表1 回歸方程和線性范圍Tab 1 The results of regression equation and linear range

2.4.2 精密度 取益肺膠囊（批號：190101）同一份供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積，重復進樣6次，測得益肺膠囊中7種成分峰面積的RSD分別為0.52%、0.66%、0.83%、1.18%、0.91%、0.87%、1.24%。

2.4.3 重復性 取益肺膠囊（批號：190101）供試品適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，重復操作6次，進樣檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積，計算得7種成分含量的RSD分別為0.74%、0.89%、1.25%、1.88%、1.73%、1.60%、1.89%。

2.4.4 穩(wěn)定性 取益肺膠囊（批號：190101）同一份供試品溶液，于制備后0、4、8、12、16、20、24 h各進樣10 μL，檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積，結(jié)果顯示供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，7種成分峰面積的RSD分別為0.56%、0.61%、0.90%、1.21%、1.03%、0.95%、1.28%。

2.4.5 加樣回收率 取含量已知的益肺膠囊供試品（批號：190101）適量，內(nèi)容物研成細粉，取9份，每份1.0 g，精密稱定，分別加入混合對照品溶液（苦杏仁苷3.472 mg·mL-1、新芒果苷1.847 mg·mL-1、芒果苷0.914 mg·mL-1、異芒果苷0.081 mg·mL-1、桑皮苷A 0.104 mg·mL-1、桑辛素M 0.067 mg·mL-1、二氫桑色素0.039 mg·mL-1）1.0、2.0、3.0 mL各3份，按照“2.1.2”項下方法制備加樣供試品溶液，精密吸取上述溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積并計算各成分加樣回收率。結(jié)果顯示，益肺膠囊中7種成分的平均加樣回收率及RSD分別為100.08%（0.61%）、99.66%（0.83%）、98.95%（0.95%）、98.48%（1.47%）、97.82%（1.08%）、96.91%（1.16%）、97.89%（1.57%）。

2.4.6 相對校正因子的測定 精密吸取“2.4.1”項下系列濃度溶液各10 μL，進樣檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積，以芒果苷為內(nèi)參物，按計算公式：?k/s= ?k/?s=（WkAs）/（WsAk）（公式中W、A分別代表質(zhì)量濃度和峰面積，k、s分別代表其他成分和內(nèi)參物）分別計算得苦杏仁苷、新芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素相對校正因子，見表2。

表2 相對校正因子結(jié)果Tab 2 Results of relative correction factors

2.4.7 相對校正因子耐用性考察 精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液10 μL，進樣檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積，對比考察不同儀器、色譜柱、柱溫以及流速對相對校正因子的影響，結(jié)果顯示在不同儀器（UltiMate 3000型、LC-2010A型高效液相色譜儀）和色譜柱（UltiMate AQ-C18柱、Agilent TC-C18柱、Thermo C18柱）條件下苦杏仁苷、新芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素相對校正因子分別為1.473 1、1.258 6、0.736 3、0.696 8、0.816 7、0.934 9，RSD分別為1.35%、1.89%、1.44%、1.15%、1.53%、1.49%；在不同柱溫（25、28、30、32、35 ℃）條件下各成分相對校正因子分別為1.475 9、1.266 4、0.742 1、0.702 1、0.817 8、0.935 6，RSD分別為1.18%、1.84%、1.51%、1.01%、1.45%、1.09%；在不同流速（0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1）條件下各成分相對校正因子分別為1.477 5、1.259 1、0.735 8、0.695 4、0.815 1、0.936 0，RSD分別為1.86%、1.61%、1.66%、1.03%、1.71%、1.53%。表明本實驗所建立的相對校正因子耐用性良好。

2.5 一測多評法與外標法測定結(jié)果比較

取10個批次的益肺膠囊樣品適量，按“2.1.2”項下方法每批次平行制備3份益肺膠囊供試品溶液，精密吸取10 μL注入高效液相色譜儀中，按“2.2”項下色譜條件進樣檢測苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素的峰面積，采用外標法（external standard method，ESM）和一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single marker method，QAMS）分別計算7種成分的含量，見表3。

表3 含量測定結(jié)果. mg·g-1，n = 3Tab 3 Results of content determination. mg·g-1, n = 3

3 討論

3.1 指標成分的選擇

益肺膠囊由炒苦杏仁、知母、桑白皮、紅參、茯苓、川貝母、甘草和蛤蚧8味中藥按照君、臣、佐、使配伍而成，方中炒苦杏仁降氣、止咳、平喘，蛤蚧補肺益腎、納氣定喘，合為君藥；知母清熱瀉火、滋陰潤燥，川貝母清熱潤肺、化痰止咳，紅參補氣固脫、益氣攝血，合為臣藥；桑白皮瀉肺平喘，茯苓利水滲濕、健脾寧心，合為佐藥；甘草補脾益氣、祛痰止咳、調(diào)和諸藥，為其使藥[10]。8味中藥材所含成分相互協(xié)同、相互制約，共達補腎益肺、清熱化痰、止咳平喘的臨床功效。筆者參考中藥質(zhì)量標志物確認原則，選擇君藥炒苦杏仁特征成分苦杏仁苷，臣藥知母主要藥效成分新芒果苷、芒果苷和異芒果苷，佐藥桑白皮代表性成分桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素為定量控制指標成分，以期為全面評價益肺膠囊的整體質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

3.2 供試品溶液提取方法篩選

本實驗在對益肺膠囊樣品提取過程中分別考察了95%乙醇、稀乙醇[7]、50%甲醇[5]、甲醇[4]、水[9]等溶劑對苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M、二氫桑色素綜合提取率的影響，結(jié)果表明以稀乙醇為提取溶劑時，益肺膠囊中7種成分綜合提取率最佳，雜質(zhì)干擾較小，基線相對平穩(wěn)。遂對提取方式（超聲提取[4-8]、回流提取[9]）及提取時間進行對比優(yōu)化，結(jié)果顯示兩種方法提取7種成分效果無明顯差異，但超聲提取雜質(zhì)干擾較小，更易于操作且穩(wěn)定。最終確定以稀乙醇為提取溶劑超聲提取30 min對益肺膠囊進行供試品處理。

3.3 流動相的優(yōu)化

以益肺膠囊中7種成分峰形和分離度為主要評價指標，考慮到甲醇在低波長處存在紫外吸收，影響色譜圖基線平穩(wěn)及定量檢測準確性，故選用乙腈為有機相，對不同流動相體系（乙腈-1%冰醋酸溶液[6-7]、乙腈-0.1%甲酸溶液[8]、乙腈-0.1%磷酸水溶液[4-5]、乙腈-0.2%磷酸水溶液）進行對比考察，同時對有機相和水相比例進行不斷優(yōu)化，最終確定“2.2”項下流動相體系。

從含量測定結(jié)果來看，一測多評法計算結(jié)果與外標法實測值之間無明顯差異，表明本文所建立的高效液相色譜一測多評法可用于益肺膠囊多組分質(zhì)量控制；同時檢測結(jié)果也反映出各成分含量存在一定的批間差異，尤其以苦杏仁苷、異芒果苷和桑皮苷A差異較為明顯，表明本文所建立的方法對確保益肺膠囊質(zhì)量穩(wěn)定性具有重要意義。本文采用高效液相色譜一測多評法對益肺膠囊中苦杏仁苷、新芒果苷、芒果苷、異芒果苷、桑皮苷A、桑辛素M和二氫桑色素含量進行了同時測定，首次建立了益肺膠囊多指標成分質(zhì)量控制模式，所建立的方法結(jié)果較準確，有效降低了檢驗成本，推動了方法的普及，為全面評價益肺膠囊整體質(zhì)量提供了參考依據(jù)。