福建地區(qū)類孟買血型血清學特點及其基因突變分析

張愛，林洪鏗，何覓，褚曉凌

(福建省血液中心檢驗科,福州350004)

類孟買血型為罕見的紅細胞血型，屬于H血型系統(tǒng)，主要特征為紅細胞上H抗原缺失，而分泌液中可以檢測到少量H抗原[1]。H抗原是A、B抗原形成的前體物質，H抗原缺失，可導致A、B抗原合成障礙，最終使得ABO血型鑒定錯誤和輸血困難，因此在輸血實踐中具有重要意義。我們在無償獻血人群中發(fā)現(xiàn)10例類孟買血型，在常規(guī)血清學方法鑒定的基礎上，同時采用直接測序技術對這10例樣品的ABO基因、FUT1基因和FUT2基因進行測序分析。

1 對象與方法

1.1研究對象 2018年3月至2019年11月因常規(guī)ABO血型鑒定時出現(xiàn)反定型細胞凝集異常而進一步檢測、鑒定為類孟買血型的10例獻血者，其中8例來自本中心，2例來自省內其他血站。獻血者中男性4例，女性6例，年齡18～40歲，籍貫均為福建省，每位獻血者留取EDTA-K2抗凝血5 mL。

1.2主要儀器與試劑 PE9600PCR擴增儀(美國Applied Bio-system公司)，KA-2200型離心機(日本株式會社久保田制作所)。單克隆抗A、抗B、抗H、篩選細胞及譜細胞(上海血液生物醫(yī)藥公司)，試劑紅細胞A、B及O(北京金豪制藥公司)，抗AB(法國Diagast公司)，單克隆抗Lea、抗Leb(英國Millipore公司)，人源多克隆抗A、抗B血清(中國醫(yī)學科學院輸血研究所)，基因組DNA純化試劑盒(德國Qiagen公司)。

1.3方法

1.3.1血型血清學檢測 對10例樣品行試管法ABO正、反定型及H抗原檢測，采用人源抗A、抗B進行吸收放散試驗，檢測紅細胞表面弱表達的A、B抗原，用試劑紅細胞篩選和鑒定血清中的不規(guī)則抗體。通過檢測Lewis血型間接了解個體的分泌狀態(tài)。以上試驗均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》[2]和相應試劑盒說明書進行。

1.3.2DNA提取 按照Qiagen DNA Min Blood試劑盒說明書提取樣品基因組DNA，經(jīng)紫外分光光度計檢測，DNA純度(A260 nm/A280 nm)為1.7～1.9。

1.3.3ABO、FUT1和FUT2基因擴增和測序分析 參照文獻[3]針對ABO基因第6、7外顯子進行擴增。引物5′-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3′、5′-CGGGATCCATGTGGGGTGGCACCCTGCCA-3′，用于擴增第6外顯子，片段長度252 bp。引物5′-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3′、5′-CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3′，用于擴增第7外顯子，片段長度843 bp。參照Yip等[4]報道的2對引物分別擴增FUT1基因第4外顯子和FUT2基因第2 外顯子，Hi7F1：5′-CATTTGCTAATTCGCCTTTCCTC-3′,Hi8R1：5′-GATCAGGCTACATCAGAAAGTCTCC-3′；Sei1F1：5′-CCATCTCCCAGCTAACGTGTCC-3′,See1R7：5′-GGGAGGCAGAGAAGGAGAAAAGG-3′。引物對Hi7F1和Hi8R1為擴增長度1 163 bp的FUT1基因蛋白編碼區(qū)，引物對Sei1F1和See1R1為擴增長度1 118 bp 的FUT2基因蛋白編碼區(qū)。引物由上海生工公司合成，PCR擴增產物由上海捷瑞生物公司測序。用Chromas2.23軟件分析測序結果及峰圖，用DANMAN5.22軟件將測定序列與NM020469(A101)、M35531(FUT1)和U17894(FUT2)的序列比對。

2 結果

2.1血型血清學結果 見表1。10例樣品中，Amh5例，Bmh2例，Omh3例，吸收放散試驗證實紅細胞表面含有少量的A或B抗原。除7號樣品外，其余樣品與譜細胞(10人份)反應均陽性，且強度一致，而與缺乏H抗原的紅細胞不凝集，提示血清中含有抗H 或抗HI，僅5號樣品在37 ℃中有極弱活性。Lewis血型均為Le(a-b+),證實10例樣品均為分泌型。

表1 10例類孟買血型樣品的血清學試驗結果

2.2ABO、FUT1和FUT2基因分析結果 10例樣品的ABO基因測序結果見表2。ABO基因測序結果與血清學吸收放散檢測結果相吻合。通過對FUT1基因的DNA序列分析，在10例樣品中檢測到4種無效等位基因，分別為：h1(547-552delAG)、h2(880-882delTT)、h3(658C>T)和h9(424C>T)(表2)。其中h1/h13例、h3/h13例、h1/h22例、h2/h2和h1/h9各1例。所有被研究樣品的FUT2基因，都具有357C>T的同義突變。樣品3、8和10在nt716位存在G>A的錯義突變，導致239位氨基酸由精氨酸(Arg)突變?yōu)楣劝滨０?Gln)，其中2例為雜合子，1例為純合子。FUT1和FUT2基因測序結果見圖1。

表2 10例類孟買血型樣品的分子生物學分析結果

注：A，樣品1、4和 5 FUT1基因測序結果；B，樣品3、8 FUT1基因測序結果； C，樣品10 FUT1基因測序結果； D，樣品2、6和7 FUT1基因測序結果； E，樣品9 FUT1基因測序結果；箭頭指示的堿基為突變堿基。

3 討論

類孟買血型是因紅細胞上H抗原缺乏而使ABO血型物質不能正常合成的一類血型，其最具特點的是紅細胞上ABH缺乏或弱表達，血清中存在抗H或抗HI抗體。類孟買血型具有明顯的遺傳異質性和區(qū)域性，其表型頻率在不同種族和群體中有較大差異，歐洲白種人群頻率極低，約為1∶1 000 000；印度人群約為1∶10 000；泰國人群估計頻率為1∶5 000；而我國不同區(qū)域人群中分布比例約為1∶8 000～1∶16 000[1，5-6]。

類孟買血型不屬于ABO血型系統(tǒng)，卻可造成ABO血型的異常表現(xiàn)。本研究中10例樣品常規(guī)血清學試驗正定型均為O型，反定型出現(xiàn)凝集強度(和/或狀態(tài))的異常。樣品1～3表現(xiàn)為典型正、反定型相符的O型，但與O細胞出現(xiàn)不同強度的凝集，從表面上看似乎為O型，存在不規(guī)則抗體，在臨床工作中易被誤認為是無法鑒定的高頻抗體而漏檢；樣品4～10，單從“反應”與“不反應”角度看，正、反定型相符，但反定型中與A細胞和B細胞之間凝集強度差異>2+，易被誤認為是O型抗A(或B)抗體減弱而漏檢。因此，在常規(guī)ABO血型定型時，對于正、反定型凝集異常的個體應補充相關紅細胞抗原檢測、吸收放散試驗、唾液中和試驗，甚至基因檢測等。本研究采集的10例樣品，經(jīng)進一步血清學試驗鑒定為類孟買血型。鑒于類孟買血型的稀有性和鑒定的特殊性，有必要建立相應的資料庫，以正確鑒定獻血者血型及滿足臨床類似血型患者的用血需求。在福建人群中類孟買血型有相對較高頻率(1∶8 500)[7]，因此我們建立了類孟買血型獻血者資料庫，至今已為臨床類似血型患者提供60余人次輸血支持。

目前遺傳學上用雙結構基因理論來解釋類孟買血型的形成機制：FUT1(H)基因編碼產物為α(1,2)巖藻糖轉移酶，共有365個氨基酸，作用底物是2型糖鏈，特異性催化2型H形成；FUT2(Se)基因編碼產物為α(1,2)巖藻糖轉移酶，共有332個氨基酸，作用底物是1型糖鏈，特異性催化1型H形成，因各自作用的底物不同，最終使得FUT1基因決定H抗原在紅細胞上的表達，F(xiàn)UT2基因決定H抗原在分泌腺和消化液中的表達[1]。典型的類孟買血型即紅細胞H抗原缺乏分泌型，其H基因無活性而Se基因有活性。此外，類孟買型也可能是紅細胞H部分缺乏非分泌型，其FUT1基因并非完全失活，而是功能減弱，導致了2型H的弱表達。目前發(fā)現(xiàn)的無活性FUT1基因達60多種，包括錯義突變、無義突變、移碼突變等。國內報道了其中的17種[6]，常見的突變類型為h1、h2、h3和h4，其他h基因零星散在。本研究在10例樣品中檢出4種無效h等位基因(h1、h2、h3和h9)；檢出2種FUT2等位基因：Se357與Se357,716。結合前期研究[7-8]，在福建地區(qū)47例類孟買血型個體中共觀察到6種無效h等位基因(h1、h2、h3、h4、h9和h328A)，其中h1基因占69.2%(65/94)，h2基因占20.2%(19/94)，進一步證實h1和h2為福建地區(qū)類孟買型個體的主要流行基因，與其他文獻報道相近[5-6,9]；其中45例類孟買血型樣品的FUT2基因均含有357C>T同義突變，同時15例還存在716G>A錯義突變，13例為雜合子，2例為純合子；17條Se357,716等位基因均與h2同步出現(xiàn)，且2例Se357,716純合的個體，其FUT1基因也為h2純合，提示Se357,716與突變等位基因h2密切相關。在Luo等[6]和Cai等[10]的研究中，共有11例含有h2基因個體其FUT2基因為Se357,716。但在郭忠慧等[11]的研究中，共有4例個體含有h2基因，僅2例存在相應Se357,716等位基因，另2例含有h2基因的個體其FUT2為Se357純合，與Yip等[4]報道的5例含有h2基因個體的h2-Se357單元型相同。由于相關文獻中未提供確切的地域或個體祖籍數(shù)據(jù)，同時目前相關研究樣品數(shù)量有限，突變等位基因h2與Se357,716是否存在連鎖遺傳關系或是具有地域特征，還有待進一步研究證實。