淋巴細胞活化基因3蛋白在自身免疫病中的研究進展*

汪達青，王卓，何春燕

(蘇州大學附屬第二醫(yī)院檢驗科，江蘇蘇州215004)

淋巴細胞活化基因3蛋白(lymphocyte activation gene-3，LAG3, CD223)是由Triebel等于1990年在活化的T細胞和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)細胞上發(fā)現(xiàn)的跨膜糖蛋白，其分子結(jié)構(gòu)與白細胞分化抗原4(cluster of differentiation 4,CD4)相似，具有免疫球蛋白超家族(immunoglobin superfamily， IgSF)樣結(jié)構(gòu)域[1]。LAG3可作為一種新型免疫檢查點，與相應(yīng)配體結(jié)合，負向調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，在免疫自穩(wěn)、免疫細胞增殖、活化、細胞因子產(chǎn)生的過程中發(fā)揮重要作用[2]。研究表明，慢性感染和腫瘤微環(huán)境中，LAG3介導T細胞功能障礙和免疫逃逸，加速疾病惡化[3-4]；而在自身免疫病中，lag3基因缺陷導致的自身免疫耐受性的喪失，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[5]。本文就LAG3及其在自身免疫病中的研究進展進行匯總闡述，以期為自身免疫病的發(fā)病、診斷及治療提供新的認知和思路。

1 LAG3結(jié)構(gòu)特點

lag3基因位于人類12號染色體(12p13.32)和小鼠6號染色體，與cd4基因相鄰，編碼含有498個氨基酸的蛋白質(zhì)[6]，其結(jié)構(gòu)可分為胞外區(qū)、胞內(nèi)區(qū)和跨膜區(qū)。LAG3胞外區(qū)與CD4相似，由4個IgSF結(jié)構(gòu)域(D1—D4)組成，為保證分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，每個結(jié)構(gòu)域內(nèi)有1個二硫鍵，其中D1區(qū)是LAG3與配體結(jié)合的主要位點[1,7]。胞內(nèi)區(qū)負責信號轉(zhuǎn)導，由3個保守序列組成，分別是絲氨酸磷酸化位點、KIEELE基序和EP基序。研究表明，除KIEELE基序為LAG3分子行使功能所必需外，其他區(qū)域的突變對其功能沒有影響[8]。此外，D4結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū)之間還存在“連接肽”區(qū)域，此區(qū)域含有較長的氨基酸序列，易被金屬蛋白酶水解，形成可溶性LAG3(soluble LAG3, sLAG3)[7]，sLAG3是否具有功能尚無統(tǒng)一定論。

2 LAG3表達

與其他抑制性受體相似，LAG3在NK和T細胞上誘導性表達。實驗證實，初始T細胞的LAG3儲存在溶酶體內(nèi)，經(jīng)PKC信號介導轉(zhuǎn)移到表面，以防止細胞過度活化產(chǎn)生損傷[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分免疫細胞不需要抗原的刺激，靜息狀態(tài)下即可表達LAG3，如漿細胞樣樹突狀細胞(plasmacytoid dendritic cell, pDC)、調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg)和1型調(diào)節(jié)性T細胞(type 1 regulatory T cells,Tr1)。其中，pDC是目前發(fā)現(xiàn)的LAG3表達水平最高的免疫細胞，可通過LAG3間接調(diào)節(jié)T細胞穩(wěn)態(tài)[10]，Treg和Tr1的免疫抑制功能也依賴LAG3分子[11-12]。此外，神經(jīng)系統(tǒng)中也發(fā)現(xiàn)LAG3的存在，神經(jīng)元表面的LAG3可促進病理α-突觸核蛋白原纖維(α-synuclein preformed fibrils，α-syn PFF)內(nèi)吞，加速帕金森綜合征疾病進展[13]?？傊琇AG3表達十分廣泛，更多LAG3+細胞的發(fā)現(xiàn)及功能有待研究。

3 LAG3的信號轉(zhuǎn)導及功能

研究表明，LAG3可與多種配體結(jié)合雙向傳遞信號，包括MHC-Ⅱ分子、C型凝集素受體LSECtin、半乳糖凝集素-3(Gal-3)、纖維蛋白原相關(guān)蛋白-1(fibrinogen-like protein 1，F(xiàn)GL-1)和α-syn PFF。

MHC-Ⅱ是LAG3經(jīng)典配體。與CD4相比，LAG3與MHC-Ⅱ的結(jié)合親和力約高100倍，但T細胞內(nèi)，LAG3并不破壞CD4與MHC-Ⅱ的結(jié)合，而是通過下調(diào)胞內(nèi)STAT5磷酸化的水平以及與LAG3相關(guān)蛋白(LAG-3 associated protein, LAP)相互作用，減少白細胞分化抗原3(cluster of differentiation 3，CD3)、T細胞受體(T cell receptor，TCR)表達，限制TCR-MHC信號驅(qū)動的細胞增殖，維持細胞穩(wěn)態(tài)[14-17]。LAG3與MHC-Ⅱ的結(jié)合在配體細胞中也傳遞負向信號，調(diào)節(jié) FcγRγ和ERK招募Src同源區(qū)2(Src-homology domain 2,SH2)蛋白酪氨酸磷酸酶1(SH2-containing protein tyrosine phosphatase,SHP-1)，抑制細胞成熟[18]。LAG3還可與LSECtin、Gal-3、FGL-1結(jié)合，介導腫瘤免疫逃逸，此類配體在腫瘤細胞中表達增強，使CD8+T細胞分泌γ-干擾素(interferon γ, IFN-γ)、IL-2減少，細胞免疫作用減弱[19-21]。在神經(jīng)系統(tǒng)中，LAG3介導LAG3獨特配體α-syn PFF內(nèi)吞和細胞傳遞，是引起神經(jīng)元變性的重要驅(qū)動因素[13]。LAG3及其受體的研究，為臨床相關(guān)疾病的治療提供新的思路。

4 LAG3與自身免疫病

4.1LAG3與SLE SLE是一種慢性炎癥性自身免疫病，好發(fā)于育齡女性，可累及多個器官，主要表現(xiàn)為皮疹、陽光敏感和關(guān)節(jié)疼痛。研究表明，提高LAG3水平能夠有效減輕SLE自身免疫反應(yīng)，IL-21單抗藥物BOS161721即可逆轉(zhuǎn)患者lag3基因的低表達，表現(xiàn)良好的治療效果[22]。在易患狼瘡的MRL/lpr小鼠中，LAG+Treg的移植也減少了自身抗體的產(chǎn)生，緩解疾病進展[23]，揭示LAG3+細胞在SLE中獨特的調(diào)節(jié)作用。

4.2LAG3與多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosis，MS) MS是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性脫髓鞘疾病，可分為多種表型，包括原發(fā)性進行性MS、繼發(fā)性MS、復發(fā)緩解型MS、臨床孤立綜合征和放射學孤立綜合征，其中以復發(fā)緩解型MS最為常見[24]。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)于lag3基因多態(tài)性與MS易感性的關(guān)系，不同地區(qū)的流行病學調(diào)查結(jié)果并不統(tǒng)一[25-28]。而LAG3分子對MS作用是肯定的。MS患者外周血單個核細胞中LAG3表達水平降低，且低殘疾指數(shù)的患者與非低殘疾指數(shù)的患者相比，LAG-3水平顯著升高[29]，這表明LAG3是MS中的重要保護因素，且與疾病進展相關(guān)。LAG3還可在MS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，腸道上皮內(nèi)淋巴細胞和外周血CC族趨化因子受體9(C-C chemokine receptor type 9,CCR9)陽性的記憶性T細胞在發(fā)病期間均可遷移到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，通過LAG3抑制自身免疫，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[30-31]。而在對MS治療措施的研究中發(fā)現(xiàn)，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中LAG3+T細胞通過誘導Treg、Tr1細胞的產(chǎn)生，減少炎癥因子的分泌，從而緩解小鼠臨床癥狀[32-34]。

4.3LAG3與1型糖尿病(type 1 diabetes mellitus, T1DM) T1DM是器官特異性自身免疫病，由自身反應(yīng)性T細胞攻擊胰島β細胞，導致的胰島素分泌絕對不足引起，好發(fā)于青少年。NOD小鼠是研究T1DM的常用模型。實驗表明，整體lag3基因缺陷能夠使NOD小鼠發(fā)病提前，胰島T細胞浸潤增加[35-36]。但LAG3在不同細胞中發(fā)揮的作用并不相同，據(jù)報道，CD4+T細胞、CD8+T細胞以及Tr1上LAG3表達增加與自發(fā)性糖尿病發(fā)病延遲有關(guān)，而Treg上LAG3的表達卻限制了其增殖，加速自身免疫的進展[37-39]。此外，NOD小鼠血清中sLAG水平與疾病進展正相關(guān)，或可作為疾病監(jiān)測重要指標[40]。然而目前為止，LAG3與T1DM的研究僅限于動物實驗，還需更多臨床實驗數(shù)據(jù)加以支持。

4.4LAG3與類風濕關(guān)節(jié)炎 作為常見的慢性全身性自身免疫病，類風濕關(guān)節(jié)炎主要表現(xiàn)為對稱性關(guān)節(jié)炎性病變，并隨疾病進展，累及心、眼、肺、腎等多個器官。其中，LAG3+Treg在該病中扮演重要的角色，不僅可指示疾病預(yù)后，還發(fā)揮重要負向調(diào)節(jié)作用。有學者指出，類風濕關(guān)節(jié)炎患者疾病活動指數(shù)越高，LAG3+Treg比例越低；在疾病發(fā)生展過程中，LAG3+FOXP3-Treg和Tr1均可通過分泌IL-10，減少自身抗體的產(chǎn)生，抑制關(guān)節(jié)炎癥[41-43]。這些研究表明，通過藥物誘導類風濕關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)LAG3+Treg的產(chǎn)生或許是疾病治療行之有效的方法。

4.5LAG3與銀屑病 銀屑病，又稱牛皮癬，是一種慢性復發(fā)性皮膚炎癥疾病，典型表現(xiàn)為紅色斑塊伴有鱗屑，其發(fā)病與結(jié)締組織內(nèi)異常T淋巴細胞浸潤有關(guān)。LAG3在銀屑病中發(fā)揮的作用并不清楚，但針對LAG3藥物顯示出良好效果。Poirier等發(fā)現(xiàn)向猿猴靜脈注射LAG3嵌合抗體A9H11能夠防止T細胞驅(qū)動的皮膚炎癥[44]，提出LAG3單抗治療銀屑病的可能性。隨后，靶向自身反應(yīng)性T細胞表面LAG3的抗體—GSK2831781正式進入臨床試驗[45]，結(jié)果表明，該抗體能夠有效改善銀屑病患者臨床癥狀，揭示LAG3在自身免疫病治療中的巨大潛力。

4.6LAG3與其他自身免疫病 在炎癥性腸病研究中，發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)Treg可通過LAG3分子與CX3CR1+巨噬細胞表面MHC-Ⅱ結(jié)合，減少IL-23和IL-1β的產(chǎn)生，預(yù)防結(jié)腸炎[46]。而在Hg誘導的自身免疫病模型中，lag3基因的缺陷使小鼠喪失自身免疫耐受，對疾病的易感性增加[47]。這些都表明LAG3作為抑制性受體對自身免疫病調(diào)節(jié)有重要意義，仍需進一步研究。

5 LAG3在自身免疫病中檢測與應(yīng)用

5.1lag3基因多態(tài)性的檢測lag3基因多態(tài)性不僅與自身免疫病的易感性相關(guān)，也影響著疾病臨床特征[26]。常見的基因多態(tài)性檢測方法包括序列特異性引物PCR技術(shù)(PCR amplification with sequence specific primers, SSP-PCR)、擴增阻滯突變系統(tǒng)PCR(amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR)、限制性片段長度多態(tài)性PCR(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)和Mass-Array，其中，以Mass-Array法應(yīng)用最為普遍。該法是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)技術(shù)，將PCR擴增后的核酸產(chǎn)物電離成單電荷離子，使其在電場的作用下加速通過飛行管道，從而根據(jù)飛行時間分析基因型信息。與其他檢測方法相比，Mass-Array不能檢測未知突變，但靈敏度高、檢測速度快、高通量、結(jié)果可靠等優(yōu)點使其應(yīng)用更加廣泛。

5.2LAG3表達的檢測 與正常人相比，自身免疫病患者LAG3表達水平降低，且與疾病進展相關(guān)，檢測外周血中免疫細胞LAG3表達情況有助于指示疾病預(yù)后，評價藥物療效，其常見方法有實時熒光定量PCR(RT-qPCR)和流式細胞術(shù)。RT-qPCR在RNA水平通過實時監(jiān)測熒光信號的變化分析基因的表達情況，而流式細胞術(shù)則通過檢測細胞表面熒光標記單克隆抗體結(jié)合情況，在蛋白質(zhì)水平上計算目的細胞數(shù)目及比例。2種方法均具有良好的特異性和準確性，但與RT-qPCR相比，流式細胞術(shù)不需要提取RNA，細胞樣本可直接進行檢測，更加簡便、快速。

5.3血清LAG3的檢測 血清中LAG3水平升高可作為自身免疫病的輔助診斷策略。ELISA是檢測血清LAG3常用方法，其基本原理是依賴抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶促反應(yīng)的專一性，使得底物顯色程度與待測分子含量呈正相關(guān)。ELISA可分為直接法和間接法，其中直接法耗時少，更為快速，但信號放大程度有限；間接法靈敏度增加，且同種酶標二抗可標記不同的一抗，更加經(jīng)濟、實用。

6 小結(jié)和展望

隨著自身免疫病的研究深入，發(fā)現(xiàn)LAG3是建立和維持自身免疫耐受性過程中不可或缺的分子，在固有免疫和適應(yīng)性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，可作為自身免疫病治療和診斷的潛在靶點。然而，在免疫細胞中，LAG3下游的信號通路并不完全清楚，不同細胞表達LAG3的功能也不盡相同，激活還是抑制LAG3受體，以及如何準確靶向LAG3表達的目的細胞是值得思考的問題。