13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株分子生物學(xué)特征分析*

李康，黃洋，石繼春，王春娥，徐瀟，陳瓊，趙丹，葉強(qiáng)

(中國食品藥品檢定研究院生物制品檢定所細(xì)菌多糖和結(jié)合疫苗室，中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，北京 102629)

肺炎鏈球菌是引起兒童肺炎球菌性疾病的主要病原菌，其感染可引起急性中耳炎、鼻竇炎、肺炎、腦膜炎、菌血癥等[1]。根據(jù)莢膜多糖抗原的不同，肺炎鏈球菌可以分為90多個(gè)血清型[2]。肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株是研制肺炎鏈球菌疫苗及診斷試劑重要的原材料，因此肺炎鏈球菌的質(zhì)量控制至關(guān)重要。傳統(tǒng)的肺炎鏈球菌質(zhì)量控制方法如培養(yǎng)特性、染色鏡檢、生化反應(yīng)、膽汁溶菌試驗(yàn)、奧普托欣試驗(yàn)、莢膜腫脹試驗(yàn)等在肺炎鏈球菌的分離、鑒定和質(zhì)量控制中發(fā)揮了重要的作用[3-4]，但部分菌株缺乏相關(guān)的分子生物學(xué)數(shù)據(jù)，無法準(zhǔn)確分辨菌株之間的差異，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有待進(jìn)一步提升。因此，本研究主要針對(duì)中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections, CMCC)保藏的13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株，在傳統(tǒng)質(zhì)量檢定的基礎(chǔ)上，進(jìn)行16S rRNA基因分析和多位點(diǎn)序列分型(multilocus sequence type, MLST)，補(bǔ)充這些菌株分子生物學(xué)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，為進(jìn)一步完善肺炎鏈球菌的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1菌種 13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC(B)31001、31439、31447、31456、31477、31495、31510、31547、31310、31228、31687、31761和31267來源于CMCC。

1.2主要儀器與試劑 NU-5810E型CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE公司)，BX-51型生物顯微鏡(OLYMPUS公司)，microTyper MS飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(江蘇天瑞公司)，PTC-0200型基因擴(kuò)增儀、powerpac型電泳儀電源、Gel Doc XR+型凝膠成像分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。哥倫比亞血瓊脂(BD公司)，肺炎鏈球菌分型血清或因子血清(丹麥血清學(xué)研究所)，細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(Tiangen公司)，Premix Taq和DL2000(TaKaRa公司)，PCR引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3培養(yǎng)特性及顯微形態(tài)觀察 13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線于含5%羊血的哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃、5% CO2倒置培養(yǎng)過夜，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行革蘭染色觀察菌株的顯微形態(tài)。

1.4血清凝集試驗(yàn) 在潔凈的載玻片上，取少量過夜培養(yǎng)的新鮮菌苔與適量生理鹽水混合制備菌懸液。分別與等量的肺炎鏈球菌分型血清或因子血清混勻，放置片刻，出現(xiàn)明顯凝集現(xiàn)象的判定為陽性(+)，呈均勻渾濁現(xiàn)象的為陰性(-)，以生理鹽水作為對(duì)照。

1.5質(zhì)譜鑒定 菌種經(jīng)過夜培養(yǎng)后，參照參考文獻(xiàn)[5]中所述直涂法進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。譜圖分析得分大于2.0，鑒定結(jié)果達(dá)到種水平置信。

1.6肺炎鏈球菌分子質(zhì)控方法

1.6.1DNA的提取 肺炎鏈球菌經(jīng)過夜培養(yǎng)后，刮取菌體。參照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.216S rRNA基因分析 參照文獻(xiàn)[6]，以提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rRNA基因序列。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物公司進(jìn)行Sanger法測序。測序使用ABI 3730XL測序儀及其配套試劑。將測序結(jié)果與EZ BioCloud(https://www.ezbiocloud.net/identify)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)分析，并應(yīng)用MEGA軟件將測序結(jié)果序列與肺炎鏈球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列(LN831051)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.6.3MLST 參照文獻(xiàn)[6]，以提取的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增7種管家基因aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt和ddl。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物公司進(jìn)行Sanger法測序。測序使用ABI 3730XL測序儀及其配套試劑。將測序得到的基因序列與肺炎鏈球菌MLST數(shù)據(jù)[7]進(jìn)行比對(duì)，獲得等位基因編號(hào)(或者申請(qǐng)新的編號(hào))，所有等位基因編號(hào)組成菌株最終的基因序列型ST(aroE-gdh-gki-recP-spi-xpt-ddl)或申請(qǐng)新的ST編號(hào)。

2 結(jié)果

2.1培養(yǎng)特性及顯微形態(tài)觀察 13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株經(jīng)培養(yǎng)過夜后，菌落形態(tài)均呈圓形、濕潤、灰白色或灰色，并且有草綠色的α溶血現(xiàn)象。革蘭染色符合肺炎鏈球菌的特征，革蘭染色陽性，呈雙球或短鏈狀排列。圖1所示為菌株CMCC(B)31228菌落形態(tài)和革蘭染色結(jié)果。

圖1 CMCC(B)31228菌落形態(tài)(左)和革蘭染色(右)結(jié)果

2.2血清凝集試驗(yàn) 結(jié)果顯示，除CMCC(B)31228和CMCC(B)31267外，其余11株肺炎鏈球菌均與相應(yīng)的肺炎鏈球菌分型血清或因子血清產(chǎn)生凝集反應(yīng)。CMCC(B)31228顯示15b-、15c+、15e-、15h-的凝集結(jié)果，型別判定為15A型。CMCC(B)31267顯示35a+、35b-、35c+、29b+、42a-的凝集結(jié)果，型別判定為35B型。見表1。

2.3質(zhì)譜鑒定 13株菌株質(zhì)譜鑒定結(jié)果均為肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，且分值在2.08～2.32之間，鑒定準(zhǔn)確度高，見表1。圖2所示為CMCC(B)31001質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

圖2 CMCC(B)31001質(zhì)譜鑒定結(jié)果

表1 13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的血清凝集及質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.416S rRNA基因分析 13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA經(jīng)16S rRNA基因特異性引物擴(kuò)增后均擴(kuò)增出預(yù)期大小約1 500 bp的16S rRNA基因片段，與EZ BioCloud數(shù)據(jù)庫比對(duì)后，與肺炎鏈球菌模式株NCTC 7465的16S rRNA基因序列(LN831051)的相似性均在99.00%以上，系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，CMCC(B)31439和CMCC(B)31456與肺炎鏈球菌模式株NCTC 7465同屬于一個(gè)分支，其他11株肺炎鏈球菌屬于另一分支，見圖3。

圖3 13株肺炎鏈球菌菌株與模式菌株16S rRNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.5MLST分型 13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株共分為13個(gè)ST型，分別為ST2296、ST180、ST2759、ST3844、ST12973、ST12977、ST3545、ST16632、ST875、ST10189、ST870、ST342和ST7234。菌株CMCC(B)31547的ST16632為新發(fā)現(xiàn)的ST型。

3 討論

CMCC保藏有大量不同時(shí)期收集的不同型別的肺炎鏈球菌國家標(biāo)準(zhǔn)菌種，這些菌種常被用于教學(xué)、科研、質(zhì)量控制、疫苗研發(fā)以及診斷試劑參考品研制等。因此，確保肺炎鏈球菌國家標(biāo)準(zhǔn)菌種質(zhì)量穩(wěn)定、可靠、可溯源具有重要意義。傳統(tǒng)的質(zhì)量控制方法已被廣泛應(yīng)用于肺炎鏈球菌的分離、鑒定和質(zhì)量控制[3]，但傳統(tǒng)方法主要以區(qū)分菌株的表型差異為主，不能很好地區(qū)分相同表型的不同菌株之間的差別。近年來，16S rRNA基因分析、PCR血清分型、MLST分型、PFGE分型和基因組測序等分子生物學(xué)技術(shù)在多種病原微生物的質(zhì)量控制和溯源分析中都發(fā)揮了重要作用，是傳統(tǒng)菌株質(zhì)量控制方法的有力補(bǔ)充[6,8-11]。本研究采用培養(yǎng)特性、染色鏡檢、血清學(xué)試驗(yàn)和質(zhì)譜鑒定方法對(duì)CMCC保藏的13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行初步質(zhì)量復(fù)核，進(jìn)一步測定了菌株的16S rRNA基因序列，結(jié)果顯示16S rRNA基因分析結(jié)果與質(zhì)譜鑒定結(jié)果一致。與質(zhì)譜鑒定方法一樣，雖然測定16S rRNA基因序列能很方便地鑒定菌株是否為肺炎鏈球菌，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，但是無法區(qū)分不同型別的肺炎鏈球菌，在肺炎鏈球菌菌株的溯源中存在一定的局限。

MLST分型方法因具有很高的分辨能力，易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化和不同實(shí)驗(yàn)室間的對(duì)比分析，已成為研究分子進(jìn)化和分子流行病學(xué)的重要手段[12]。本研究對(duì)13株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的MLST分型結(jié)果顯示，共分為13個(gè)ST型，說明肺炎鏈球菌的MLST序列呈現(xiàn)良好的多樣性和辨識(shí)度，可以作為一種分子標(biāo)簽用于不同型別肺炎鏈球菌菌株的鑒定和溯源分析。有研究報(bào)道，11A、15A、35B和23A等多藥耐藥的肺炎鏈球菌血清型有增加的趨勢[13]。國內(nèi)疫苗研發(fā)企業(yè)也在考慮將24F和35B型用于多價(jià)肺炎球菌結(jié)合疫苗的研發(fā)[14]。本研究前瞻性地對(duì)CMCC保藏的15A型和35B型肺炎鏈球菌進(jìn)行了檢定和分析，獲得了15A型菌株CMCC(B)31228和35B型菌株CMCC(B)31267的16S rRNA基因序列和MLST分型數(shù)據(jù)。

綜上，本研究獲得了13株不同型別的肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的16S rRNA基因序列信息和MLST分型數(shù)據(jù)，完善了肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的檔案信息，為肺炎鏈球菌菌株溯源和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善提供了數(shù)據(jù)支撐。