超聲輔助離子液體提取葡萄籽中蛋白質(zhì)的方法研究

●劉彥峰 李 霞

（1.甘肅莫高實(shí)業(yè)發(fā)展股份有限公司 甘肅 武威 733008；2.甘肅畜牧工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院 甘肅 武威 733008）

葡萄是世界上種植最廣泛的水果之一，全世界年產(chǎn)量超過(guò)690億千克［1］，果實(shí)可釀酒。釀制葡萄酒的主要副產(chǎn)品是葡萄渣，占葡萄總重量的13%，其中含有38%～52%（以干物質(zhì)計(jì)）的葡萄籽。有研究發(fā)現(xiàn)，葡萄籽蛋白質(zhì)提取物可作為一種有價(jià)值的葡萄酒澄清劑［2］。但大多數(shù)葡萄籽被當(dāng)作廢料處理。由于葡萄籽蛋白質(zhì)具有與其他油籽和谷物相似的營(yíng)養(yǎng)特性，越來(lái)越多的學(xué)者考慮如何利用葡萄籽蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。此外，葡萄籽蛋白質(zhì)具有良好的溶解性和乳化活性，也可用于食品的生產(chǎn)開(kāi)發(fā)［3］，應(yīng)用前景 廣闊。

隨著生物技術(shù)的發(fā)展，蛋白質(zhì)提取方法越來(lái)越多。堿性提取法作為一種常規(guī)方法，其工藝簡(jiǎn)單，但蛋白質(zhì)提取率和效率較低，限制了其應(yīng)用。近年來(lái)，食品工業(yè)在提高各種來(lái)源的蛋白質(zhì)提取率方面作出了巨大努力。超聲波技術(shù)在蛋白質(zhì)提取方面顯示出優(yōu)勢(shì)，這是由于其能夠通過(guò)促進(jìn)質(zhì)量傳遞和由于聲空化的影響可能導(dǎo)致的細(xì)胞壁破裂來(lái)增強(qiáng)提取功效。超聲波是一種安全、廉價(jià)、可重復(fù)和可靠、無(wú)創(chuàng)和環(huán)境友好的技術(shù)，還能大大提高生物活性水解物的酶效率和活性。離子液體是一種新型綠色的萃取分離體系，具有黏度低、不易乳化、得率高、萃取化合物范圍廣、反應(yīng)條件溫和等 優(yōu)點(diǎn)［4,5］。

本研究通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)超聲波輔助離子液體提取葡萄籽蛋白質(zhì)各參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，為葡萄籽蛋白質(zhì)進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

葡萄籽由甘肅莫高實(shí)業(yè)發(fā)展股份有限公司提供，［Bmim］Cl購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%），牛血清白蛋白購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；濃鹽酸，1 mol/L的NaOH，考馬斯亮藍(lán)G-250等皆為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

微型植物試樣粉碎機(jī)（河北省黃驊市中興儀器有限公司）；HH-2數(shù)顯超級(jí)恒溫水浴鍋（深圳市唯品精密儀器有限公司）；H0503型電子天平（邢臺(tái)智冠機(jī)械科技有限公司）；GD820HT小型超聲波清洗器（深圳市光點(diǎn)超聲波設(shè)備有限公司）；6-10R高速離心機(jī)冷凍離心機(jī)（湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司）；752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（濟(jì)南 好來(lái)寶醫(yī)療器材有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 脫脂葡萄籽粉末的制備將葡萄籽粉碎后用正己烷/乙醇（體積比3∶1）在40℃下持續(xù)攪拌6 h脫脂，脫脂溶劑每2 h更換一次。通過(guò)過(guò)濾處理的葡萄籽粉末在室溫下晾干備用。

1.3.2 離子液體提取葡萄籽蛋白質(zhì)將脫脂葡萄籽粉末與一定濃度的［Bmim］Cl按照一定料液比混合后，采用一定功率超聲波處理一定時(shí)間后，過(guò)濾取上清液，采用Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，按照以下公式計(jì)算蛋白質(zhì)得率：

其中m1為上清液中蛋白質(zhì)質(zhì)量；m2為加入的葡萄籽粉末的質(zhì)量；V1為測(cè)上清液中蛋白質(zhì)含量時(shí)的上清液體積；V2為總上清液體積。

1.3.3 單因素試驗(yàn)采用超聲波輔助離子液體提取葡萄籽中蛋白質(zhì)。分別評(píng)價(jià)［Bmim］Cl濃度（20%、25%、30%、35%、40%、45%）， 料液 比［1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 （g/mL）］，pH值（2、4、6、8、10），超 聲 功 率 （20 W、30 W、40 W、50 W、60 W、70W），超聲溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃），超聲時(shí) 間（3 min、5 min、7 min、9 min、11 min）對(duì)蛋白質(zhì)得率的影響，以獲得蛋白質(zhì)提取率的最 大值。

1.3.4 正交試驗(yàn)以［Bmim］Cl濃度、料液比、超聲功率、pH為變量，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定變量的最佳組合。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)，見(jiàn) 表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 [Bmim]Cl濃度對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)得率的影響在料液比為1∶25（g/mL）、pH為6、超聲功率為40 W、超聲溫度為30℃、超聲時(shí)間為5 min的條件下，改變［Bmim］Cl濃度，對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)得率的影響如圖1所示。

如圖1所示，蛋白質(zhì)得率隨［Bmim］Cl濃度的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)。離子液體溶液的濃度對(duì)細(xì)胞壁的溶脹和破壞以及提取液的傳質(zhì)過(guò)程有很大影響，能直接決定萃取劑對(duì)目標(biāo)化合物的提取效率。此外，當(dāng)離子液體的濃度超過(guò)一定值時(shí)，黏度過(guò)高的萃取劑會(huì)阻礙目標(biāo)化合物從葡萄籽粉末到溶液的分散［6］，從而使傳質(zhì)過(guò)程更加困難，因此，［Bmim］Cl濃度以35% 為宜。

2.1.2 料液比對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)得率的影響

由圖2可知，葡萄籽蛋白質(zhì)得率隨料液比的減小呈先增加后平緩的趨勢(shì)。這可能是因?yàn)榱弦罕鹊臏p小促使葡萄籽粉末與液體接觸更加完全，使得蛋白質(zhì)更容易溶于提取液中；但當(dāng)料液比過(guò)小時(shí)，葡萄籽蛋白質(zhì)均已溶于離子液體中，蛋白質(zhì)得率不發(fā)生明顯變化。故料液比為1∶30時(shí) 蛋白質(zhì)得率最佳。

2.1.3 pH對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)得率的影響一定濃度離子液體溶液的pH是影響蛋白質(zhì)提取效果的一個(gè)重要因素。結(jié)果表明，隨著萃取劑pH值的增加，對(duì)蛋白質(zhì)選擇性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)（圖3），這是蛋白質(zhì)與離子液體間是氫鍵和靜電相互作用的結(jié)果［6］。此外，由于萃取劑在調(diào)節(jié)其酸堿度之前是酸性的，當(dāng)萃取劑的堿性過(guò)強(qiáng)時(shí)，大量離子液體會(huì)從溶液中沉淀出來(lái)，進(jìn)而影響萃取效果。因此，將離子液體溶液pH調(diào)節(jié)至6 為宜。

2.1.4 超聲功率對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)得率的影響

由圖4可知，隨著超聲功率的增加，析出的葡萄籽蛋白質(zhì)也就更多；當(dāng)超聲功率為40 W時(shí)，蛋白質(zhì)得率達(dá)到最大值；但當(dāng)超聲功率太大時(shí)，部分蛋白質(zhì)可能會(huì)變性［7］，與不溶物一起被離心除去。因此，最優(yōu)超聲功率為40 W。

2.1.5 超聲溫度對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)得率的影響

由圖5可知，超聲溫度在20～35℃范圍內(nèi)，葡萄籽蛋白質(zhì)得率逐漸升高，之后蛋白質(zhì)得率隨超聲溫度繼續(xù)升高而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。這可能與溫度提高后，蛋白質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)加速促使其結(jié)構(gòu)拓展［8］，從而可以更快地從原料中分離蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)提取率有關(guān)。但過(guò)高的提取溫度會(huì)引起蛋白質(zhì)變性和凝膠化，對(duì)蛋白質(zhì)提取產(chǎn)生不利影響。因此，最適宜的超聲溫度為35℃。

2.1.6 超聲時(shí)間對(duì)葡萄籽蛋白質(zhì)得率的影響

由圖6可知，超聲時(shí)間從3 min到11 min， 葡萄籽蛋白質(zhì)得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為7 min時(shí)，蛋白質(zhì)得率達(dá)到最高值。說(shuō)明適當(dāng)延長(zhǎng)超聲時(shí)間有利于增加蛋白質(zhì)的傳質(zhì)效果。超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)提取率降低，這與蛋白質(zhì)聚集和變性有關(guān)［9］。

2.2 正交試驗(yàn)

在利用超聲輔助［Bmim］Cl提取葡萄籽蛋白質(zhì)的單因素試驗(yàn)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行L9（34）的正交試驗(yàn)，對(duì)提取蛋白質(zhì)的最佳工藝進(jìn)行探討。正交試驗(yàn)分析，見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，［Bmim］Cl濃度極差R值最大，說(shuō)明其對(duì)蛋白質(zhì)提取的率影響最為重要，其次為料液比、超聲功率、pH值；依據(jù)各因素K值大小，最優(yōu)組合為A2B1C2D3；在此最優(yōu)條件下進(jìn)行多次重復(fù)試驗(yàn)，葡萄籽蛋白質(zhì)的平均得率高于正交試驗(yàn)中的任一組合，最高達(dá)9.626 mg/g。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了一種超聲輔助離子液體提取葡萄籽蛋白質(zhì)的方法，按照料液比1∶25比例加入35%的［Bmim］Cl，在pH為7、超聲功率為50 W條件下，葡萄籽蛋白質(zhì)的得率為9.626 mg/g，可為葡萄籽蛋白質(zhì)功能特性的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。