釀酒酵母耐酸發(fā)酵能力的研究分析

常 煦，張小龍，聶文強，許引虎，廖 蓓，3，李志軍，2

（1.安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003；2.湖北省酵母功能重點實驗室，湖北宜昌 443003；3.安琪酵母（睢縣）有限公司，河南商丘 476900）

酸是關乎白酒風味和白酒釀造的重要因素，酒中的酸是白酒風味重要的組成成分，是白酒風味的基礎骨架[1-2]，白酒中的酸基本都來源于酒醅，一般是通過蒸餾方式帶入到酒體當中，所以酒醅中的酸是重要的監(jiān)控和參考指標[3-4]。白酒廠將酒醅的酸度作為重要衡量指標的另一個重要原因，是酸度是白酒發(fā)酵情況的顯示指標，一般來講，在同等合理條件下，高酸醅出酒要低于低酸醅；高酸醅酒質(zhì)要高于低酸醅；發(fā)酵時間長酸度會增加；隨著環(huán)境溫度升高，酒醅酸度增高[5]。這些都是白酒釀造的規(guī)律。從本質(zhì)上講，就是酒醅中的酸會影響發(fā)酵過程中微生物的變化和能力。

原料的出酒是酸的核心影響指標，因此在不少研究當中，都將耐酸微生物的篩選作為關鍵點進行研究，并取得了很好的效果[6-7]。然而，筆者在實際生產(chǎn)過程中發(fā)現(xiàn)，不同地域、不同酒種的發(fā)酵體系中，即便酒醅酸度一致，同樣還存在明顯的發(fā)酵差異[8]，因此通過本輪研究，探究酸對核心酒化微生物酵母的影響，希望對釀酒同仁在日后的生產(chǎn)過程中有一些指導意義并可作為一些發(fā)酵問題的排查依據(jù)。

為了更好、更方便的對結果進行判定，本次研究采用液態(tài)方式對酸度模擬進行了設計。

絕大多數(shù)白酒公司采用的是酸堿中和經(jīng)典化學滴定方法來測量酒醅中的酸度，即以100 g 酒醅滴定消耗的氫氧化鈉的毫克分子數(shù)來表示[9]，因此我們將100 g 酒醅按照100 mL 發(fā)酵液來代替，由于酒醅中的主要酸為乳酸、乙酸、己酸均為一元酸，因此在本次研究中，以100 mL 為單位，其中的酸度均按照如0.3～6 mmol/100 mL進行配制。

在目標酸的選擇上，本次研究集中在乳酸、乙酸、己酸上，其中，在一些研究中已經(jīng)確認乳酸、乙酸為發(fā)酵中的主體酸，有文獻報道乳酸、乙酸、檸檬酸占了總酸量的95%以上，另外選取己酸作為考慮，因為己酸在濃香型白酒中占有重要地位，是濃香型白酒形成的基礎條件之一，也是發(fā)酵體系中存在的確定酸類[10-11]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

酵母：安琪耐高溫釀酒高活性干酵母，由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。

試劑：乳酸、乙酸、己酸均為分析純，購于國藥試劑有限公司；發(fā)酵營養(yǎng)劑FN502（酵母浸出物），蔗糖均由安琪酵母股份有限公司生產(chǎn)。

儀器設備：500 mL 三角瓶、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平。

1.2 實驗步驟

發(fā)酵液制備：將20 g 酵母浸出物，200 g 蔗糖定容到1 L，115 ℃滅菌15 min；待培養(yǎng)基冷卻后，按照3～60 mmol 的不同酸的物質(zhì)的量進行換算添加，最終形成需要的酸度的發(fā)酵液。

酵母添加：按照發(fā)酵液體積的1‰的干酵母進行直接添加，如1 L發(fā)酵液中，添加活性干酵母1 g。

發(fā)酵跟蹤：加入酵母起始，每隔24 h，對發(fā)酵體系重量進行稱量并記錄，通過每日的失重來判斷發(fā)酵過程及速率。

2 結果與分析

2.1 在不同種類酸條件下的耐受實驗

分別配制4 mmol/100 mL 以及6 mmol/100 mL的乳酸、己酸、乙酸發(fā)酵液250 mL，按照預設實驗發(fā)酵結果如表1所示。

表1 在不同種類酸條件下釀酒酵母的發(fā)酵失重 (g)

從表1 可以發(fā)現(xiàn)，在我們所設置的酸度梯度上，實際上乳酸、乙酸在該濃度條件下，幾乎對酵母沒有產(chǎn)生明顯抑制作用。而己酸在這兩個濃度梯度條件下，酵母的發(fā)酵幾乎被完全抑制，整個體系的發(fā)酵無法正常進行。

2.2 在不同濃度己酸條件下的發(fā)酵性能差異

分別配制2 mmol/100 mL、1 mmol/100 mL、0.5 mmol/100 mL 的己酸發(fā)酵培養(yǎng)液，按照預設發(fā)酵步驟進行，結果如表2所示。

表2 在不同濃度己酸發(fā)酵液下酵母發(fā)酵失重表(g)

本組研究基本可以判定，在乳酸、乙酸、己酸這3 類酸中，在合理濃度范圍控制下，己酸對于酵母的抑制性是非常強的，相比于最高6 mmol/100 mL條件下，乙酸、乳酸對酵母的影響，在1 mmol/100 mL條件下，己酸已經(jīng)對酵母產(chǎn)生很大的影響，在11 d的發(fā)酵周期內(nèi)，發(fā)酵減緩50%以上，體系無法發(fā)酵完全。另外在0.5 mmol/100 mL 濃度條件下，發(fā)酵已經(jīng)出現(xiàn)明顯遲緩，但通過11 d 的發(fā)酵周期，依然可以發(fā)酵完全。

2.3 在混酸條件下釀酒酵母的發(fā)酵性能變化

在前期研究基礎上，已經(jīng)說明在單乳酸4 mmol/100 mL 以及單己酸0.5 mmol/100 mL 發(fā)酵環(huán)境下，釀酒酵母可以順利完成發(fā)酵，而一般白酒發(fā)酵環(huán)境是一個混合酸環(huán)境，因此，設定以4 mmol/100 mL的乳酸為背景酸，另外添加0.5 mmol/100 mL 和1 mmol/100 mL的己酸，在混合酸條件下，查看酵母的發(fā)酵性能，見表3。

表3 混酸發(fā)酵失重數(shù)據(jù) (g)

本次實驗出現(xiàn)與預計完全不同的結果，在單酸條件下，無論0.5 mmol/100 mL還是1 mmol/100 mL，都可以進行發(fā)酵，而在4 mmol/100 mL 的單乳酸條件下，也可以完成發(fā)酵，而當這兩種酸疊加到一起后，發(fā)現(xiàn)在酵母抑制方面出現(xiàn)了明顯加強，本輪實驗條件下，在這兩個混酸條件下，幾乎完全抑制了酵母的發(fā)酵性能。

2.4 以4 mmol/100 mL 乳酸為底酸的己酸耐受度尋找

通過對混酸的了解，發(fā)現(xiàn)在混酸發(fā)酵條件下，對酵母的酒精發(fā)酵性能抑制有顯著增強，因此在2.3 研究的基礎上進一步對己酸濃度加成后的抑制濃度進行梯度發(fā)酵，尋找在4 mmol/100 mL 乳酸發(fā)酵條件下，酵母對己酸的耐受能力。由此設計以4 mmol/100 mL 乳酸為底酸，額外添加0.3 mmol/100 mL、0.4 mmol/100 mL、0.5 mmol/100 mL己酸的混酸發(fā)酵模型，如表4所示。

表4 混酸發(fā)酵失重數(shù)據(jù) （g）

本次發(fā)現(xiàn)了一個有趣的現(xiàn)象，當在混酸條件下，實際上己酸對酵母的抑制性有了顯著加強，在本次研究中，以4 mmol/100 mL乳酸為底酸的情況下，酵母對于額外己酸的耐受性在0.3～0.4 mmol/100 mL區(qū)間當中。

3 結論

本研究中，以白酒釀造中常見的3 種酸為底物，查驗了釀酒酵母在不同酸條件下的發(fā)酵能力，發(fā)現(xiàn)在所設計的發(fā)酵環(huán)境條件下，釀酒酵母對乳酸、乙酸的耐受度較高，而在有己酸條件下，會急劇抑制酵母的發(fā)酵性能。且在本次研究中發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象，當在單酸條件下，酵母在1 mmol/100 mL 己酸濃度發(fā)酵體系下可以進行發(fā)酵，只是發(fā)酵出現(xiàn)了明顯的遲緩和不完全，而如果在有4 mmol/100 mL的乳酸濃度下，混合己酸后，對酵母的抑制顯著增強，研究顯示，在該乳酸濃度條件下，酵母額外能耐受己酸的濃度下降到0.3～0.4 mmol/100 mL 區(qū)間。介于中國傳統(tǒng)白酒發(fā)酵是一個混酸發(fā)酵體系，該研究對于白酒生產(chǎn)跟蹤，白酒生產(chǎn)問題排查具有一定的指導意義。