GC-MS/MS法測(cè)定芹菜中毒死蜱殘留量不確定度評(píng)定

王金翠

（黑龍江省天潤(rùn)檢驗(yàn)檢測(cè)研究院有限公司，黑龍江哈爾濱 150009）

近年來(lái)，伴隨著農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的高速發(fā)展，農(nóng)藥殘留問(wèn)題已成為影響人們生活質(zhì)量的重大問(wèn)題，農(nóng)藥施用后殘存于周?chē)寥兰八w環(huán)境中，不僅會(huì)毒害藻類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等水生生物，農(nóng)藥原藥或其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝物還會(huì)通過(guò)食物鏈間接進(jìn)入人體，影響人體健康[1-2]。毒死蜱是一種毒性強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)，且被廣泛用于芹菜、菠菜等葉菜類(lèi)蟲(chóng)害防治的有機(jī)磷類(lèi)殺蟲(chóng)劑，芹菜中毒死蜱殘留量的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量為不得超過(guò)0.05 mg/kg，從近些年國(guó)家監(jiān)督抽檢結(jié)果中不難發(fā)現(xiàn)，芹菜中毒死蜱超量使用問(wèn)題屢見(jiàn)不鮮，在實(shí)際的檢測(cè)工作中，樣品檢出結(jié)果在國(guó)家規(guī)定限量值附近是比較常見(jiàn)的問(wèn)題，此時(shí)對(duì)檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確度進(jìn)行更為科學(xué)的評(píng)價(jià)尤為重要[3-5]。自1999年我國(guó)首次將測(cè)量不確定度評(píng)定納入計(jì)量技術(shù)規(guī)范以來(lái)，其在檢驗(yàn)檢測(cè)行業(yè)的應(yīng)用逐漸開(kāi)展，目前，RB/T214—2017、CNAS-CL01：2018等檢測(cè)、校準(zhǔn)準(zhǔn)則中均要求在數(shù)據(jù)出現(xiàn)臨界值時(shí)，需要對(duì)檢驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)量不確定度評(píng)定[6-11]。本研究建立的GC-MS/MS法測(cè)定芹菜中毒死蜱殘留量的方法，具有較好的選擇性和靈敏度，并可適用于復(fù)雜樣品的分析，在建立檢驗(yàn)方法的基礎(chǔ)上，參考相關(guān)規(guī)范和指南[12-14]對(duì)芹菜中毒死蜱殘留量測(cè)定進(jìn)行不確定度評(píng)定，確定影響結(jié)果的主要不確定度分量，為檢測(cè)數(shù)據(jù)的可靠性提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GC-MS/MS 7000D氣相色譜三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；均質(zhì)器，上海精科；離心機(jī)H1850，湖南湘儀；十萬(wàn)分之一電子天平MS105DU，梅特勒-托利多；AUY120型電子天平，島津菲律賓工廠；移液器（20 μL），Eppendorf。

毒死蜱對(duì)照品（純度為99.7%），SITAER；環(huán)氧七氯B對(duì)照品（濃度為100 μg/mL，溶劑為正己烷），信陽(yáng)市中檢計(jì)量生物科技有限公司；乙腈（色譜純），霍尼韋爾；乙酸乙酯（色譜純），霍尼韋爾；無(wú)水硫酸鎂、乙酸鈉，天津博納艾杰爾；凈化管（含1.2 g硫酸鎂、0.4 g PSA），天津博納艾杰爾；氯化鈉（優(yōu)級(jí)純），默克；芹菜為市售品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液。稱(chēng)取毒死蜱對(duì)照品0.010 03 g置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為100 μg/mL的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)使用液。吸取內(nèi)標(biāo)溶液0.50 mL置10 mL量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為5.00 μg/mL的環(huán)氧七氯B內(nèi)標(biāo)使用液。

標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。吸取毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL置100 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為1.00 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，從中分別吸取0.50 mL、1.00 mL、5.00 mL、10.00 mL和20.00 mL于10 mL容量瓶中，加乙酸乙酯稀釋為5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

基質(zhì)工作溶液。將空白基質(zhì)溶液氮?dú)獯蹈?，加?0 μL內(nèi)標(biāo)使用溶液，分別加1 mL的5.00 ng/mL、10.00 ng/mL、50.00 ng/mL、100.00 ng/mL和200.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液復(fù)溶空白基質(zhì)，即得。

1.3 供試品溶液的制備

取芹菜500 g，攪碎均質(zhì)后，混合均勻，精密稱(chēng)取10 g勻漿試樣于50 mL離心管中，精密加入20 mL乙腈，再加入6 g硫酸鎂、1.5 g乙酸鈉、1 g氯化鈉，渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min。取上清液10 mL于凈化管（含1.2 g硫酸鎂、0.4 g PSA），渦旋1 min，8 000 r/min離心5 min，精密取5 mL上清液，于40 ℃水浴中氮?dú)獯抵两?。精密加? mL乙酸乙酯復(fù)溶，加入20 μL內(nèi)標(biāo)使用溶液，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜，待測(cè)定。同時(shí)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析條件

氣相色譜條件。色譜柱：VF1701-ms（0.25 mm×30 m，0.25 μm）；色譜柱溫度：40 ℃保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，再以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持6 min；氦氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式，不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件。離子源：電子轟擊源（EI）；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：280 ℃：溶劑延遲時(shí)間：4 min；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；定性定量離子對(duì)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量模型

式中：X-毒死蜱的含量，mg/kg；c-試樣中毒死蜱的濃度，ng/mL；V-樣液最終定容體積，mL；m-稱(chēng)取試樣的質(zhì)量，g；f-試樣稀釋倍數(shù)。

2.2 測(cè)量不確定度的來(lái)源

根據(jù)建立的測(cè)量模型及樣品的測(cè)定過(guò)程，芹菜中毒死蜱的不確定度引入來(lái)源主要為：①對(duì)照品及對(duì)照品溶液配制urel（S）；②樣品稱(chēng)量urel（M）；③樣品前處理過(guò)程urel（V）；④校準(zhǔn)方法urel（X）；⑤樣品重復(fù)性測(cè)定urel（rep）；⑥空白樣品加標(biāo)回收測(cè)定urel（R）。

2.3 各標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量的評(píng)定

2.3.1 毒死蜱對(duì)照品及其配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（S）的評(píng)定

對(duì)照品及對(duì)照品溶液配制過(guò)程引入的不確定度由對(duì)照品自身不確定度，電子天平稱(chēng)量引入的不確定度，以及標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級(jí)稀釋過(guò)程所用量器引入。

（1）對(duì)照品引入的不確定度ur（S1）。由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)得知，測(cè)量所用毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度為99.7%，擴(kuò)展不確定度為±2.0%，k=2，按照均勻分布，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

（2）對(duì)照品稱(chēng)量引入的不確定度ur（S2）。根據(jù)《電子天平檢定規(guī)程》（JJG 1036—2008）[15]以及方法稱(chēng)量質(zhì)量，對(duì)照品稱(chēng)量所用天平（十萬(wàn)分之一）最大允許誤差為±0.000 005 g，按均勻分布，取包含因子稱(chēng)取的對(duì)照品質(zhì)量為0.010 03 g。

（3）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度ur（S3）。標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程的不確定度主要由所用量器的容量允差以及溫度引起體積變化引入。所用玻璃量器按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）[16]檢定，其容量允差均符合A級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。基質(zhì)曲線(xiàn)配制過(guò)程使用移液器加入內(nèi)標(biāo)，按照《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）檢定，所用移液器（規(guī)格為20 μL），當(dāng)量取體積為20 μL時(shí)其容量允許誤差為4.0%，容量允差即為20 μL×4.0%=0.000 8 mL。

表2 標(biāo)準(zhǔn)工作溶液稀釋配制引入的不確定度

量器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度ur（S3）：

（4）對(duì)照品及對(duì)照品溶液配制過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（S）：

2.3.2 樣品稱(chēng)量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（M）的評(píng)定

樣品測(cè)定過(guò)程中共使用天平（萬(wàn)分之一）稱(chēng)量2次，根據(jù)《電子天平檢定規(guī)章》（JJG 1036—2008）以及方法稱(chēng)量質(zhì)量，天平最大允許誤差為±0.000 15 g，稱(chēng)取的樣品質(zhì)量分別為10.015 1 g、10.007 4 g，按均勻分布，取包含因子

2.3.3 樣品前處理過(guò)程帶來(lái)的不確定度urel（V）評(píng)定

操作過(guò)程所用玻璃量具均為A級(jí)，評(píng)定過(guò)程同2.3.1（3），樣品前處理過(guò)程所用量器及具體不確定度計(jì)算見(jiàn)表3。

表3 樣品前處理過(guò)程所用量器引入的不確定度計(jì)算表

樣品前處理過(guò)程所用量器帶來(lái)的不確定度為：

2.3.4 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）

以標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物濃度比作為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液中待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值的平均值作為縱坐標(biāo)，擬合生成線(xiàn)性回歸方程。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度按照公式4計(jì)算：

式中：p-試樣連續(xù)測(cè)定的次數(shù)；n-標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)；k-回歸系數(shù)；c-試樣平均濃度；c—-標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度平均值；ci-標(biāo)準(zhǔn)溶液各個(gè)工作液濃度；a-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率。其中，SR為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)殘差的標(biāo)準(zhǔn)差，是曲線(xiàn)擬合過(guò)程主要的不確定度來(lái)源，SR計(jì)算見(jiàn)式5：

式中：Yi-標(biāo)準(zhǔn)溶液各個(gè)響應(yīng)值與內(nèi)標(biāo)物響應(yīng)值比值；a-標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率；Xi-標(biāo)準(zhǔn)溶液各點(diǎn)外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)物濃度比值；b-截距；n-標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)。

本研究用內(nèi)標(biāo)法定量，將標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)每個(gè)濃度點(diǎn)進(jìn)樣1次，得到相應(yīng)峰面積之比，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，試驗(yàn)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：Y=12.881 7x+0.148 1，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8，將表4中數(shù)據(jù)代入式4、式5，得ur（X）=0.020 58，SR=0.233 9，芹菜樣品測(cè)定外標(biāo)與內(nèi)標(biāo)濃度之比為1.20，標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（X）=0.017 15。

表4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.3.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（rep）的評(píng)定

樣品測(cè)量重復(fù)性測(cè)定引入的不確定度為A類(lèi)評(píng)定，取待測(cè)樣品，按樣品制備方法重復(fù)進(jìn)行6次測(cè)定，不確定度參照式6計(jì)算，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

2.3.6 空白樣品加標(biāo)回收引入相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（R）的評(píng)定

在6份空白樣品中均加入濃度為1 μg/mL的毒死蜱標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mL，按照上述方法測(cè)定，毒死蜱的回收率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 樣品加標(biāo)回收率

6次回收率測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為S=2.139 7%，回收率平均值R=91.47%，空白基質(zhì)加標(biāo)回收引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算結(jié)果如式7：

2.4 不確定度的合成

影響芹菜中毒死蜱殘留量測(cè)定的各不確定度分量中，對(duì)照品及對(duì)照品溶液配制不確定度最大，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合次之，具體結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 檢測(cè)過(guò)程的相對(duì)不確定分量

按照式8合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.5 擴(kuò)展不確定度U及結(jié)果表示

采用GC-MS/MS測(cè)定芹菜中毒死蜱殘留量，當(dāng)樣品中毒死蜱含量為0.048 mg/kg時(shí)，其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度=0.048 mg/kg×0.030=0.001 44 mg/kg。根據(jù)JJF 1059.1—2012，在95%的置信水平下，取包含因子k=2，擴(kuò)展不確定度U=0.001 44 mg/kg×2=0.003 mg/kg。因此，毒死蜱殘留量可表示為（0.048±0.003）mg/kg，k=2。

3 結(jié)論

本研究通過(guò)對(duì)GC-MS/MS測(cè)定芹菜中毒死蜱殘留量過(guò)程中標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備、樣品的稱(chēng)量、樣品前處理過(guò)程所使用的移液管及容量瓶等量器、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)校準(zhǔn)、樣品重復(fù)性測(cè)定，及空白樣品加標(biāo)回收測(cè)定等不確定度來(lái)源進(jìn)行分析考察，結(jié)果表明，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)擬合引入不確定度最顯著，方法加標(biāo)回收率、樣品前處理過(guò)程及重復(fù)性測(cè)試也是不確定度引入的主要來(lái)源。因此，可通過(guò)增加標(biāo)準(zhǔn)溶液的測(cè)定次數(shù)，根據(jù)樣品選擇合理的線(xiàn)性范圍，增加標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程的移取體積和定容體積以減少標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度，同時(shí)也要提高檢測(cè)人員試驗(yàn)水平、試驗(yàn)回收率以及檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。