HMGB1與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征及免疫指標(biāo)的相關(guān)性研究

張小艷，李清祥，劉 勇，李 航，仇麗娟，封欣然，譚立明

1.南昌市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330009；

2.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致女性死亡的主要原因。該病發(fā)病率高、侵襲性強(qiáng)，且在疾病早期就可向遠(yuǎn)處發(fā)生轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重威脅著女性健康［1］。高遷移率族蛋白1（high mobility group box 1，HMGB1）是一種DNA結(jié)合蛋白，在細(xì)胞因子刺激下和細(xì)胞死亡時(shí)分別以主動(dòng)和被動(dòng)形式釋放于細(xì)胞外，是一種典型的損傷相關(guān)分子模式（damage-related molecular patterns，DAMP）分子［2］。據(jù)文獻(xiàn)［3-4］報(bào)道，HMGB1高表達(dá)與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療有關(guān)，并參與炎癥、免疫、增殖、轉(zhuǎn)移和自噬等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)對(duì)乳腺癌患者空芯針穿刺活檢物HMGB1水平進(jìn)行檢測(cè)，分析HMGB1與患者臨床資料、細(xì)胞和體液免疫指標(biāo)的相關(guān)性及對(duì)新輔助化療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值，以探究HMGB1與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、免疫功能及臨床治療的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

納入2019年5月—2020年10月南昌市第三醫(yī)院確診并接受新輔助化療的乳腺癌患者120例，年齡27～80歲，平均年齡（53.98±1.32）歲。其中Ⅱb期68例，Ⅲa期26例，Ⅲb期14例，Ⅲc期12例。所有受試者均自愿參與本研究，并簽署患者知情同意書(shū)，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①入選研究者均通過(guò)乳腺空芯針穿刺活檢或術(shù)后病理學(xué)檢查證實(shí)為乳腺癌；② 均為初診原發(fā)性乳腺癌；③患者基礎(chǔ)資料翔實(shí)；④ 此前從未接受過(guò)放療、化療及內(nèi)分泌治療；⑤ 所有入選患者均符合2019年中國(guó)新輔助化療專家治療組制定的《中國(guó)乳腺癌新輔助治療專家共識(shí)（2019年版）》［5］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎臟等系統(tǒng)疾病，甲狀腺疾病或糖尿病；② 合并有其他惡性腫瘤；③妊娠或哺乳期婦女；④ 中途不耐受化療退出者。

1.3 新輔助化療和組織勻漿制備

采取新輔助化療的入選對(duì)象予以3個(gè)周期CET或CEP方案的新輔助化療，化療結(jié)束后再行乳腺癌手術(shù)。CET方案為：環(huán)磷酰胺500 mg/m2+表柔比星75 mg/m2+多西他賽75 mg/m2，靜脈滴注，第1天，21 d為1個(gè)周期。CEP方案為：環(huán)磷酰胺500 mg/m2+表柔比星75 mg/m2+紫杉醇脂質(zhì)體150 mg/m2，靜脈滴注，第1天，21 d為1個(gè)周期。按照試劑使用說(shuō)明書(shū)要求，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）（0.01 mol/L，pH=7.4）沖洗穿刺活檢物（經(jīng)病理學(xué)檢查明確為癌變組織）以及新輔助化療結(jié)束后手術(shù)切除組織，稱重后剪碎組織。將剪碎組織和PBS按照1∶9的重量體積比（1 g組織對(duì)應(yīng)9 mL PBS）配好后，加入玻璃勻漿器中，置于冰上進(jìn)行充分研磨，然后將勻漿液以5000×g離心5～10 min，取上清置于-80 ℃冰箱以待檢測(cè)。

1.4 試劑與方法

通過(guò)南昌市第三醫(yī)院病理科收集患者的臨床病理學(xué)資料，包括臨床分期、術(shù)后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和Ki-67增殖指數(shù)。采集所有受試者空腹靜脈（EDTA-K2抗凝）全血2.0 mL，采用流式細(xì)胞儀（型號(hào)FACSCanto Ⅱ，美國(guó)BD公司）測(cè)定CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞百分比。采用全自動(dòng)特定蛋白分析儀（型號(hào)IMMAGE 800，美國(guó)Beckman Coulter公司）檢測(cè)體液免疫球蛋白IgG、IgA、IgM以及補(bǔ)體C3、C4；采集非抗凝靜脈血3.0 mL，離心分離血清，選用上海江萊生物科技有限公司酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒測(cè)定IL-10和TGF-β以及勻漿上清液中HMGB1的含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)和Levene’s檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性。正態(tài)分布資料以x±s表示，偏態(tài)分布以［M（Q）］表示。兩組間比較正態(tài)分布且方差齊時(shí)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，否則采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。采用Spearman相關(guān)性分析檢驗(yàn)各指標(biāo)間是否存在相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HMGB1與乳腺癌患者臨床病理學(xué)資料的相關(guān)性

將所有研究對(duì)象按照年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER、PR、HER2和Ki-67增殖指數(shù)進(jìn)行分組比較，結(jié)果顯示，Ⅱb期患者的HMGB1水平低于Ⅲ（Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc）期，中位數(shù)分別為14.18和41.29 ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的HMGB1水平顯著高于未轉(zhuǎn)移者，中位數(shù)分別為36.68和11.13 ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.001，表1）。

表1 HMGB1和乳腺癌患者臨床病理學(xué)資料的相關(guān)性Tab.1 The correlation between HMGB1 and clinicopathological data of breast cancer patients

2.2 HMGB1水平和乳腺癌患者T淋巴細(xì)胞亞群的分析

通過(guò)95% CI計(jì)算得到HMGB1參考范圍為（22.98，31.36）ng/mL，按照參考范圍下限將入選的乳腺癌患者分為高水平組（HMGB1＞22.98 ng/mL，47例）和低水平組（HMGB1≤22.98 ng/mL，73例），高水平組CD4+T細(xì)胞/CD3+T細(xì)胞低于低水平組（P＜0.001)，CD8+T細(xì)胞/CD3+T細(xì)胞高于低水平組（P＜0.001），兩組研究對(duì)象CD4+T細(xì)胞/CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞/CD3+T細(xì)胞差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 不同HMGB1水平乳腺癌患者NK細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞亞群的比較Fig.1 The comparison of NK cells and T lymphocyte subsets in

2.3 HMGB1水平和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）指標(biāo)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，HMGB1與Treg相關(guān)指標(biāo)IL-10、TGF-β呈顯著正相關(guān)（r=0.734，P＜0.001；r=0.686，P＜0.001，圖2）。

圖2 HMGB1和Treg指標(biāo)的相關(guān)性Fig.2 The correlation between HMGB1 and Treg indicators

2.4 HMGB1水平與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)體液免疫分子的相關(guān)性

經(jīng)Spearman相關(guān)性分析，HMGB1與體液免疫分子IgG、IgA、IgM以及補(bǔ)體C3、C4均不相關(guān)（P＞0.05，表2）。

表2 HMGB1和實(shí)驗(yàn)室體液免疫分子的相關(guān)性Tab.2 The correlation between HMGB1 and laboratory humoral immune molecules

2.5 HMGB1對(duì)病理學(xué)完全緩解（pathological complete response，pCR）率的預(yù)測(cè)分析

根據(jù)Miller-Payne病理學(xué)反應(yīng)性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，將化療療程結(jié)束后手術(shù)切除癌組織切片和化療前穿刺活檢組織切片對(duì)比，比較鏡下腫瘤細(xì)胞的退縮情況，病理學(xué)反應(yīng)性分5級(jí)。G1級(jí)：腫瘤細(xì)胞較前無(wú)變化；G2級(jí)：腫瘤細(xì)胞密度減少＜30%；G3級(jí)：腫瘤細(xì)胞密度減少31%～90%；G4級(jí)：大量腫瘤細(xì)胞減少91%以上；G5級(jí)（pCR）：腫瘤完全消失，鏡下未見(jiàn)浸潤(rùn)癌殘留（可含有原位癌）。分析比較pCR組（12例）和非pCR組（108例）患者的HMGB1水平，結(jié)果顯示，pCR組的HMGB1水平顯著低于非pCR組（P＜0.01，圖3）。

圖3 HMGB1水平與新輔助化療療效關(guān)系Fig.3 The correlation between HMGB1 level and the efficacy of neoadjuvant chemotherapy

3 討 論

HMGB1是一種存在于幾乎所有真核細(xì)胞中的核蛋白，在維持基因組結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷性損傷時(shí)，HMGB1作為觸發(fā)宿主先天性免疫的警報(bào)蛋白釋放于細(xì)胞外［6-7］。當(dāng)HMGB1觸發(fā)的宿主防御得到合理的調(diào)控時(shí)，HMGB1可以作為保護(hù)性因子；否則HMGB1將作為損傷性炎癥因子，也可進(jìn)一步引起器官功能障礙、免疫抑制和腫瘤發(fā)生等［8］。已有研究［8-9］證實(shí)HMGB1是調(diào)節(jié)惡性腫瘤發(fā)生、增殖和轉(zhuǎn)移的因子，并與多種腫瘤的預(yù)后不良有關(guān)。本研究中，Ⅲ期乳腺癌患者中位數(shù)顯著高于Ⅱ期（41.29 ng/mLvs14.18 ng/mL），同時(shí)發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者也伴隨著HMGB1水平的升高（36.68 ng/mLvs11.13 ng/mL），提示HMGB1與乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。由于腫瘤細(xì)胞的快速生長(zhǎng)導(dǎo)致組織缺氧，從而在腫瘤中心形成了缺氧環(huán)境。低氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）促進(jìn)細(xì)胞釋放HMGB1，然后與線粒體DNA形成復(fù)合物，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖［10-11］。另外，Ai等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-107通過(guò)與其靶蛋白HMGB1的相互作用可以抑制乳腺癌細(xì)胞自噬、增殖和遷移，也進(jìn)一步證實(shí)HMGB1與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為乳腺癌的治療靶點(diǎn)。

Treg是一種特殊類型的T細(xì)胞亞群，作為主要的免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞，可抑制T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的功能［13］。在腫瘤發(fā)生的病理和生理階段，Treg主要通過(guò)細(xì)胞表面分子IL-10、TGF-β的高表達(dá)來(lái)抑制機(jī)體的抗腫瘤免疫［14］。腫瘤細(xì)胞釋放的HMGB1進(jìn)入腫瘤微環(huán)境，可通過(guò)抑制效應(yīng)T細(xì)胞和激活Treg，促進(jìn)免疫逃逸，使腫瘤生長(zhǎng)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與Treg相關(guān)指標(biāo)IL-10、TGF-β顯著相關(guān)，提示HMGB1可能增強(qiáng)Treg的功能，從而促進(jìn)IL-10、TGF-β分泌。Zhang等［16］在腫瘤模型的研究中發(fā)現(xiàn)，對(duì)腫瘤來(lái)源的HMGB1進(jìn)行沉默或抑制會(huì)削弱Treg的功能。Wild等［17］對(duì)頭頸部腫瘤患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1是Treg的趨化劑，可促進(jìn)其免疫抑制功能。但Koprivica等［18］在Ⅰ型糖尿病動(dòng)物模型中卻發(fā)現(xiàn)，抑制HMGB1可以促使Treg發(fā)揮更強(qiáng)的免疫抑制功能，表現(xiàn)為IL-10、TGF-β的大量分泌。其原因可能為HMGB1和Treg之間的相互作用在不同的疾病中存在差異，也可能是因?yàn)門reg包括CD4+CD25+Treg、Ⅰ型調(diào)節(jié)性Treg及Ⅲ型輔助型Treg等，而且目前對(duì)不同類型Treg的具體機(jī)制仍不清楚，值得今后深入研究。研究［19］發(fā)現(xiàn)，HMGB1高水平的乳腺癌患者CD4+、CD8+T細(xì)胞與CD3+T細(xì)胞的比值分別低于和高于低水平組，由于HMGB1在抑制抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可抑制包括初始T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的激活和抗體的產(chǎn)生。也可能因?yàn)镠MGB1通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控Treg影響CD4+、CD8+T細(xì)胞的功能，從而在細(xì)胞免疫抑制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本研究中HMGB1與實(shí)驗(yàn)室常規(guī)體液免疫分子未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)性，提示HMGB1對(duì)乳腺癌免疫功能的影響可能主要存在于細(xì)胞免疫中。

新輔助化療是局部進(jìn)展期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)治療。乳腺癌患者新輔助化療的效果通常通過(guò)pCR率和殘余腫瘤負(fù)荷（residual cancer burden，RCB）評(píng)分來(lái)評(píng)估［20］。本研究對(duì)患者HMGB1水平和新輔助化療術(shù)后pCR進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)HMGB1水平高，新輔助化療效果較差，提示HMGB1水平對(duì)pCR有預(yù)測(cè)價(jià)值，這和Exner等［21］的研究一致。

HMGB1具有潛在的促癌、免疫抑制作用，由于其測(cè)定簡(jiǎn)便安全，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。本研究通過(guò)分析HMGB1與乳腺癌患者臨床病理學(xué)特征、免疫指標(biāo)及新輔助化療效果的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)HMGB1與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，并與患者細(xì)胞免疫功能密切相關(guān)。對(duì)治療前患者組織進(jìn)行HMGB1水平檢測(cè)對(duì)預(yù)測(cè)新輔助化療效果具有一定價(jià)值。但由于本研究存在標(biāo)本量過(guò)小以及單中心研究的問(wèn)題，本課題組將通過(guò)擴(kuò)大標(biāo)本量以及加強(qiáng)隨訪力度進(jìn)一步研究HMGB1水平改變與患者pCR、RCB的關(guān)系，從而為新輔助化療效果探索更早期、更準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)指標(biāo)。