福建地區(qū)葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的組成及差異分析

賴呈純 賴恭梯 車建美 黃賢貴 王琦 高慧穎 官雪芳 林斌

摘要：【目的】對(duì)福建地區(qū)葡萄自然發(fā)酵酵母菌組成的差異進(jìn)行分析，明確福建主要酵母菌種類，為釀制具有南方地域特色的葡萄酒提供優(yōu)良菌株。【方法】采集夏黑、刺葡萄和玫瑰香葡萄自然發(fā)酵不同階段[發(fā)酵前期（7 d）、中期（15 d）和后期（25 d）]的發(fā)酵液進(jìn)行酵母菌分離，采用WL培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌表型性狀鑒別，挑取代表性菌株進(jìn)行DNA提取及26S rDNA D1/D2鑒定，分析不同發(fā)酵階段酵母菌的組成差異。通過(guò)測(cè)定相同發(fā)酵條件下的酒精度、總糖、還原糖和總酸含量，對(duì)釀酒酵母的釀酒性能進(jìn)行初步分析?！窘Y(jié)果】不同品種葡萄自然發(fā)酵的發(fā)酵液中共分離獲得114株菌株，根據(jù)其表型鑒定為18個(gè)不同的表型類群。進(jìn)一步通過(guò)酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列測(cè)序，可將114株酵母菌菌株劃分為18種，包括拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）、雙孢接合酵母（Zygosaccharomyces bisporus）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等。不同品種葡萄發(fā)酵過(guò)程中酵母菌種類和組成具有一定的差異，其中刺葡萄A有10種、刺葡萄B有11種、夏黑A和玫瑰香均為7種、夏黑B有8種。陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）出現(xiàn)在刺葡萄A、玫瑰香和夏黑B發(fā)酵前期，且所占比例最高，分別達(dá)100.00%、50.00%和40.00%;盔形畢赤酵母（Pichia galeiformis）是夏黑A和刺葡萄B發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌;在不同品種葡萄自然發(fā)酵中期均含有澤普林假絲酵母（Candida zemplinina）和盔形畢赤酵母;刺葡萄A、刺葡萄B和夏黑B發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌為盔形畢赤酵母，所占比例分別為40.00%、55.56%和71.43%;釀酒酵母在夏黑A、玫瑰香和夏黑B發(fā)酵中期開(kāi)始出現(xiàn)，直到發(fā)酵后期，均占有較大比例，分別為66.67%、42.86%和14.29%。初步葡萄釀酒發(fā)酵表明，釀酒酵母VMH-M042的釀酒性能（酒精度12.5%、總糖含量76.0 g/L、還原糖含量40.5 g/L、總酸含量5.6%）優(yōu)良?！窘Y(jié)論】福建地區(qū)不同品種葡萄分離得到的酵母菌資源豐富，區(qū)域性差異明顯，特異性資源較多，其中釀酒酵母VMH-M042在葡萄酒發(fā)酵中表現(xiàn)出較優(yōu)良的釀酒性能，可為南方葡萄酒釀制提供豐富的菌種資源和理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 葡萄;酵母菌;自然發(fā)酵;形態(tài)特征;分子鑒定;福建

Abstract：【Objective】In order to provide good yeast strains for wine brewing with the characteristics of southern region，the difference of the yeast populations were analyzed and the main yeast species were identifiedin the spontaneous fermentation of grapes from Fujian. 【Method】The yeast strains were isolated from fermentation of Xiahei， Vitis davidiiFoex. and Muscat Hamburg at different stages[earlyfermentation stage（7 d），middle fermentation stage（15 d），later fermentation stage（25 d）]. The strains were preliminarily classified based on WL nutrient agar，DNA was extracted and 26S rDNA D1/D2 sequence analysis was conducted on representative strains. Analysis of the composition differences in yeast across the fermentation stages was conducted. The brewing performance of Saccharomyces cerevisiae was analyzed by determine the alcohol content，total sugar，reducing sugar and total acid under the same fermentation conditions. 【Result】A total of 114 strains of yeast were isolated from fermentation liquid of different varieties and preliminarily classified as 18 phenotypic groups. The 26S rDNA D1/D2 sequence analysis showed that they were identified as 18 different known yeast species，such as Zygosaccharomyces bailii， Z. bisporus and S. cerevisiae， etc. The composition of yeast populations in different stages of natural fermentation of different varieties of grapes was different. There were 10 kinds in V. davidii Foex. A，11 kinds in V. davidii Foex.B，7 kinds in Xiahei A，8 kinds in Xiahei B，and 7 kinds in Muscat Hamburg.In the early stage of the fermentation of V. davidii Foex. A，Muscat Hamburg and Xiahei B，the preponderant microzymes were Issat-chenkia terricola with the highest proportions.The proportions were 100.00%，50.00% and 40.00%， respectively. In the early stage of the fermentation of Xiahei A and V. davidii Foex.B，the preponderant microzymes were Pichia galeiformis. Candida zemplinina and P. galeiformis were involved in the middle stage of the different varieties of grapes. At the late stage of the fermentation of V. davidii Foex. A，Muscat Hamburg and Xiahei B，the preponderant microzyme was P. galeiformis，whose proportions were 40.00%，55.56% and 71.43%，respectively. S. cerevisiae was involved in both of the middle and the late stages of the fermentation of Xiahei A，Muscat Hamburg and Xiahei B. Its proportions at the late stage were 66.67%，42.86% and 14.29%. Preliminary studies of grape fermentation showed the enological characteristics（alcohol content 12.5%，total sugar 76.0 g/L，reducing sugar 40.5 g/L，and total acid 5.6%） of the S. cerevisiae strain VMH-M042 were excellent. 【Conclusion】The yeast resources isolated from different grape varieties in Fujian region are abundant with obvious regional differences and more specific resources. Among them，S. cerevisiae strain VMH-M042 has good fermentation performance. Studying on the composition and difference of yeast populations in different stages of spontaneous fermentation of different varieties of grapes from southern region can provide more yeast strain resources and lay a foundation for the local wine brewing.

Key words： grape; yeast populations; spontaneous fermentation; morphological character; molecular identification; Fujian

0 引言

【研究意義】葡萄酒的地域特色是葡萄酒創(chuàng)新釀制的研究主題，作為發(fā)酵主體的酵母菌對(duì)葡萄酒品質(zhì)、風(fēng)味和特色等均有重要作用（Alexandre，2020）。氣候多樣化的特點(diǎn)造就了豐富的葡萄酒酵母資源，每個(gè)微環(huán)境的本土酵母均具有一些獨(dú)特的代謝特性，這些特性可賦予當(dāng)?shù)仄咸丫铺貏e的風(fēng)味特征（Nisiotou et al.，2019）。隨著我國(guó)葡萄種植向南方區(qū)域的快速發(fā)展，從南方地區(qū)分離具有區(qū)域特色的酵母菌，對(duì)南方葡萄酒釀制和風(fēng)格創(chuàng)新具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】酵母菌種類繁多，形態(tài)各樣，酵母菌的種屬描述目前以常規(guī)形態(tài)描述為主。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用26S rDNA D1/D2區(qū)序列進(jìn)行的分子鑒定為親緣關(guān)系較近的不同種酵母菌鑒定提供了標(biāo)準(zhǔn)（Kurtzman and Robnett，1998;趙雪平等，2020）。26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析表明，采用商業(yè)酵母進(jìn)行的純種發(fā)酵過(guò)程中，非釀酒酵母主要存在于發(fā)酵早期，釀酒酵母則在中后期占優(yōu)勢(shì)（Li et al.，2012）。對(duì)巨峰葡萄自然發(fā)酵不同階段酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果表明，不同發(fā)酵階段的酵母菌最終鑒定為3個(gè)不同種，且不同種酵母菌在發(fā)酵不同階段所占優(yōu)勢(shì)有所不同（張俊杰等，2017）。王志恒等（2018）采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析對(duì)寧夏玉泉營(yíng)地區(qū)釀酒葡萄酵母菌進(jìn)行菌株鑒定，結(jié)果表明，所分離得到的22株酵母菌株鑒定為6個(gè)種，分別為葡萄酒有孢漢生酵母（Hanseniaspora vineae）、釀酒酵母（Saccharomyces cervi-siae）、大隱球酵母（Cryptococcus magnus）等。在多年種植葡萄的園區(qū)，成熟葡萄果實(shí)上存在著大量天然的酵母菌，這些酵母菌適應(yīng)了當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境，并伴隨著各地主栽葡萄品種的種植，逐漸成為優(yōu)勢(shì)天然酵母菌（Capece et al.，2016）。這些酵母菌在成熟葡萄的破碎過(guò)程中產(chǎn)生自然發(fā)酵，參與葡萄酒的釀造過(guò)程，對(duì)不同產(chǎn)地的葡萄酒品質(zhì)和風(fēng)格有著至關(guān)重要的影響（王慧等，2008;Padilla et al.，2016;徐建坤等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】福建處于我國(guó)的南方區(qū)域，靠近北回歸線，受季風(fēng)環(huán)流和地形的影響，形成暖熱濕潤(rùn)的亞熱帶海洋性季風(fēng)氣候，熱量豐富，光照充足，年平均氣溫17～21 ℃，有利于葡萄生長(zhǎng)發(fā)育和提早成熟（金光等，2006）。隨著不同品種葡萄的引進(jìn)和種植，福建葡萄規(guī)?；a(chǎn)栽培迅速得到發(fā)展，也蘊(yùn)藏著豐富獨(dú)特的酵母菌資源，但目前針對(duì)福建區(qū)域葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中可培養(yǎng)酵母菌多樣性的研究尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)WL培養(yǎng)基分析福建地區(qū)種植的刺葡萄、夏黑和玫瑰香等自然發(fā)酵不同階段可培養(yǎng)酵母菌形態(tài)多樣性，同時(shí)采用26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析揭示自然發(fā)酵不同階段酵母菌種群的變化動(dòng)態(tài)，篩選出適合我國(guó)南方地區(qū)葡萄酒釀制的酵母菌株，以期為南方地區(qū)葡萄酵母菌株資源研究及其應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

1. 1. 1 樣品采集 刺葡萄（冬香蕉）分別采自福建省明溪縣研農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司葡萄園（標(biāo)記為刺葡萄A）和湖南省芷江縣葡萄園（標(biāo)記為刺葡萄B，對(duì)照），夏黑分別采自福建省明溪縣研農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司葡萄園（標(biāo)記為夏黑A）和福建省廈門市海堤葡萄園（標(biāo)記為夏黑B），玫瑰香采自福建省明溪縣研農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司葡萄園。選擇健康成熟的果實(shí)采收，用干凈的自封袋密封包裝，帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

1. 1. 2 培養(yǎng)基 酵母菌株分離采用YEPD培養(yǎng)基：酵母膏10 g/L、蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L和瓊脂20 g/L，另加100 mg/L氯霉素和25 mg/mL氨芐青霉素抑制細(xì)菌和霉菌生長(zhǎng)。菌株的初步形態(tài)分類采用WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基：酵母浸粉5.0 g/L、酸水解酪蛋白5.0 g/L、葡萄糖50 g/L、磷酸二氫鉀0.55 g/L、氯化鉀0.45 g/L、氯化鈣0.125 g/L、硫酸鎂0.125 g/L、氯化鐵0.0025 g/L、硫酸錳0.0025 g/L、溴甲酚綠0.022 g/L和瓊脂17.0 g/L，pH 5.5±0.2。以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌20 min。

1. 1. 3 主要試劑 引物NL1（5'-GCATATCAATAA GCGGAGGAAAAG-3'）和NL4（5'-GGTCCGTGTT TCAAGACGGG-3'）由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成，TaKaRa Ex Taq?DNA Polymerase購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，酵母菌DNA提取試劑盒（TIANamp Yeast DNA Kit）購(gòu)自廈門泰京生物技術(shù)有限公司。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 菌株分離 將采摘的新鮮葡萄在28 ℃下發(fā)酵，于發(fā)酵前期（7 d）、中期（15 d）和后期（25 d）3個(gè)時(shí)期進(jìn)行取樣，共取15個(gè)發(fā)酵樣品，采用無(wú)菌水依次稀釋后，取100 μL均勻涂布至YEPD培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)，純化并于-80 ℃保藏。

1. 2. 2 菌株形態(tài)分類 取保藏的菌株劃線接種于WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)5 d后，觀察并記錄菌落顏色和形態(tài)。根據(jù)顏色和形態(tài)差異初步對(duì)葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中的酵母菌株進(jìn)行分類。

1. 2. 3 菌株26S rDNA D1/D2基因擴(kuò)增及測(cè)序

采用酵母菌DNA提取試劑盒（TIANamp Yeast DNA Kit）進(jìn)行酵母菌基因組總DNA提取。PCR擴(kuò)增體系為25.0 μL：模板DNA（20 ng/μL）1.0 μL，引物NL1和NL4（10 μmol/L）各1.0 μL，dNTP混合液（10 mmol/L）0.5 μL，TaKaRa Ex Taq?DNA Polymerase（2.5 U）0.3 μL，10×Buffer 2.5 μL，ddH2O 18.7 μL。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 20 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送至鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果查詢GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采用BLAST在線工具與數(shù)據(jù)庫(kù)的序列進(jìn)行同源性比較。

1. 2. 4 酵母菌鑒定 根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，下載相關(guān)酵母菌菌種的26S rDNA D1/D2區(qū)序列，采用Clustal X進(jìn)行匹配排列，利用MEGA 7.0中的Kimura2-Parameter Distance模型及Neighbor-joining分析法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行1000次的Bootstraps檢驗(yàn)。根據(jù)WL營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基和測(cè)序結(jié)果，每個(gè)葡萄品種在不同發(fā)酵時(shí)期只選取1株代表性菌株，共44株菌株進(jìn)行聚類分析。

1. 2. 5 釀酒酵母菌產(chǎn)酒能力測(cè)定 選擇釀酒酵母菌株VMH-M042，培養(yǎng)離心后獲得菌體，并以安琪RV002酵母、VF、德國(guó)ERBSC?H公司生產(chǎn)的干酵母OFG和法國(guó)ERBSL?H公司生產(chǎn)的干酵母OFC酵母菌為對(duì)照，以夏黑葡萄為原料進(jìn)行葡萄酒發(fā)酵，果實(shí)平均可溶性固形物為19.7 °Brix，平均總酸為0.36%。發(fā)酵工藝流程：將采收后的葡萄果實(shí)進(jìn)行分選，將葡萄壓榨破碎除梗形成葡萄漿醪，通過(guò)添加蔗糖將可溶性固形物調(diào)至30 °Brix，攪拌均勻后將葡萄漿醪裝入已洗凈消毒的玻璃罐中（裝至玻璃罐體積的80%左右），一邊裝罐一邊添加SO2（使葡萄汁中SO2含量為60 mg/L），裝罐后放置20 h左右進(jìn)行殺菌，隨后按1∶1000（酵母粉∶葡萄汁）添加釀酒酵母，倒灌混勻后，置于恒溫25 ℃下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵21 d后取葡萄酒進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》測(cè)定發(fā)酵后葡萄酒的酒精度、還原糖、可溶性糖和酸度等指標(biāo)，初步評(píng)估各釀酒酵母的葡萄酒發(fā)酵能力。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2010整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)和繪制圖表，采用DPS v9.50處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 菌株的形態(tài)特征

從15個(gè)發(fā)酵樣品中共分離到114株酵母菌，根據(jù)圖1和表1的菌落顏色及形態(tài)描述與Pallmann等（2001）描述的菌落特征進(jìn)行對(duì)照，將分離得到的114株菌株分為18個(gè)不同的菌落類型，如菌株VdF1-M021為細(xì)尖假絲酵母（Candida apicola），其菌落奶油色帶淡淡的綠色，表面光滑，不透明，單菌落球形突起;菌株VdF1-M026、VdF2-M102、VMH-P013和VSB1-P005為有孢漢遜酵母（Hanseniaspora opuntiae），其菌落藍(lán)綠色，扁平，表面光滑，不透明，奶油狀;菌株VMH-M042、VSB1-M032和VSB2-L076為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），其菌落奶油色帶綠色，球形突起，表面光滑，不透明，奶油狀。

2. 2 酵母菌26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析結(jié)果

根據(jù)酵母菌的26S rDNA D1/D2區(qū)序列測(cè)序比對(duì)結(jié)果，可將114株酵母菌菌株劃分為18種，選取代表菌株序列（共44株酵母菌）與標(biāo)準(zhǔn)菌株序列構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2）。結(jié)果表明，菌株VSB2-L077、VSB1-M035和VMH-M045與拜耳接合酵母（Zygosaccharomyces bailii）以較高的置信度聚在一個(gè)分支上，屬于同一個(gè)種;菌株VdF1-L059以較高的置信度與雙孢接合酵母（Z. bisporus）聚在一個(gè)分支上，同屬一個(gè)種;菌株VMH-M042、VSB1-M032和VSB2-L076與釀酒酵母（S. cerevisiae）聚在一個(gè)分支上，應(yīng)屬同一個(gè)種;菌株VdF2-P092與佛羅倫薩接合酵母（Z. florentinus）同屬一個(gè)分支;菌株VSB2-M051與葡萄酒有孢漢生酵母（H. vineae）同屬一個(gè)種;菌株VdF1-M026、VdF2-M102、VMH-P013和VSB1-P005與仙人掌有孢漢遜酵母（H. opuntiae）同屬一個(gè)種;菌株VdF2-P093與覆膜孢酵母屬亞種（Saccharomycopsis crataegensis）同屬一個(gè)種;菌株VdF1-L057、VdF2-M098、VSB1-P006和VSB2-P018與接合囊酵母（Zygoascus hellenicus）處于同一個(gè)分支，應(yīng)屬于同一個(gè)種;菌株VdF1-P002、VSB2-P014和VMH-P010與陸生伊薩酵母（Issatchenkia terricola）聚在同一分支，應(yīng)屬同一個(gè)種;菌株VdF2-P086與河內(nèi)伊薩酵母（I. hanoiensis）為同一個(gè)種;菌株VdF1-L063和VdF2-L107與西方畢赤酵母（Pichia occidentalis）同屬一個(gè)種;菌株VdF2-P090與發(fā)酵畢赤酵母（Pichia fermentans）同處一個(gè)分支，但存在一定差異;菌株VSB2-M053、VSB1-P007和VMH-P012、VMH-M047、VdF2-L113與庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母（P. kudriavzevii）同屬一個(gè)種;菌株VdF1-L060與加利福尼亞假絲酵母（Candida californica）同屬一個(gè)種;菌株VdF1-M020、VdF2-L106、VMH-M041、VSB1-P004和VSB2-L075與盔形畢赤酵母（Pichia galeiformis）同屬一個(gè)種;菌株VdF1-M021與細(xì)尖假絲酵母（C. apicola）同屬一個(gè)種;VdF1-M031、VdF2-M103、VMH-M044、VSB1-M033和VSB2-M050與澤普林假絲酵母（C. zemplinina）同屬一個(gè)種;菌株VdF1-M027和VdF2-M100與黏性紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa）聚在同一個(gè)分支，應(yīng)屬同一個(gè)種。

2. 3 不同品種葡萄自然發(fā)酵不同時(shí)期酵母菌的組成和差異分析結(jié)果

2. 3. 1 不同品種葡萄自然發(fā)酵酵母菌種類差異

不同品種葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌種類有所不同，刺葡萄B發(fā)酵過(guò)程中分離到的酵母菌種類最多，為11種，包括澤普林假絲酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、河內(nèi)伊薩酵母、西方畢赤酵母、庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母、發(fā)酵畢赤酵母、盔形畢赤酵母、黏性紅酵母、覆膜孢酵母屬亞種、接合囊酵母和佛羅倫薩接合酵母。其次是刺葡萄A，分離到10種，分別為細(xì)尖假絲酵母、加利福尼亞假絲酵母、澤普林假絲酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、西方畢赤酵母、陸生伊薩酵母、盔形畢赤酵母、黏性紅酵母、接合囊酵母和雙孢接合酵母。夏黑B分離到8種，夏黑A和玫瑰香發(fā)酵過(guò)程中分離到的酵母菌種類較少，均為7種。

2. 3. 2 不同品種葡萄自然發(fā)酵不同時(shí)期酵母菌組成差異 從圖3可看出，不同品種葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的數(shù)量變化具有一定的規(guī)律，發(fā)酵前期酵母菌數(shù)量較少，發(fā)酵中期酵母菌數(shù)量增多，隨著發(fā)酵至后期，酵母菌數(shù)量又減少。如在刺葡萄A發(fā)酵前期、中期和后期，分離得到的酵母菌數(shù)量分別為3株、13株和10株;在夏黑A發(fā)酵前期、中期和后期，分離得到的酵母菌數(shù)量分別為6株、9株和3株。

不同品種葡萄發(fā)酵過(guò)程中酵母菌組成也具有一定的差異，在發(fā)酵前期以非釀酒酵母為主，陸生伊薩酵母出現(xiàn)在刺葡萄A、玫瑰香和夏黑B發(fā)酵前期，且所占比例最高，分別達(dá)100.00%、50.00%和40.00%，而在夏黑A和刺葡萄B發(fā)酵前期未分離到該菌株;在夏黑A、夏黑B、玫瑰香和刺葡萄B發(fā)酵前期均分離到庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母;盔形畢赤酵母是夏黑A和刺葡萄B發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌，所占比例分別為33.33%和35.71%。不同品種葡萄自然發(fā)酵中期均含有澤普林假絲酵母和盔形畢赤酵母，其中刺葡萄A、玫瑰香和夏黑B發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌是盔形畢赤酵母，所占比例分別為38.46%、42.86%和28.57%;夏黑A發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌為釀酒酵母和澤普林假絲酵母，所占比例均為33.33%;刺葡萄B發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌則有所不同，為西方伊薩酵母，所占比例為30.00%。刺葡萄A、刺葡萄B和夏黑B發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌均為盔形畢赤酵母，所占比例分別為40.00%、55.56%和71.43%;釀酒酵母在夏黑A、玫瑰香和夏黑B發(fā)酵中期開(kāi)始出現(xiàn)，直到發(fā)酵后期，均占有較大比例，分別為66.67%、42.86%和14.29%。但在刺葡萄A和刺葡萄B自然發(fā)酵不同階段均未檢測(cè)到釀酒酵母。

刺葡萄A和刺葡萄B分別采自福建省明溪縣研農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司葡萄園和湖南省芷江縣葡萄園，刺葡萄B發(fā)酵前期酵母菌種類為9種，刺葡萄A發(fā)酵前期酵母菌僅1種;在發(fā)酵中期，刺葡萄A和刺葡萄B酵母菌種類分別為6種和7種，優(yōu)勢(shì)菌也有所不同，刺葡萄A發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌為盔形畢赤酵母，刺葡萄B發(fā)酵中期的優(yōu)勢(shì)菌為西方伊薩酵母;刺葡萄A和刺葡萄B發(fā)酵后期酵母菌種類分別為6種和4種，優(yōu)勢(shì)菌均為盔形畢赤酵母。夏黑A和夏黑B分別采自福建省明溪縣研農(nóng)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司葡萄園和福建省廈門市海堤葡萄園，發(fā)酵前期酵母菌種類均為4種，但優(yōu)勢(shì)菌有所不同，夏黑A發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌為仙人掌有孢漢遜酵母和盔形畢赤酵母，夏黑B發(fā)酵前期的優(yōu)勢(shì)菌為陸生伊薩酵母;夏黑A和夏黑B發(fā)酵中期酵母菌的種類分別為4種和6種，夏黑A發(fā)酵中期優(yōu)勢(shì)菌為澤普林假絲酵母和釀酒酵母，夏黑B發(fā)酵中期優(yōu)勢(shì)菌為盔形畢赤酵母;夏黑A和夏黑B發(fā)酵后期酵母菌的種類分別為2種和3種，優(yōu)勢(shì)菌則分別為釀酒酵母和盔形畢赤酵母。

2. 4 釀酒酵母釀酒性能分析結(jié)果

由表2可知，在相同的發(fā)酵條件下，從玫瑰香葡萄自然發(fā)酵中期分離的釀酒酵母VMH-M042與市售酵母菌RV002和OFC酒精的發(fā)酵能力相當(dāng)，其發(fā)酵后的葡萄酒酒精度分別為12.5%、12.2%和12.2%，三者間差異不顯著（P>0.05），但均極顯著高于市售酵母菌VF和OFG（P<0.01，下同）;釀酒酵母VMH-M042發(fā)酵后的葡萄酒總糖含量最低，與市售的酵母菌RV002相當(dāng)，分別為76.0和76.8 g/L，二者與酵母菌VF、OFG和OFC存在極顯著差異;釀酒酵母VMH-M042發(fā)酵后的葡萄酒還原糖含量最高，為40.5 g/L，與酵母菌VF和OFC存在顯著差異（P<0.05），與酵母菌RV002和OFG存在極顯著差異;在總酸方面，釀酒酵母菌VMH-M042發(fā)酵后的葡萄酒總酸含量較高，為5.6%，與酵母菌OFC相當(dāng)，與酵母菌RV002、VF和OFG存在極顯著差異。以上理化指標(biāo)初步表明，釀酒酵母VMH-M042更適合本地葡萄酒的釀制。

3 討論

葡萄酵母菌的數(shù)量和多樣性受葡萄品種、成熟度、氣候條件、地理位置、機(jī)械損傷和病蟲(chóng)害防治強(qiáng)度等因素的影響（Raspor et al.，2006）。本研究結(jié)合純培養(yǎng)法和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析法，對(duì)福建地區(qū)不同品種葡萄自然發(fā)酵不同階段酵母菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，不同品種葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中共分離獲得114株酵母菌菌株，經(jīng)WL培養(yǎng)基的形態(tài)鑒定和26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析，114株酵母菌菌株可分為18個(gè)種，包括拜耳接合酵母、雙孢接合酵母、釀酒酵母、佛羅倫薩接合酵母、葡萄酒有孢漢生酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、覆膜孢酵母屬亞種、接合囊酵母、陸生伊薩酵母、河內(nèi)伊薩酵母、西方畢赤酵母、發(fā)酵畢赤酵母、庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母、加利福尼亞假絲酵母、盔形畢赤酵母、細(xì)尖假絲酵母、澤普林假絲酵母和黏性紅酵母。其中，澤普林假絲酵母、發(fā)酵畢赤酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、加利福尼亞假絲酵母、葡萄酒有孢漢生酵母、拜耳接合酵母、釀酒酵母、陸生伊薩酵母、覆膜孢酵母屬亞種、黏性紅酵母和庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母等在相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道較多（Csoma and Sipiczki，2008;Berradre et al.，2012;Bezerra-Bussoli et al.，2013;楊瑩等，2016;楊寬等，2018）。同前人研究相比較，本研究首次分離到4種酵母菌，分別為盔狀畢赤酵母、西方畢赤酵母、河內(nèi)伊薩酵母和細(xì)尖假絲酵母。葡萄發(fā)酵過(guò)程中菌群的變化受葡萄產(chǎn)地氣候、葡萄漿果成熟度、葡萄園管理狀況和發(fā)酵工藝水平等各種因素的影響（Guillamón et al.，1998;許維娜等，2019）。本研究從福建刺葡萄和主要栽培葡萄品種中分離得到的酵母菌資源豐富，特異性酵母菌資源較多，與福建省屬亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)氣候有很大關(guān)系，酵母菌在長(zhǎng)期的環(huán)境適應(yīng)中形成了獨(dú)具地域特色的酵母菌菌群;同時(shí)，由于不同葡萄品種富集的自然酵母菌群在種類和數(shù)量上存在明顯差異，且在葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中隨糖分下降和酒精度不斷升高，酵母菌群此消彼長(zhǎng)，就形成了葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌群變化的差異。

研究表明，自然發(fā)酵前期酵母種類相對(duì)較復(fù)雜，且大多為非釀酒酵母菌（劉樹(shù)文等，2008），在發(fā)酵中后期，隨著糖的降低和酒精度的進(jìn)一步升高，有些酒精耐性較差的非釀酒酵母逐漸消亡，酒精耐性較高的釀酒酵母逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)（Maro et al.，2007;劉樹(shù)文等，2008）。王澤舉等（2008）在新疆葡萄酒自然發(fā)酵初期分離得到8個(gè)屬的酵母菌，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，酒精度升高，東方伊薩酵母和假絲酵母等酒精耐性較差的菌株逐漸消亡，酒精耐性較強(qiáng)的釀酒酵母逐漸占據(jù)優(yōu)勢(shì)并最終完成發(fā)酵。本研究與其相似，在不同品種葡萄發(fā)酵初期可分離到陸生伊薩酵母、仙人掌有孢漢遜酵母、庫(kù)德里阿茲威氏畢赤酵母、接合囊酵母和盔形畢赤酵母等非釀酒酵母。在夏黑A、玫瑰香和夏黑B發(fā)酵中期開(kāi)始分離到釀酒酵母，直到發(fā)酵后期，均占有較大比例，分別為66.67%、42.86%和14.29%。王鳳梅和馬利兵（2016）也發(fā)現(xiàn)在內(nèi)蒙古西部赤霞珠葡萄自然發(fā)酵初期，葡萄汁有孢漢遜酵母和克魯維畢赤氏酵母的數(shù)量占據(jù)優(yōu)勢(shì)，隨著發(fā)酵進(jìn)行，非釀酒酵母菌株數(shù)量有所減少，釀酒酵母數(shù)量逐漸增加，至發(fā)酵后期，發(fā)酵液中僅檢測(cè)到釀酒酵母的存在。本研究還發(fā)現(xiàn)，在刺葡萄A和刺葡萄B的自然發(fā)酵整個(gè)過(guò)程中未分離到釀酒酵母，目前關(guān)于刺葡萄果皮和自然發(fā)酵過(guò)程中釀酒酵母分離相關(guān)的報(bào)道較少，因此，后續(xù)研究將對(duì)其發(fā)酵過(guò)程中未產(chǎn)生釀酒酵母的原因進(jìn)行深入探究。

葡萄品種、釀造工藝及發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的代謝是影響葡萄酒風(fēng)味的主要因素（韓北忠等，2007）。在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程中，酵母作為主要的發(fā)酵微生物對(duì)葡萄酒產(chǎn)量、質(zhì)量和風(fēng)味影響很大，不同葡萄產(chǎn)區(qū)本土酵母適宜當(dāng)?shù)氐耐寥?、氣候和葡萄品種，具有獨(dú)特的代謝特性，有助于生產(chǎn)出與眾不同的本土地方特色葡萄酒（劉愛(ài)國(guó)等，2008）。因此，傳統(tǒng)葡萄釀酒園區(qū)釀出的美酒與商業(yè)化相比，具有很強(qiáng)的產(chǎn)區(qū)風(fēng)格和地方特性（王慧等，2008）。從南摩拉維亞葡萄酒產(chǎn)區(qū)長(zhǎng)相思、黑皮諾葡萄漿果上和自然發(fā)酵的葡萄汁中篩選出一些有代表性的菌株，與商業(yè)酵母BS6進(jìn)行發(fā)酵性能比較，發(fā)現(xiàn)其本地區(qū)域特色更濃郁（?uranská et al.，2016）。在對(duì)福建葡萄酵母菌分離和收集整理后，發(fā)現(xiàn)3株釀酒酵母菌株（VMH-M042、VSB1-M032和VSB2-L076）26S rDNA D1/D2區(qū)序列相同，選取VMH-M042釀酒酵母對(duì)其釀酒特性進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明，在相同的發(fā)酵條件下，釀酒酵母VMH-M042的釀酒性能（酒精度、總糖、還原糖和總酸）優(yōu)于市售酵母菌RV002、OFC、VF和OFC，因此，該釀酒酵母在本地葡萄酒生產(chǎn)方面可能具有更強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用價(jià)值。Liu等（2015）從新疆鄯善地區(qū)篩選的7株本土酵母菌比商業(yè)酵母菌F15可產(chǎn)生更多的酯類物質(zhì)，因此其感官評(píng)價(jià)最高。Senses-Ergul和Ozbas（2016）在安那托利亞葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中也篩選到4株各項(xiàng)性能比較優(yōu)良的酵母菌株。本研究從福建本地篩選分離的酵母菌發(fā)酵性能、代謝水平和香氣成分等還有待進(jìn)一步分析，以期為生產(chǎn)出具有顯著福建特色的葡萄酒提供良好的菌種來(lái)源。

4 結(jié)論

福建地區(qū)不同品種葡萄分離得到的酵母菌資源豐富，區(qū)域性差異明顯，特異性資源較多;其中釀酒酵母VMH-M042在葡萄酒發(fā)酵中表現(xiàn)出較優(yōu)良的釀酒性能，該研究可為福建地區(qū)乃至南方葡萄酒釀制提供豐富的菌種資源和理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

韓北忠，李雙石，陳晶瑜，段常青. 2007. 葡萄酒釀酒酵母菌基因工程改良[J]. 中國(guó)釀造，26（5）：1-3. doi：10.3969/j.issn.0254-5071.2007.05.001. [Han B Z，Li S S，Chen J Y，Duan C Q. 2007. Application of genetic engineering in the improvement of Saccharomyces cerevisiae wine strains[J]. China Brewing，26（5）：1-3.]

金光，陳志峰，柯冠武. 2006. 福建葡萄產(chǎn)業(yè)的前景與問(wèn)題[J]. 福建果樹(shù)，（1）：41-43. doi：10.3969/j.issn.1004-6089. 2006.01.017. [Jin G，Chen Z F，Ke G W. 2006. Prospect and problems of grape industry in Fujian[J]. Fujian Fruits，（1）：41-43.]

劉愛(ài)國(guó)，劉延琳，王澤舉，韓娜，胡勁光. 2008. 寧夏葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的分子生物學(xué)鑒定[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），36（11）：203-207. doi：10. 13207/j.cnki.jnwafu.2008.11.025. [Liu A G，Liu Y L，Wang Z J，Han N，Hu J G. 2008. Molecular identification of wild wine-related yeasts isolated from spontaneous wine fermentation in Ningxia district[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），36（11）：203-207.]

劉樹(shù)文，常亞維，胡廷，焦紅茹，劉麗麗. 2008. 不同樹(shù)齡葡萄自然發(fā)酵過(guò)程中酵母菌的研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），36（7）：51-56. doi：10.13207/j.cnki.jnwafu.2008.07.020. [Liu S W，Chang Y W，Hu T，Jiao H R，Liu L L. 2008. Study on yeasts of different ages of grape in the course of spontaneous fermentation[J]. Journal of Northwest A & F University（Natural Science Edition），36（7）：51-56.]

王鳳梅，馬利兵. 2016. 內(nèi)蒙古西部赤霞珠葡萄自然發(fā)酵酵母菌群的動(dòng)態(tài)變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（10）：340-343. doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.10.099. [Wang F M，Ma L B. 2016. Dynamic changes of yeast population in natural fermentation of Cabernet Sauvignon grape in western Inner Mongolia[J]. Jiangsu Agricultural Scien-ces，44（10）： 340-343.]

王慧，張立強(qiáng)，劉天明，王慶國(guó)，謝榮. 2008. 葡萄果粒表皮酵母菌多樣性研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，35（1）：10-14. doi：10.3969/j.issn.0253-2654.2008.01.004. [Wang H，Zhang L Q，Liu T M，Wang Q G，Xie R. 2008. Species diversity of yeasts on the surface of grape[J]. Microbiology China，35（1）：10-14.]

王澤舉，劉延琳，劉愛(ài)國(guó)，韓娜. 2008. 新疆葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程酵母菌的種類和動(dòng)態(tài)變化[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，27（5）：664-667. doi：10.13300/j.cnki.hnlkxb.2008.05.001. [Wang Z J，Liu Y L，Liu A G，Han N. 2008. Survey on yeast population dynamics during wine spontaneous fermentation in Xinjiang[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，27（5）：664-667.]

王志恒，馮翠娥，王沖，羅慧，鄒芳，劉雅琴，魏玉清. 2018. 寧夏玉泉營(yíng)地區(qū)釀酒葡萄酵母菌的分離篩選及分子鑒定[J]. 中國(guó)釀造，37（1）：112-115. [Wang Z H，F(xiàn)eng C E，Wang C，Luo H，Zou F，Liu Y Q，Wei Y Q. 2018. Scree-ning and molecular identification of yeast strains isolated from Yuquanying of Ningxia[J]. China Brewing，37（1）： 112-115.]

徐建坤，張旺，肖婧，程衛(wèi)東，史學(xué)偉. 2019. 紅提葡萄中酵母菌多樣性的研究[J]. 中國(guó)釀造，38（3）：40-45. doi：10. 11882/j.issn.0254-5071.2019.03.009. [Xu J K，Zhang W，Xiao J，Cheng W D，Shi X W. 2019. Diversity of yeast in red grape[J]. China Brewing，38（3）：40-45.]

許維娜，劉希萌，孔祥君，陳熙，李梅，耿常樂(lè). 2019. 田間施藥對(duì)自然發(fā)酵葡萄酒酵母菌群落結(jié)構(gòu)的影響[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，46（4）：721-728. doi：10.13344/j.microbiol.china.180332. [Xu W N，Liu X M，Kong X J，Chen X，Li M，Geng C L. 2019. Effect of pesticide application on the community structure of wine yeasts during spontaneous fermentation[J]. Microbiology China，46（4）：721-728.]

楊寬，毛如志，趙悅，何遲，王慧玲，曹建宏，速偉，何霞紅. 2018. 云南香格里拉葡萄酒產(chǎn)區(qū)釀酒相關(guān)酵母菌的生物多樣性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，45（12）：2708-2721. doi：10. 13344/j.microbiol.china.180065. [Yang K，Mao R Z，Zhao Y，He C，Wang H L，Cao J H，Su W，He X H. 2018. Biodiversity of wine-related yeasts isolated from Shangri-La wine-producing region of Yunnan[J]. Microbiology China，45（12）：2708-2721.]

楊瑩，管敬喜，謝林君，張勁，文仁德，成果. 2016. 廣西毛葡萄產(chǎn)區(qū)野生葡萄酒酵母種群分布與系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，47（7）：1123-1128. [Yang Y，Guan J X，Xie L J，Zhang J，Wen R D，Cheng G. 2016. Population distribution and phylogenetics of wine yeast in Vitis quinquangularis Rehd. producing area of Guangxi[J]. Journal of Southern Agriculture，47（7）：1123-1128.]

張俊杰，楊旭，郭晨，步陽(yáng)陽(yáng)，李明陽(yáng)，張文葉，劉崇懷. 2017. 巨峰葡萄自然發(fā)酵不同階段酵母菌的組成及差異分析[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，51（3）：383-389. doi：10.16445/j.cnki.1000-2340.2017.03.016. [Zhang J J，Yang X，Guo C，Bu Y Y，Li M Y，Zhang W Y，Liu C H. 2017. Analysis of composition and difference of yeast populations in di-fferent stages of natural fermentation of Kyoho grape[J]. Journal of Henan Agricultural University，51（3）：383-389.]

趙雪平，溫雅嬌，李正英，鄭海武，黃海英，李曉娟. 2020. 內(nèi)蒙古烏海地區(qū)沙漠葡萄發(fā)酵醪液中釀酒酵母菌的篩選與鑒定[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，41（5）：164-170. doi：10. 12161/j.issn.1005-6521.2020.05.027. [Zhao X P，Wen Y J，Li Z Y，Zheng H W，Huang H Y，Li X J. 2020. Scree-ning and identification of Saccharomyces cerevisiae in fermentation mash of desert grape in Wuhai Area of Inner Mongolia[J]. Food Research and Development，41（5）： 164-170.]

Alexandre H. 2020. Wine yeast terroir：Separating the wheat from the chaff—for an open debate[J]. Microorganisms，8（5）：787. doi：10.3390/microorganisms8050787.

Berradre M，Aiello-Mazzarri C，Mesa L，Arraiz N，Prieto C，Ortega J，Sulbarán B，de Rodríguez G J，F(xiàn)ernández V，Martínez J，Esteve-Zarzoso B. 2012. Yeasts population dynamics during the spontaneous fermentation of white grape variety Malvasía[J]. Revista de la Facultad de Agronomia，29（3）：453-474.

Bezerra-Bussoli C，Baffi M A，Eleni G. 2013. Yeast diversity isolated from grape musts during spontaneous fermentation from a Brazilian winery[J]. Current Microbiology，67（3）：356-361. doi：10.1007/s00284-013-0375-9.

Capece A，Granchi L，Guerrini S，Mangani S，Romaniello R，Vincenzini M，Romano P. 2016. Diversity of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from two Italian wine-producing regions[J]. Frontiers in Microbiology，7：1018. doi：10.3389/fmicb.2016.01018.

Csoma H，Sipiczki M. 2008. Taxonomic reclassification of Candida stellata strains reveals frequent occurrence of Candida zemplinina in wine fermentation[J]. FEMS Yeast Research，8（2）：328-336. doi：10.1111/j.1567-1364.2007. 00339.x.

Guillamón J M，Sabaté J，Barrio E，Cano J，Querol A. 1998. Rapid identification of wine yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spa-cer（ITS） region[J]. Archives of Microbiology，169（5）：387-392. doi：10.1007/s002030050587.

Kurtzman C P，Robnett C J. 1998. Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit（26S） phylogeny of ribosomal DNA partical sequences[J]. Antonie van Leeuwenhoek，73（4）：331-337. doi：10.1023/a：1001761008817.

Li E，Liu C H，Liu Y L. 2012. Evaluation of yeast diversity during wine fermentations with direct inoculation and pied de cuve method at an industrial scale[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology，22（7）：960-966. doi： 10. 4014/jmb.1111.11013.

Liu N，Qin Y，Song Y Y，Ye D Q，Yuan W，Pei Y F，Xue B，Liu Y L. 2015. Selection of indigenous Saccharomyces cerevisiae strains in Shanshan County（Xinjiang，China） for winemaking and their aroma-producing characteristics[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，31（11）：1781-1792. doi：10.1007/s11274-015-1929-8.

Maro E D，Ercolini D，Coppola S. 2007. Yeast dynamics du-ring spontaneous wine fermentation of the Catalanesca grape[J]. International Journal of Food Microbiology，117（2）：201-210. doi：10.1016/j.ijfoodmicro.2007.04.007.

Nisiotou A，Mallouchos A，Tassou C，Banilas G. 2019. Indigenous yeast interactions in dual-starter fermentations may improve the varietal expression of moschofilero wine[J]. Frontiers in Microbiology，10：1712. doi： 10.3389/fmicb. 2019.01712.

Padilla B，Gil J V，Manzanares P. 2016. Past and future of non-Saccharomyces yeasts：From spoilage microorgani-sms to biotechnological tools for improving wine aroma complexity[J]. Frontiers in Microbiology，7：411. doi：10. 3389/fmicb.2016.00411.

Pallmann C L，Brown J A，Olineka T L，Cocolin L，Mills D A，Bisson L F. 2001. Use of WL medium to profile native flora fermentations[J]. American Journal Enology and Viticulture，52（3）：198-203. doi：10.1016/S0065-2164（01）49013-7.

Raspor P，Milek D M，Polanc J，Mo?ina S S，?ade? N. 2006. Yeasts isolated from three varieties of grapes cultivated in different locationsof the Dolenjska vine-growing region，Slovenia[J]. International Journal of Food Microbio-logy，109（1-2）：97-102. doi：10.1016/j.ijfoodmicro.2006. 01.017.

Senses-Ergul S，Ozbas Z Y. 2016. Characterization of some indigenous Saccharomyces cerevisiae isolates obtained du-ring vinification of ‘Kalecik Karasi and ‘EMIR grapes grown in Central Anatolia[J]. Ciência E TécnicaVitivinícola，31（2）：51-62. doi：10.1051/ctv/20163102051.

?uranská H，Vránová D，Omelková J. 2016. Isolation，identification and characterization of regional indigenous Saccharomyces cerevisiae strains[J]. Brazilian Journal of Microbiology，47（1）：181-190. doi：10.1016/j.bjm.2015.11. 010.

（責(zé)任編輯 羅 麗）