E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價值及意義

周淑敏 宋艷芳 張麗華

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是甲狀腺癌常見病理類型，以淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為主要特點，通常女性發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于男性[1]。近年來，該腫瘤發(fā)病率逐漸增加，雖然隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其臨床診斷準(zhǔn)確率得到保證，但是該腫瘤的生存率未得到顯著改善。相關(guān)研究顯示：患者年齡<45歲、腫瘤最大徑>1 cm、多灶病變可導(dǎo)致PTC中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險增加[2-3]。因此甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)靶基因的篩查對該癌癥的診斷意義重大。研究顯示：在PTC的低風(fēng)險和高風(fēng)險組中，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的表達(dá)存在差異，高風(fēng)險組織學(xué)變種的侵襲行為與細(xì)胞質(zhì)E-鈣粘著蛋白的表達(dá)增加有關(guān)[4-5]。另外也有研究顯示：PTC組織中TSHR基因啟動子區(qū)常出現(xiàn)甲基化現(xiàn)象，并且與頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等密切相關(guān)，可能是引起該癌癥發(fā)展及轉(zhuǎn)移的機(jī)制之一[6-7]。鑒于此，本研究前瞻性選擇162例PTC患者的癌組織及癌旁組織樣本，采用免疫組化和實時熒光定量甲基化特異性PCR(q MSP)法分別檢測患者PTC病灶組織及癌旁組織中及E-cadherin和TSHR啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，并進(jìn)一步對E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化在甲狀腺乳頭狀癌中的診斷價值及意義進(jìn)行分析，以期對該癌癥的診斷及發(fā)病機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年6月至2020年6月于周口市中心醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)的162例甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織標(biāo)本為本次研究對象。所有PTC患者均未接受過放化療及免疫治療、無其他嚴(yán)重并發(fā)癥及惡性腫瘤且臨床資料完整。所有患者中，鱗癌89例、腺癌73例；TMN分期：Ⅰ期43例、Ⅱ期61例、Ⅲ期39例、Ⅳ期19例；頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移70例、未發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移92例；取65例癌旁組織標(biāo)本作為對照。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化(SP法)檢測E-cadherin表達(dá) 采用免疫組化(SP法)檢測PTC癌組織及癌旁組織中E-cadherin的表達(dá)：采用鼠抗人E-cadherin單克隆抗體及免疫組織化學(xué)試劑盒(購自美國賽默飛世爾科技公司hermo Fisher Scientific)，將組織固定，然后根據(jù)石蠟切片制作流程包埋并切片，根據(jù)試劑盒說明書流程進(jìn)行染色，最后DBA顯色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。采用雙盲法，由我院病理科兩位醫(yī)師按照表1對染色結(jié)果進(jìn)行陽性判斷。

表1 陽性判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2 甲基化特異性PCR(Methylation specific PCR，MSP)法檢測TSHR甲基化[8]采用MSP法檢測PTC癌組織及癌旁組織中TSHR甲基化情況。即從癌組織及癌旁組織樣本中提取DNA，采用DNA亞硫酸氫鹽處理試劑盒(購自ZYMO RESEARCH)對DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾，將已修飾的DNA作為模板，在ProFlex PCR儀(廠家：美國賽默飛世爾科技公司hermo Fisher Scientific，貨號：4484075)中利用甲基化和非甲基化特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行設(shè)置和操作，然后通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.3 診斷結(jié)果計算

靈敏度=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陰性數(shù))×100%；特異性=真陰性數(shù)/(假陽性數(shù)+真陰性數(shù))×100%；準(zhǔn)確性=真陽性數(shù)/(真陽性數(shù)+假陽性數(shù))×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，所得數(shù)據(jù)資料均為計數(shù)資料，以(%)表示，組間比較采用卡方檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 E-cadherin和TSHR在癌組織中表達(dá)及甲基化程度比較

與癌旁組織相比，癌組織組E-cadherin高表達(dá)、TSHR甲基化以及兩者聯(lián)合檢測陽性例數(shù)均顯著高于癌旁組織(P均<0.001)，見表2。

表2 各組E-cadherin和TSHR在癌組織中表達(dá)及甲基化程度比較(例，%)

2.2 E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化與患者主要臨床特征的相關(guān)性

E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化PTC患者例數(shù)在不同腫瘤直徑患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC患者E-cadherin高表達(dá)例數(shù)顯著高于低表達(dá)PTC患者，TSHR甲基化PTC患者例數(shù)顯著高于非甲基化PTC患者，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，見表3。

表3 E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化與患者主要臨床特征的相關(guān)性(例，%)

2.3 兩個指標(biāo)對PTC診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性比較分析

E-cadherin高表達(dá)聯(lián)合TSHR甲基化對PTC診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性較單項檢測均出現(xiàn)上升趨勢，但僅靈敏度與單一檢測相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 兩個指標(biāo)對PTC診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性比較分析/%

3 討論

PTC是甲狀腺癌中最常見的腫瘤類型之一，約占80%，為分化程度高且預(yù)后良好的一種類型，但是淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(lymph node metastasis,LNM)在PTC中較為常見且預(yù)后不良，近年來其發(fā)病率急劇增長，因此其早期診斷對癌癥的治療及生存率的提升至關(guān)重要[9-11]。相關(guān)研究提出：人類癌癥臨床結(jié)果的改善需要表征其發(fā)病機(jī)理的遺傳改變，針對PTC來說，西方人群中已揭示出多種致癌驅(qū)動因素，這對于該癌癥的致病機(jī)制的探索至關(guān)重要，而到目前為止，中國PTC患者的遺傳狀況仍未完全闡明[12]。此外，遺傳變異和臨床病理特征的綜合分析表明，激酶基因融合與PTC診斷時年齡較小，腫瘤較大和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外有研究通過分析PTC中RET基因融合的DNA重排位點，PTC與RET融合事件相關(guān)的染色體易位的也有關(guān)[13]。因此近年來與PTC診斷相關(guān)的靶基因研究中涉及到多種基因的表達(dá)和甲基化檢驗：如：p16、NIS、TSHR等基因的甲基化以及標(biāo)志物TGF-β1、CK19、CK19和CD31等蛋白的表達(dá)。

E-cadherin是Cadherin家族中的一員，主要分布于上皮組織中，介導(dǎo)細(xì)胞間的粘附功能，研究顯示其可能與甲狀腺乳頭狀癌的侵襲以及其發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)，并對其診斷具有重要意義[4,14]。TSHR基因是甲狀腺點代謝的關(guān)鍵基因，其甲基化是PTC組織中頻發(fā)的分子事件，與腫瘤的進(jìn)展相關(guān)并提示PTC患者的不良預(yù)后[8]。本研究前瞻性選擇162例甲狀腺乳頭狀癌患者的癌組織及65例癌旁組織樣本，分別采用免疫組化(SP法)和甲基化特異性PCR(MSP)法檢測E-cadherin表達(dá)情況和TSHR甲基化程度，E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化在PTC患者中的診斷結(jié)果顯示：癌組織組E-cadherin高表達(dá)、TSHR甲基化以及兩者聯(lián)合檢測陽性例數(shù)均顯著高于癌旁組織(P均<0.001)，表明在PTC癌組織中E-cadherin呈現(xiàn)高表達(dá)且TSHR甲基化程度增加，與前人研究結(jié)果一致[4,15]。

另外，E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化PTC患者例數(shù)在不同腫瘤直徑患者中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移PTC患者E-cadherin高表達(dá)例數(shù)顯著高于低表達(dá)PTC患者，TSHR甲基化PTC患者例數(shù)顯著高于非甲基化PTC患者，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01)，表明：E-cadherin的高表達(dá)和TSHR的甲基化預(yù)示著PTC患者發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且臨床分期程度較高，從而對該癌癥的臨床診斷具有一定價值。此外，E-cadherin高表達(dá)聯(lián)合TSHR甲基化對PTC診斷的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性較單項檢測均出現(xiàn)上升趨勢，但僅靈敏度與單一檢測相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明：E-cadherin表達(dá)聯(lián)合TSHR甲基化檢測在PTC的診斷中具有較高靈敏度，而在本研究中，E-cadherin高表達(dá)聯(lián)合TSHR甲基化對PTC診斷的特異性和準(zhǔn)確性雖數(shù)值上有所增加，但是差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這可能與本研究中納入的樣本量，尤其是癌旁組織樣本量較少有關(guān)，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量對該問題進(jìn)行深入計算和分析。

綜上，E-cadherin表達(dá)和TSHR甲基化與PTC患者頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及TNM分期密切相關(guān)，且E-cadherin高表達(dá)聯(lián)合TSHR甲基化對PTC臨床診斷具有較好的靈敏度。