血清miR-1182、CRNDE水平與鼻咽癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相關(guān)性

高 峰

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是耳鼻咽喉科常見惡性腫瘤，病因復(fù)雜，多認(rèn)為與遺傳、病毒感染等因素有關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查顯示，NPC發(fā)病率逐年升高[1]。NPC具有高度轉(zhuǎn)移性、侵襲性，研究表明，60%～85%的患者就診時(shí)，腫瘤已發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失最佳手術(shù)治療時(shí)機(jī)[2]。因此，明確可能導(dǎo)致NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子及預(yù)測(cè)因子，對(duì)指導(dǎo)早期合理治療尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，易感TERT基因中多種靶微小核糖核酸(micorRNA，miR)與NPC的發(fā)展存在密切聯(lián)系，miR-1182是易感TERT基因靶基因的一種，具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲等作用，可遏制腫瘤細(xì)胞進(jìn)程[3-4]。結(jié)直腸腫瘤差異表達(dá)基因(colon rectal neoplasia differentially expressed，CRNDE)是LncRNA家族的一員，作用與促癌基因類似，已有研究證實(shí)，CRNDE在直腸癌、胃癌等多種惡性腫瘤中呈過表達(dá)，且會(huì)增加預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)[5]。結(jié)合miR-1182、CRNDE機(jī)制猜測(cè)，二者可能與NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系，且可評(píng)估淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，但與之相關(guān)研究的較少，且具體機(jī)制尚未明確。鑒于此，本研究通過觀察NPC患者血清miR-1182、CRNDE表達(dá)情況，分析miR-1182、CRNDE表達(dá)與NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，旨在為未來NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移早期預(yù)測(cè)與治療方案的擬定提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

前瞻選取醫(yī)院2018年4月至2020年5月收治的93例NPC患者為研究對(duì)象。93例患者中男性52例，女性41例；年齡43～65歲，平均(54.40±3.38)歲；入院時(shí)卡氏(Karnofsky，KPS)[6]評(píng)分52～83分，平均(67.87±4.57)分；TNM分期[7]：Ⅰ期19例，Ⅱ期23例，Ⅲ期34例，Ⅳ期17例。本研究的實(shí)施經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬均知情本項(xiàng)研究，并簽署研究知情同意書。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

①納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《現(xiàn)代腫瘤學(xué)(第三版)》[8]中NPC相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)穿刺活檢確診為低分化鱗癌；均為原發(fā)性腫瘤；精神正常，可正常配合交流；生活可自理。②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并胃癌、結(jié)腸癌等其他惡性腫瘤；合并先天性心臟病、腎衰竭等重要臟器病變；入組前接受放化療治療；合并感染性肺炎、乙肝等感染性疾病。

1.3 方法

1.3.1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移評(píng)估及分組 患者就診均接受CT檢查，結(jié)合影像學(xué)表現(xiàn)及相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[9]，評(píng)估患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：①橫斷面淋巴結(jié)最小橫直徑≥10 mm；②影像學(xué)檢查可見淋巴結(jié)中心壞死或呈環(huán)形強(qiáng)化；③1個(gè)區(qū)域內(nèi)存在≥3個(gè)淋巴結(jié)聚集、簇?fù)?，且最小直徑? mm；④淋巴結(jié)邊緣呈不規(guī)則強(qiáng)化，四周脂肪間隙全部或小部分消失；⑤咽喉部淋巴結(jié)最小直徑>4 mm。符合上述標(biāo)準(zhǔn)即判定為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，納為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，反之則納為淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組。

1.3.2 血清miR-1182、CRNDE檢測(cè) 于患者入院第2天，取晨起空腹肘靜脈血5 ml，置于肝素抗凝管內(nèi)，采用低速離心機(jī)以4 000 r/min轉(zhuǎn)速分離10 min，采集血清，置于-80 ℃冰箱內(nèi)貯存、待檢；采用mirVana PARIS試劑盒提取血清miR-1182、CRNDE總RNA，然后用UL2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定各RNA濃度，選取吸光度范圍為1.8～2.0的樣本，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其轉(zhuǎn)錄為cDNA；將cDNA作為模板，GAPDH作為參照，采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒、熒光定量分析儀對(duì)樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)，設(shè)定對(duì)應(yīng)合成引物及片段，PCR反應(yīng)體系為10 μL，細(xì)分為cDNA樣本1 μL，10 μmol/L上游引物、下游引物各1 μL，2.5×dNTPMIX 4 μL，RNase-free H2O 2 μL，primeSTAY 1 μL；循環(huán)參數(shù)設(shè)定：先于90 ℃下預(yù)變性30 s，后于95 ℃下循環(huán)5 s、65 ℃下循環(huán)30 s、72 ℃下循環(huán)5 s，共設(shè)定40個(gè)循環(huán)，最后在4 ℃下延伸10 min；采用StepOneTM軟件收集信號(hào)，以熔解曲線分析樣本表達(dá)，miR-1182相對(duì)表達(dá)量用Log102-△Ct法計(jì)算，CRNDE表達(dá)量用2-△△Ct法計(jì)算。

1.3.3 基線資料調(diào)查 設(shè)計(jì)基線資料填寫表，詢問并記錄NPC患者基線資料，內(nèi)容包括：一般資料[性別(男、女)、年齡、入院時(shí)KPS評(píng)分、TNM分期(Ⅰ～Ⅳ期)、合并癥(高血壓：收縮壓水平≥140 mmHg，舒張壓水平≥90 mmHg；糖尿?。嚎崭寡撬健?.0 mmol/L)]、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)：取患者空腹肘部靜脈血5 ml，以4000 r/min轉(zhuǎn)速分離10 min，采集血清用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定]等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況

93例NPC患者中有56例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移率為60.22%(56/93)。

2.2 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及未轉(zhuǎn)移NPC患者相關(guān)基線資料比較

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組VEGF、CRNDE表達(dá)高于未轉(zhuǎn)移組，miR-1182表達(dá)低于未轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組間其他基線資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未轉(zhuǎn)移NPC患者相關(guān)基線資料比較

2.3 各主要指標(biāo)與NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的回歸分析

將2.2中比較差異有意義的變量納入作為自變量，將NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況作為因變量(1=轉(zhuǎn)移，0=未轉(zhuǎn)移)，經(jīng)二元Logistic回歸分析后，將2.2中全部資料納入，建立多元回歸模型，結(jié)果顯示，VEGF、miR-1182、CRNDE異常表達(dá)可能與NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，VEGF過表達(dá)、miR-1182低表達(dá)、CRNDE過表達(dá)可能是NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子(OR>1，P<0.05)。見表2。

表2 各主要指標(biāo)與NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移關(guān)系的回歸分析結(jié)果

2.4 血清miR-1182、CRNDE預(yù)測(cè)NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值分析

繪制ROC曲線發(fā)現(xiàn)(見圖1、2)，miR-1182、CRNDE預(yù)測(cè)NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的AUC分別為0.809、0.808，均有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，且在二者cut-off值分別取0.585、3.565時(shí)，取特異度、靈敏度。相關(guān)參數(shù)見表3。

表3 血清miR-1182、CRNDE預(yù)測(cè)NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值分析結(jié)果

圖1 miR-1182預(yù)測(cè)NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值ROC曲線圖

圖2 CRNDE預(yù)測(cè)NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)價(jià)值分析ROC曲線圖

3 討論

放射治療是NPC首選治療方案，明確腫瘤侵襲范圍、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，對(duì)擬定合理治療方案具有重要指導(dǎo)作用。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是NPC常見特征，研究顯示，23.9%～75%的NPC患者首發(fā)癥狀即為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，這類患者因早期無特異性表現(xiàn)，可能無法接受理想的針對(duì)性治療，且治療難度較高，預(yù)后相對(duì)較差[10]。因此，積極找出可能導(dǎo)致NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因子及可能的預(yù)測(cè)因子，對(duì)指導(dǎo)疾病的早期防治意義重大。

TERT基因是NPC患者主要易感基因之一，其表達(dá)與腫瘤細(xì)胞發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后均有一定關(guān)系，可作為NPC預(yù)后評(píng)估新型標(biāo)志物[11]。miR-1182是TERT基因的一種靶標(biāo)miR，其表達(dá)可反映TERT基因水平，據(jù)報(bào)道，miR-1182可結(jié)合TERT基因中3UTR區(qū)域，抑制TERT基因反轉(zhuǎn)錄，且可削弱腫瘤細(xì)胞增殖能力，從而阻止腫瘤進(jìn)展[12-13]。章凱等[14]研究顯示，NPC患者血清miR-1182顯著低于健康人，且該基因表達(dá)量與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均呈負(fù)相關(guān)。CRNDE作為長(zhǎng)鏈非編碼RNA，最早發(fā)現(xiàn)于結(jié)直腸癌組織中，但隨著臨床深入研究發(fā)現(xiàn)，CRNDE在多種惡性腫瘤中均有表達(dá)，且可通過多種渠道調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞功能，影響患者預(yù)后[15]。Yang等[16]研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織中CRNDE呈高表達(dá)，且其表達(dá)情況與疾病分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均存在一定關(guān)系。潘國(guó)剛等[17]研究發(fā)現(xiàn)，NPC患者血清CRNDE表達(dá)量高于健康人，且早期檢測(cè)CRNDE有助于評(píng)估NPC病情，指導(dǎo)臨床干預(yù)。結(jié)合miR-1182、CRNDE在NPC患者血清中表達(dá)及二者作用機(jī)制猜測(cè)，二者與NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)系。

為證實(shí)猜測(cè)，本研究初步比較發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者的基線資料及實(shí)驗(yàn)室主要指標(biāo)，結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組CRNDE表達(dá)高于未轉(zhuǎn)移組，miR-1182表達(dá)低于未轉(zhuǎn)移組，初步表明CRNDE、miR-1182與NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能參與了NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移過程；經(jīng)二元Logistic回歸分析后建立多元回歸模型，結(jié)果顯示，miR-1182低表達(dá)、CRNDE過表達(dá)均可能是NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)因子，并在進(jìn)一步的ROC曲線繪制后發(fā)現(xiàn)，CRNDE、miR-1182表達(dá)用于預(yù)測(cè)NPC患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有較理想的價(jià)值，當(dāng)miR-1182、CRNDE cut-off值分別取0.585、3.565時(shí)，可獲得最佳預(yù)測(cè)價(jià)值，且隨著miR-1182水平降低、CRNDE水平升高，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)增加，證實(shí)猜測(cè)。

除miR-1182、CRNDE外，本研究還發(fā)現(xiàn)，VEGF過表達(dá)也會(huì)增加NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。VEGF是作用較強(qiáng)的促血管生成因子，該因子過表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤新血管生成，提高血管通透性，且可使腫瘤細(xì)胞侵入脈管系統(tǒng)，推進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。而腫瘤新血管生成是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)重要途經(jīng)，不僅可為腫瘤細(xì)胞提供生長(zhǎng)所需營(yíng)養(yǎng)，還可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，從而增加NPC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[18]。但本研究經(jīng)二元Logistic回歸分析并建立Logistic多元回歸模型分析發(fā)現(xiàn)，VEGF過表達(dá)帶來的影響不及miR-1182、CRNDE，故未將其作為主要分析指標(biāo)，故關(guān)于VEGF在NPC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用價(jià)值還需進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

綜上所述，NPC患者就診時(shí)多數(shù)已伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，可能與miR-1182低表達(dá)、CRNDE過表達(dá)有關(guān)，考慮未來可通過檢測(cè)NPC患者就診時(shí)血清miR-1182、CRNDE水平，輔助評(píng)估患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，可能對(duì)指導(dǎo)早期合理治療展開有積極意義。