宮頸癌組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1的表達及臨床意義

易 韻 鄭子雯 楊小榮 婁 俊 楊心鳳

宮頸癌是女性最常見婦科惡性腫瘤，發(fā)病率排女性惡性腫瘤的第二位，僅次于乳腺癌。目前已明確持續(xù)高危型HPV感染是其發(fā)病原因，但HPV致宮頸癌的具體發(fā)病機制及過程仍不清楚[1]。近年來自噬與腫瘤的關(guān)系引起了廣泛關(guān)注。自噬是細胞內(nèi)物質(zhì)代謝的重要途徑之一，它參與真核細胞的基礎(chǔ)代謝，具有高度保守性，在細胞穩(wěn)態(tài)及能量再利用方面發(fā)揮重要的作用。然而近些年研究表明，自噬調(diào)控機制的失活與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。自噬相關(guān)基因1(Beclin1)是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因[3]。本研究通過檢測Beclin1蛋白在宮頸癌中的表達情況，探討其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選用2018年至2019年在江西省腫瘤醫(yī)院婦瘤科行手術(shù)治療的首診宮頸癌患者40例，術(shù)中取宮頸癌組織及癌旁組織(距離癌組織>3 cm、經(jīng)HE染色證實無癌細胞浸潤的正常宮頸組織)。患者年齡36～66歲，平均年齡48歲。按照FIGO2018子宮頸癌分期標準：Ⅰ期32例，Ⅱa期8例。鱗癌30例，腺癌8例，特殊類型2例；中、高分化25例，低分化15例。5例淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，35例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有標本的采集均取得患者或家屬的知情同意并經(jīng)我院倫理委員會批準。

1.2 入組標準

①術(shù)前宮頸活檢病理確診為宮頸癌；②術(shù)前未行放化療、免疫等腫瘤綜合治療；③沒有合并其他組織器官原發(fā)惡性腫瘤。

1.3 試劑

Beclin1小鼠抗人單克隆抗體，購自Abcam公司；通用型二抗及DAB顯色液，購自北京中杉金橋公司。

1.4 方法

采用免疫組化EnVision法染色，將切片脫蠟、水化，3%H2O2封閉：室溫孵育30 min，高壓熱修復抗原，一抗Beclinl 4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復染，1%鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封固。實驗用陽性乳腺癌標本作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。

1.5 結(jié)果判斷

Beclin1蛋白主要在細胞質(zhì)中表達，陽性表達為淡黃色至棕褐色顆粒。按細胞染色強度評分，共分4級：不顯色(0分)、淺黃色(1分)、棕黃色(2分)、棕褐色(3分)。每例隨機觀察5個高倍視野陽性區(qū)，計算陽性細胞所占百分比進行評分：陽性細胞率≤10%為1分，>10%～50%為2分，>50%為3分。最終將兩者相乘，結(jié)果判定：0分為陰性(-)；1～3分為弱陽性(+)；4～6分為陽性(++)；9分為強陽性(+++)。(-)為陰性表達，(+)～(+++)均為陽性表達。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗，相關(guān)性分析采用 Bivariate(Spearman)等級相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Beclin1免疫組化結(jié)果

本研究結(jié)果顯示Beclin1蛋白主要在細胞質(zhì)中表達，在宮頸癌組織中大多數(shù)表達呈陰性，少部分呈弱陽及中等陽性表達，極少部分(2例)強陽性表達，而在癌旁組織中大多數(shù)呈強陽性表達。Beclin1蛋白在宮頸癌及癌旁組織中陽性表達率分別為 42.5%(17/40)、95.0%(38/40)，差異有明顯統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。

表1 Beclin1蛋白在宮頸癌及癌旁組織中的表達/例

2.2 宮頸癌組織中Beclin1蛋白表達及臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系

Beclin1蛋白表達陽性率與腫瘤形態(tài)及病理類型無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與腫瘤的分化程度、浸潤深度及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(P<0.05)(表2)。

表2 宮頸癌組織中Beclin1蛋白表達與臨床病理參數(shù)的關(guān)系/例

3 討論

自噬是真核細胞中獨有的生命現(xiàn)象，它能使細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質(zhì)[4]。自噬在生理和病理生理方面均能調(diào)節(jié)細胞穩(wěn)態(tài)，但該過程的功能障礙可導致細胞死亡。自噬可以作為一種替代性的細胞死亡機制，類似于某些條件下的細胞凋亡，這被描述為Ⅱ型程序性細胞死亡[5]。研究表明，自噬可通過清除受損細胞器、啟動細胞程序性死亡來控制腫瘤細胞增殖，所以自噬可以保護我們生物體免受不同的疾病如感染、神經(jīng)退行性病及癌癥[6]。

隨著惡性腫瘤的發(fā)展，它們與其微環(huán)境相互作用，并可激活自噬，這是一種分解代謝過程[7]。近年來，腫瘤與凋亡、壞死的研究層出不窮，腫瘤與自噬的相關(guān)性研究成了近些年研究的熱點，相關(guān)研究甚多，目前自噬與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展成為大家研究的焦點。一方面，研究表明自噬可以通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)過氧化物的濃度、氧化應激水平、致瘤性突變積累等抑制腫瘤發(fā)生[8]，當然也有研究顯示自噬在某些腫瘤中表現(xiàn)較高的活性。自噬如何影響腫瘤生長尚有爭議。所以自噬研究在腫瘤的治療上具有廣闊的前景。研究表明[9]，自噬有望成為腫瘤治療的潛在干預靶點，為廣大惡性腫瘤患者治療開拓新的治療途徑，真正提高惡性腫瘤患者的臨床治愈率。

Beclin1作為重要的自噬相關(guān)蛋白，參與自噬和細胞凋亡，是胚胎發(fā)生和正常組織動態(tài)平衡所必需的。近年來，Beclin1的抗腫瘤作用受到越來越多的關(guān)注，它被鑒定為在自噬的溶酶體降解途徑中起關(guān)鍵作用的腫瘤抑制蛋白。實驗證據(jù)表明，Beclin-1單獨抑制腫瘤形成、血管生成和轉(zhuǎn)移，并與腫瘤抑制分子UVRAG，Bif-1，Ambra1和MDA-7/IL-24相互作用[10]。臨床上在大約40%的前列腺癌，50%的乳腺癌和75%的卵巢癌中都觀察到Beclin-1缺失[11-13]。為了深入研究Beclin1在宮頸癌患者病情進展中所起作用，本次研究通過檢測宮頸癌組織、癌旁組織中Beclin1蛋白的表達情況發(fā)現(xiàn)：與癌旁組織相比，宮頸癌組織中Beclin1蛋白陽性表達率顯著降低，說明Beclin1是抑癌相關(guān)基因，它的表達降低導致了宮頸癌的發(fā)生。同時對宮頸癌與臨床病理進行相關(guān)分析，結(jié)果顯示：Beclin1蛋白表達與宮頸癌腫瘤的浸潤深度、組織學分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，表現(xiàn)為腫瘤浸潤深肌層、低分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中Beclin1陽性表達率下降更明顯，與腫瘤的形態(tài)、病理類型無明顯相關(guān)性。統(tǒng)計結(jié)果表明：癌組織及癌旁組織中Beclin1表達差異提示其與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，而在不同分化程度、浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的差異表達提示其在宮頸癌的病情進展過程中扮演著重要角色，提示其與腫瘤的不良預后顯著相關(guān)。Beclin1可作為宮頸癌惡性程度、復發(fā)轉(zhuǎn)移的預測因子，臨床上可作為評估患者預后的一項指標。

目前臨床上幾乎所有惡性腫瘤的治療仍然是手術(shù)、放化療、免疫靶向等綜合治療，早期患者預后相對良好，然而中晚期患者治療效果差，生存期短。因此，在治療惡性腫瘤的研究道路上，迫切需要我們不斷地探索，尋求新的治療方法。從目前對自噬的研究來看，誘導腫瘤細胞自噬性死亡有望為腫瘤治療開拓新的治療策略。宮頸癌晚期患者放化療效果欠佳，一旦發(fā)生復發(fā)轉(zhuǎn)移，化療的效果非常有限，臨床上對宮頸癌復發(fā)轉(zhuǎn)移的治療非常棘手，所以迫切需要研究新的治療手段來改善晚期、復發(fā)性宮頸癌的治療效果，所以目前對自噬與宮頸癌的研究及對自噬調(diào)控機制的進一步研究將為開發(fā)宮頸癌新的治療策略提供理論依據(jù)。