基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析壯骨止痛方治療去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的基因表達(dá)差異

陳紅瓊，楊珊珊，陳瑤，郁潔，雷曉明

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208）

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量減少，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征的全身代謝性骨骼疾病［1］。其主要臨床表現(xiàn)為疼痛、腰膝酸軟、脊柱變形、易于骨折［2］。研究表明，骨骼代謝受到許多因素調(diào)節(jié)，包括激素、年齡、遺傳以及環(huán)境等［3］。其主要發(fā)病機(jī)制是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間骨重建過(guò)程的失衡，骨形成與骨吸收兩者之間的失衡［4］，但目前骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的分子機(jī)制尚不明確。骨質(zhì)疏松癥沒(méi)有根治的方法，現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)治療原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥普遍應(yīng)用抑制骨吸收類藥物、促骨形成類藥物和骨礦化類藥物，這些藥物在臨床上取得了顯著的治療效果，但長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)帶來(lái)較多不良反應(yīng)［5］。

壯骨止痛方是湖南省名中醫(yī)莫新民教授的經(jīng)驗(yàn)方，以古方補(bǔ)骨脂丸為基礎(chǔ)化裁而來(lái)，由淫羊藿、補(bǔ)骨脂、女貞子、枸杞、骨碎補(bǔ)、牛膝和狗脊組成，具有補(bǔ)益肝腎、壯骨止痛功效。前期研究已證明壯骨止痛方可以多途徑抑制骨吸收，促進(jìn)骨代謝，提高雌激素水平，對(duì)于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥具有良好的防治作用［6-7］。但其治療骨質(zhì)疏松癥的具體機(jī)制仍不清楚，因此，本研究基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析壯骨止痛方治療去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥的差異表達(dá)基因以及對(duì)相關(guān)通路的影響，尋找相關(guān)的基因靶點(diǎn)，以期為臨床應(yīng)用壯骨止痛方提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

KL05A 型醫(yī)用離心機(jī)（湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司）；991 型超低溫冰箱（賽默飛世爾科技有限公司）；Illumina 測(cè)序平臺(tái)（廣州市唯譽(yù)智合科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

壯骨止痛膠囊（四川美大康藥業(yè)股份有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：Z20050118）；戊巴比妥鈉（YaErbio公司，批號(hào)：20200422）；青霉素鈉（華北制藥股份有限公司，批號(hào)：F9102109）；紅細(xì)胞裂解液（合肥志宏生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：700577116）；大鼠淋巴細(xì)胞分離液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：20200616）。

1.3 動(dòng)物

SPF 級(jí)雌性SD 大鼠12 只，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)（1107272011003527），于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0009，飼養(yǎng)室溫度24～26 ℃，相對(duì)濕度50%～70%。人工12 h 晝/夜循環(huán)照明，分籠飼養(yǎng)。每日定時(shí)清洗籠舍，大鼠能自由攝食及飲水。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，造模前禁食12 h，自由飲水。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將12 只SD 大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、模型組，每組6 只。兩組均采用國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的雌性大鼠去卵巢3 個(gè)月造成絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型［8-9］。方法：大鼠用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）腹腔麻醉，在無(wú)菌條件下，從大鼠腰椎兩側(cè)摘除雙側(cè)卵巢。術(shù)后連續(xù)3 d 大腿肌內(nèi)注射青霉素納，每只大鼠4 萬(wàn)U/天，術(shù)后5 d 拆線。術(shù)后1 周開(kāi)始灌胃給藥，實(shí)驗(yàn)組給予壯骨止痛膠囊（567 mg/kg），模型組給予同體積的蒸餾水（1 mL/150 g），每日1次，連續(xù)13周。

2.2 樣本制備

13 周后，所有大鼠腹腔注射2% 戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）麻醉，經(jīng)腹腔主靜脈取血后，2 h內(nèi)用大鼠淋巴細(xì)胞分離液試劑盒按說(shuō)明收集PBMC，紅細(xì)胞裂解液裂解PBMC 中殘余紅細(xì)胞，隨機(jī)將各組每2 只大鼠的PBMC 合并為1 個(gè)樣本，每組3 個(gè)樣本，于液氮速凍后放-80 ℃保存，備用。

2.3 RNA提取及測(cè)序

將兩組的PBMC 樣本，共6 個(gè)樣本，送至廣州市唯譽(yù)智合科技有限公司進(jìn)行RNA 提取、建庫(kù)及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina測(cè)序平臺(tái)。

3 信息分析

3.1 差異表達(dá)基因分析

采用DEGSeq 分析差異表達(dá)基因，差異基因篩選主要參考差異倍數(shù)（Fold change 值）以及q值（Padj 值，矯正之后的Pvalue 值）作為相關(guān)指標(biāo)，通常選取|log2 Fold change|≥1 和q＜0.05 的差異基因作為顯著差異基因。

3.2 GO和KEGG富集分析

基于篩選出的差異表達(dá)基因（|log2 Fold change|≥1，q＜0.05），應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO和KEGG 富集分析，以校正后的q＜0.05 為閾值，滿足此條件的GO詞條和KEGG通路被認(rèn)為具有顯著性。

4 結(jié)果

4.1 差異表達(dá)基因分析結(jié)果

實(shí)驗(yàn)共獲得20 276 個(gè)轉(zhuǎn)錄組mRNA，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組共有10 166 個(gè)表達(dá)上調(diào)，10 110 個(gè)表達(dá)下調(diào)，見(jiàn)圖1。為差異表達(dá)基因及樣本垂直聚類結(jié)果的熱圖。DEGs 分析顯示，差異明顯的基因有149 個(gè)（|log2 Fold change|≥1，q＜0.05），67個(gè)基因上調(diào)，82個(gè)基因下調(diào)（見(jiàn)圖2）；進(jìn)一步篩選顯著差異基因（|log2 Fold change| ≥2，q＜0.01），共選出18 個(gè)顯著差異基因，其中上調(diào)基因15 個(gè)，下調(diào)基因3 個(gè)，具體信息見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與模型組外周血單個(gè)核細(xì)胞的差異表達(dá)基因

圖1 實(shí)驗(yàn)組與模型組差異基因的熱圖

圖2 實(shí)驗(yàn)組與模型組差異表達(dá)基因的火山圖

4.2 差異表達(dá)基因的GO富集分析

對(duì)差異基因（|log2 Fold change|≥1，q＜0.05）進(jìn)行GO 富集分析，結(jié)果顯示有45 個(gè)富集項(xiàng)（見(jiàn)圖3），差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞部分、膜部分、細(xì)胞器、細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、綁定分子類、催化活性等；進(jìn)一步校正檢驗(yàn)后的P值之后，以q＜0.05 為閾值，發(fā)現(xiàn)滿足此條件的差異表達(dá)基因中顯著富集的GO 條目有316 條，功能富集到生物過(guò)程的GO 條目有303 條（見(jiàn)表2，取顯著性最高的前10條）、細(xì)胞組分有4條（見(jiàn)表3）、分子功能有9條（見(jiàn)表4）。

表2 差異表達(dá)基因顯著性GO富集結(jié)果-生物過(guò)程

表3 差異表達(dá)基因顯著性GO富集結(jié)果-細(xì)胞組分

表4 差異表達(dá)基因顯著性GO富集結(jié)果-分子功能

圖3 實(shí)驗(yàn)組與模型組差異表達(dá)基因的GO統(tǒng)計(jì)柱狀圖

4.3 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對(duì)差異基因（|log2 Fold change|≥1，q＜0.05）進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到170條生物通路，結(jié)果顯示：上調(diào)基因主要參與細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、MAPK 信號(hào)通路、TNP 信號(hào)通路、吞噬體、趨化因子信號(hào)通路、癌癥通路、癌癥轉(zhuǎn)錄調(diào)控失調(diào)等通路（見(jiàn)圖4）；下調(diào)基因主要參與嘌呤代謝、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工、cGMP-PKG信號(hào)通路、黏著斑、IL-17信號(hào)通路、軸突引導(dǎo)等通路（見(jiàn)圖5）；進(jìn)一步校正檢驗(yàn)P值之后，以q＜0.05 為閾值，得到TNP 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、沙門(mén)氏菌感染三條顯著性富集的通路見(jiàn)表5。

表5 差異表達(dá)基因的顯著性富集通路

圖4 上調(diào)差異表達(dá)基因的KEGG分類

圖5 下調(diào)差異表達(dá)基因的KEGG分類

5 討論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松模型組與使用壯骨止痛方干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組的外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序，差異表達(dá)基因分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組與模型組差異表達(dá)基因有149 個(gè)，以|log2 Fold change| ≥1 和q＜0.05 作為篩選條件，上調(diào)基因有67 個(gè)，下調(diào)基因有82 個(gè)。GO 富集分析涉及生物過(guò)程、細(xì)胞組分以及分子功能三大類，差異表達(dá)基因主要富集在細(xì)胞部分、膜部分、細(xì)胞器、細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程、綁定分子類和催化活性等；校正P值后，在生物過(guò)程分類中，細(xì)胞遷移、免疫系統(tǒng)過(guò)程、防御反應(yīng)所占比例最多，其次是應(yīng)激反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的過(guò)程、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性、調(diào)節(jié)對(duì)外界刺激的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)等；在細(xì)胞組分分類中，細(xì)胞膜部分所占比列最多；在分子功能分類中，細(xì)胞因子受體活性所占比列最多，其次是整聯(lián)蛋白結(jié)合及受體結(jié)合類分子功能。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，顯著性富集的通路為T(mén)NF 信號(hào)通路、IL-17 信號(hào)通路、沙門(mén)氏菌感染三條通路，涉及相關(guān)差異基因有Cebpb、Cxcl2、Icam1、Jun、Mapk10、Ppbp、LOC100359515。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子成員之一（TNF-α）可以通過(guò)NF-κB 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和細(xì)胞外基質(zhì)的礦化［10］，白介素17（IL-17）可以顯著抑制骨保護(hù)素（OPG）和增強(qiáng)NF-κB 配體受體活化劑（RANKL），并且IL-17 可以通過(guò)TNF 受體相關(guān)因子6（TRAF6）、TANK 結(jié)合激酶1（TBK1）、c-Jun N 端激酶（JNK）或NF-κB 調(diào)節(jié)RANKL 和OPG 的表達(dá)［11］，而RANKL/RANK/OPG 系統(tǒng)是調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化、成熟和凋亡最重要的信號(hào)通路［12］。但是暫無(wú)沙門(mén)氏菌感染在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的相關(guān)報(bào)道。

在差異表達(dá)基因分析中，差異表達(dá)基因主要與脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病、骨質(zhì)疏松疾病、炎癥、腫瘤等疾病有關(guān)。如顯著性最高的G0S2，其參與機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝過(guò)程，與肥胖、糖尿病胰島素抵抗等脂質(zhì)代謝相關(guān)疾病密切相關(guān)［13］；Dgat2在脂質(zhì)代謝旺盛的組織中的表達(dá)水平最高，如肝臟、腎臟、白色脂肪組織等［14］；Fpr3參與多種生理和病理過(guò)程，包括防御反應(yīng)、炎癥、神經(jīng)退行性疾病、腫瘤、糖脂代謝紊亂相關(guān)疾病等［15］；Nefh 與肌肉萎縮，阿爾茨海默病、帕金森綜合征有關(guān)；Niacr1 可使小鼠結(jié)腸炎和結(jié)腸癌風(fēng)險(xiǎn)增加。但目前以上幾種基因在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道，其表達(dá)是否會(huì)影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

已有骨質(zhì)疏松相關(guān)報(bào)道的差異基因如Ccrl2 參與了chemerin 信號(hào)通路調(diào)節(jié)，研究發(fā)現(xiàn)，chemerin 與其受體CMKLR1、Ccrl2 在骨髓充質(zhì)干細(xì)胞和前成骨細(xì)胞的成脂化或成骨化的過(guò)程中起就決定性作用［16］，但目前有關(guān)Ccrl2 在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的報(bào)道很少；Csf3r 是一種蛋白質(zhì)編碼基因，其在破骨細(xì)胞上表達(dá)，在成骨細(xì)胞上不表達(dá)，與骨質(zhì)疏松癥的形成有一定關(guān)系［17］，但在慢性中性粒細(xì)胞白血病領(lǐng)域的研究更常見(jiàn)；LOC100359515 是誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）編碼基因，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。iNOS 產(chǎn)生一氧化氮（NO），可導(dǎo)致骨骼形成和雌激素缺失引起的骨吸收之間的不平衡［18］，這可能是治療骨質(zhì)疏松癥的重要靶點(diǎn)；Nlrp12 通過(guò)抑制NF-κB 誘導(dǎo)的破骨形成在骨中發(fā)揮保護(hù)作用，并在破骨刺激下下調(diào)，調(diào)節(jié)Nlrp12 水平可控制OC 前體中NF-κB 信號(hào)，改變骨穩(wěn)態(tài)和骨溶解反應(yīng)［19］；破骨細(xì)胞相關(guān)受體基因Oscar 在破骨細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用，可以使骨密度降低，是調(diào)控骨密度的重要候選基因［20］。在本研究中Nlrp12、Oscar 是上調(diào)基因，其可能是壯骨止痛方治療骨質(zhì)疏松癥的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

目前，關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，有關(guān)骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制研究也比不多，并且沒(méi)有根治的方法。近年來(lái)隨著科學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄水平研究，是研究疾病基因功能的重要手段之一。本研究通過(guò)基因差異表達(dá)分析和富集分析，篩選了壯骨止痛方干預(yù)去勢(shì)大鼠骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的基因和通路，但由于樣本量不多，隨機(jī)誤差和假陽(yáng)性難以排除，需要進(jìn)一步研究，且本研究是通過(guò)高通量測(cè)序結(jié)合基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)，還需后續(xù)的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。