固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定海水中12種抗生素*

姜明宏，王金鵬，趙陽(yáng)國(guó),2**

(1.中國(guó)海洋大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266100；2.中國(guó)海洋大學(xué)海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266100)

自20世紀(jì)30年代發(fā)現(xiàn)青霉素以來(lái)，抗菌藥物被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌感染類疾病的治療。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)和畜牧業(yè)中，抗生素作為飼料添加劑被廣泛應(yīng)用[1-2]。在許多國(guó)家，抗生素用于治療和預(yù)防動(dòng)物疾病來(lái)提高畜牧業(yè)生產(chǎn)力[3]。抗生素在生產(chǎn)生活過(guò)程中被釋放到環(huán)境中，對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成各種不良影響[4]。在水環(huán)境中，抗生素的長(zhǎng)期暴露會(huì)促進(jìn)抗生素抗性細(xì)菌的繁殖，抑制水生有益微生物的生長(zhǎng)[5]。據(jù)美國(guó)疾病預(yù)防控制中心估計(jì)，在美國(guó)每年至少有23 000人因體內(nèi)病源菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性而導(dǎo)致死亡[6]。

抗生素種類繁多，殘留基質(zhì)復(fù)雜，使得抗生素難以定性定量檢測(cè)。目前檢測(cè)抗生素殘留的分析方法有表面等離子體共振法[7]、熒光偏振免疫分析法[8]、化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法[9]、液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]等。基于多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式的高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)具有檢測(cè)靈敏度高、線性動(dòng)態(tài)范圍寬、檢出限低、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，在抗生素分析中得到廣泛應(yīng)用。例如，杜鵑等[11]使用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)對(duì)水中6類23種抗生素進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，23種抗生素的加標(biāo)回收率為47.3%～132.6%，方法檢出限范圍為0.1～2.9 ng/L；封孟娟等[12]使用電噴霧離子化正離子(ESI+)掃描MRM模式對(duì)5類40種抗生素進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，40種抗生素的加標(biāo)回收率為41.3%～112.6%，在1～200 μg/L水平下線性關(guān)系良好。

海水組成復(fù)雜，存在固相萃取目標(biāo)物不完全、儲(chǔ)存過(guò)程中目標(biāo)物易流失等問(wèn)題，同時(shí)在檢測(cè)殘留抗生素時(shí)，往往還出現(xiàn)基質(zhì)干擾效應(yīng)。為提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，添加回收率替代物13C3-咖啡因可以有效表征目標(biāo)抗生素在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的回收率。Zhang等[13]在檢測(cè)萊州灣海域抗生素濃度時(shí)，在固相萃取前添加13C3-咖啡因，用于表征在分析過(guò)程中目標(biāo)抗生素可能產(chǎn)生的損失。

本研究采用固相萃取-高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(SPE-HPLC-MS/MS)技術(shù)，建立了海水中3類(磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類)12種抗生素和一種回收率替代物13C3-咖啡因同步定性定量分析的方法，應(yīng)用本方法對(duì)萊州灣海域21個(gè)海水點(diǎn)位進(jìn)行抗生素檢測(cè)。該方法可為萊州灣海域抗生素類污染物的環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)提供參考依據(jù)，也為了解我國(guó)海水環(huán)境中抗生素的賦存水平提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方案

1.1 儀器與試劑

HPLC-MS/MS系統(tǒng)：AB-Sciex Qtrap 4500質(zhì)譜連接賽默飛Ultimate 3000液相色譜儀組成，聯(lián)接接口為ESI源；Oasis HLB固相萃取柱(200 mg/6 mL，美國(guó)Waters公司)；24管防交叉污染SPE裝置(美國(guó)Mediwax公司)；DC-12型氮吹儀(上海安譜公司)。

Milli Q超純水(美國(guó)Millipore公司)；甲醇和乙腈(色譜純，德國(guó)Merck公司)；甲酸和甲酸銨(色譜純，美國(guó)Sigma公司)。

12種抗生素標(biāo)準(zhǔn)品：鹽酸四環(huán)素(TC，純度≥99%)、鹽酸金霉素(CTC，純度≥99.9%)、土霉素(OTC，純度≥98%)、強(qiáng)力霉素(DC，純度≥98%)、磺胺嘧啶(SDZ，純度≥99%)、磺胺甲惡唑(SMZ，純度≥99%)、磺胺甲基嘧啶(SMR，純度≥99%)和磺胺二甲基嘧啶(SM2，純度≥99%)均購(gòu)于阿拉丁公司(中國(guó)，上海)。諾氟沙星(NOR，純度≥99%)、環(huán)丙沙星(CPFX，純度≥99%)、依諾沙星(ENO，純度≥99%)和恩諾沙星(ENRO，純度≥99%)均購(gòu)自于麥克林公司(中國(guó)，上海)。替代物13C3-咖啡因(13C3-caffeine，劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室)。

分別稱取一定量的抗生素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，吸取回收率替代物13C3-咖啡因，用甲醇配制成1 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于-20 ℃冰箱中待用。

1.2 樣品采集及前處理方法

在2019年5月，采集了萊州灣海域的21個(gè)采樣點(diǎn)的水樣。在水深3 m以內(nèi)的海域所采集樣品為表層水，即在0.2 m處采樣。在水深為16 m海域所采集樣品為表層水(0.2 m)、中層水(8 m)和底層水(15 m)。每個(gè)采樣點(diǎn)用體積為1 L的棕色玻璃瓶采集水樣3 L，在低溫條件下保存并運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，1周之內(nèi)完成水樣的前處理過(guò)程。

水樣經(jīng)0.45 μm混合纖維濾膜過(guò)濾，并量取1 L，加入回收率替代物13C3-咖啡因50 ng和0.2 g EDTA-Na。用鹽酸將pH調(diào)至4，在Oasis HLB SPE小柱(200 mg/6 mL)上進(jìn)行富集。上樣前，依次用10 mL甲醇、10 mL超純水和6 mL pH=4的鹽酸水溶液對(duì)萃取小柱進(jìn)行活化平衡；上樣時(shí)，設(shè)置流速為5 mL/min；上樣完成后先用10 mL超純水淋洗萃取小柱，后用氮?dú)鈱?duì)萃取小柱吹掃10 min，最后用甲醇-乙腈溶液(1∶1，v/v)進(jìn)行洗脫。在30 ℃條件下，氮吹儀將洗脫液氮吹至近干，加入10%甲醇溶液并定容至1 mL。復(fù)溶后樣品過(guò)0.22 μm水相濾膜，待測(cè)。

1.3 HPLC-MS/MS條件

1.3.1 HPLC條件 色譜柱：Waters Xterra MS C18(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)；進(jìn)樣體積：5 μL；柱溫：30 ℃；流速：0.25 mL/min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸銨溶液；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫程序：0～12 min，10%～60% 流動(dòng)相B；12～16 min，60%流動(dòng)相B；16～18 min，60%～10%流動(dòng)相B；18～24 min，10%流動(dòng)相B。

1.3.2 MS/MS條件 根據(jù)3類抗生素分子結(jié)構(gòu)中的基團(tuán)特征，同時(shí)參考文獻(xiàn)[14-16]，采用電噴霧離子源(ESI)，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，正離子模式，電噴霧電壓(IS)5500 V，霧化溫度(TEM)450 ℃，霧化氣壓力(GS1)379 kPa，輔助氣壓力(GS2)379 kPa，氣簾氣壓力(CUR)275.8 kPa，入口電壓(EP)15 V，碰撞室射出電壓(CXP)2 V，干燥器霧化氣均為液氮。

12種目標(biāo)抗生素和1種回收率替代物13C3-咖啡因分別配成50 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，注入質(zhì)譜儀，在ESI+條件下[M+H]+離子峰在質(zhì)譜分析中被得到，通過(guò)優(yōu)化碰撞能和去簇電壓，分析二級(jí)信號(hào)并選擇較強(qiáng)的2個(gè)母離子與子離子組成定量與定性離子對(duì)，進(jìn)行MRM模式檢測(cè)。測(cè)定12種抗生素和1種回收率替代物的質(zhì)譜參數(shù)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 目標(biāo)物與替代物的MRM模式檢測(cè)參數(shù)Table 1 MRM parameters of 12 compounds,and substitute

1.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

準(zhǔn)確量取12種抗生素和13C3-咖啡因，配制成標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1 000 μg/L)。用甲醇對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行稀釋，獲得濃度分別為1、5、10、20、50、100和200 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入HPLC-MS/MS后建立定量離子峰面積(y)與質(zhì)量濃度(x，μg/L)的線性關(guān)系。

將海水過(guò)0.45 μm濾膜，并進(jìn)行121 ℃高溫滅菌30 min，在處理過(guò)的海水中加入12種抗生素和13C3-咖啡因混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成5和50 ng/L的2個(gè)質(zhì)量濃度水平的水樣。對(duì)加標(biāo)水樣進(jìn)行加標(biāo)回收率的測(cè)定，并對(duì)未加抗生素的海水樣品進(jìn)行背景抗生素檢測(cè)。水樣固相萃取后進(jìn)行HPLC-MS/MS測(cè)定，計(jì)算檢出限、定量限和回收率(n=3)。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件優(yōu)化

在多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)下，優(yōu)化碰撞能量(CE)，以使目標(biāo)抗生素有最大峰面積(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、強(qiáng)力霉素、依諾沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星最佳CE值為20 eV，磺胺二甲基嘧啶、土霉素、金霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、13C3-咖啡因?yàn)?5 eV，磺胺甲惡唑?yàn)?5 eV。四環(huán)素類抗生素的CE值與Na等[17]所描述的相似，但部分磺胺類和喹諾酮類抗生素的CE值比本研究高5 eV。此外，通過(guò)優(yōu)化去簇電壓(DP)，以使檢測(cè)目標(biāo)抗生素的最大峰面積(見(jiàn)圖1)。結(jié)果表明：磺胺嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基嘧啶、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星的DP值為20 V，磺胺甲惡唑、金霉素、四環(huán)素、依諾沙星、恩諾沙星、諾氟沙星為25 V，土霉素為30 V，13C3-咖啡因?yàn)?5 V。

2.2 液相色譜條件優(yōu)化

分別考察了Waters Xterra MS C18(100 mm×4.6 mm，3.5 μm)色譜柱和Waters Symmetry C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)色譜柱對(duì)目標(biāo)抗生素的分離效果和響應(yīng)值，結(jié)果顯示W(wǎng)aters Symmetry色譜柱對(duì)3種濃度為50 μg/L四環(huán)素類抗生素的響應(yīng)值為5 500～12 000 cps，而Waters Xterra色譜柱對(duì)四環(huán)素類抗生素的響應(yīng)值為19 000～55 000 cps，且分離效果更佳。

圖1A 目標(biāo)抗生素和13C3-caffeine最佳CE值Fig.1A The optimum collision energy of target antibiotics and 13C3-caffeine

圖1B 目標(biāo)抗生素和13C3-caffeine最佳DP值Fig.1B The optimum declustering potential of target antibiotics and 13 C3-caffeine

為使C18色譜柱填料中存在的硅醇基質(zhì)子化，增強(qiáng)質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)強(qiáng)度、提高目標(biāo)物在ESI+源的正離子化效率，同時(shí)降低其對(duì)含堿基基團(tuán)的四環(huán)素類、喹諾酮類、磺胺類的吸附，減少峰形拖尾現(xiàn)象[18]，本實(shí)驗(yàn)選用酸性流動(dòng)相且加入緩沖物質(zhì)，保證流動(dòng)相pH的穩(wěn)定，故流動(dòng)相A使用0.1%甲酸-10 mmol·L-1甲酸銨溶液。調(diào)節(jié)梯度洗脫濃度，使13種目標(biāo)物進(jìn)行色譜分離(見(jiàn)圖2)。圖2表明，磺胺嘧啶、土霉素和環(huán)丙沙星三種抗生素的出峰時(shí)間較近，但總離子流圖顯示其各自的MRM峰形良好，這3種抗生素仍能較好分離。

(1.13C3-caffeine；2.SDZ；3.SMZ；4.SMR；5.SM2；6.NOR；7.ENO；8.CPFX；9.ENRO；10.DC；11.TC；12.OTC；13.CTC)圖2 12種抗生素和13C3-咖啡因的HPLC-MS/MS總離子流圖Fig.2 Total HPLC-MS/MS ion flow chart of 12 antibiotics and 13C3-caffeine

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

2.3.1 上樣流速 固相萃取是從水樣中回收抗生素的關(guān)鍵步驟，也是最耗時(shí)的一步。了解抗生素在固相萃取柱上的吸附動(dòng)力學(xué)，使抗生素以盡可能快的流速萃取是十分重要的。通過(guò)在不同流速(1～20 mL/min)下進(jìn)行回收實(shí)驗(yàn)，對(duì)吸附動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究。結(jié)果如圖3所示，低流速(≤10 mL/min)有利于抗生素的萃取，平均回收率超過(guò)80%。當(dāng)流速為10 mL/min以上，如15 mL/min時(shí)，目標(biāo)物回收率明顯下降。流速提高到20 mL/min時(shí)，回收率顯著降低，如強(qiáng)力霉素的回收率僅為58%。Na等[17]和Tang等[19]分別采用了6和3 mL/min的低上樣流速對(duì)抗生素進(jìn)行固相萃取。因此，選擇固相萃取的上樣流速為5 mL/min。

圖3 流速對(duì)12種抗生素和13C3-咖啡因吸附回收率的影響Fig.3 Effect of flow rate on adsorption recovery of 12 antibiotics and 13C3-caffeine

2.3.2 洗脫溶劑的種類 在固相萃取過(guò)程中，洗脫溶劑的種類是影響洗脫效率的重要因素之一，使用合適的洗脫溶劑能夠使待測(cè)物的洗脫效率更高。實(shí)驗(yàn)選取甲醇、80%甲醇水(體積比為4∶1)和甲醇-乙腈(體積比為1∶1)等常用的溶劑作為洗脫溶劑，考察了其對(duì)12種抗生素和13C3-咖啡因洗脫效率的影響(見(jiàn)圖4)。結(jié)果表明，80%甲醇溶液對(duì)目標(biāo)抗生素的洗脫效果較差。甲醇-乙腈作為洗脫劑與甲醇相比，四環(huán)素類抗生素、磺胺類抗生素和喹諾酮類抗生素的平均回收率分別提高9.5%、3.83%和3.5%。采用甲醇-乙腈(體積比為1∶1)作為洗脫溶劑對(duì)12種抗生素和13C3-咖啡因的洗脫效率最大。崔敬鑫等[20]描述了分別以甲醇和乙腈作為洗脫劑對(duì)抗生素洗脫的影響。用甲醇進(jìn)行洗脫，結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相類似。用乙腈進(jìn)行洗脫，四環(huán)素類抗生素的回收率明顯提高。因?yàn)閷?duì)一些較弱極性的抗生素(四環(huán)素類)來(lái)說(shuō)，乙腈具有良好的洗脫性能[21]。故選擇甲醇-乙腈作為洗脫溶劑。

圖4 不同洗脫溶劑對(duì)13種目標(biāo)物回收率的影響Fig.4 Effect of different elution solvents on recovery of 13 target compounds

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 檢出限、定量限與線性范圍 結(jié)果表明，12種抗生素和13C3-咖啡因在1～100 μg/L的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2≥0.996，檢測(cè)限(LODs，S/N=3)和定量限(LOQs，S/N=10)范圍分別是0.07～1.78和0.24～5.93 ng/L(見(jiàn)表2)。

表2 13種目標(biāo)物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍、檢出限和定量限Table 2 Linear equation,correlation coefficient,linear range,detection limit and quantitative limit of 13 targets

2.4.2 回收率和精密度 13種目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為62.8%～106.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.1%～14.6%(見(jiàn)表3)，表明該方法具有較好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

表3 13種目標(biāo)物在海水樣品中的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=3)Table 3 Recovery and relative standard deviation of 13 targets in seawater samples (n=3)

2.5 實(shí)際樣品分析

2019年5月在萊州灣不同海域共采集21個(gè)點(diǎn)位的海水樣品，樣品中回收率替代物13C3-咖啡因的回收率為69%～104%。除CTC、TC和DC外，其余9種抗生素均被檢出(見(jiàn)表4)，質(zhì)量濃度在0.4～60.15 ng/L之間。從三類抗生素來(lái)看，磺胺類和喹諾酮類抗生素均有檢出，且檢出率較高，該結(jié)果與Zhang等[13]在萊州灣所采集的海水水樣中檢測(cè)到的磺胺類和喹諾酮類抗生素含量相當(dāng)。在中國(guó)，依諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星在醫(yī)療中的使用較為頻繁[22]，諾氟沙星和環(huán)丙沙星在家禽養(yǎng)殖和水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用也較為廣泛。因此，這三種抗生素在萊州灣海域中的檢出率較高，分別為73.3%、40%和46.7%。恩諾沙星僅用作獸藥，其消費(fèi)受到限制，與所調(diào)查的另三種喹諾酮類抗生素相比，檢出率較低，為26.7%。四環(huán)素類僅檢出土霉素，檢出率為10%，含量為4.33～17.46 ng/L。

表4 萊州灣海域12種抗生素的暴露水平Table 4 Exposure levels of 12 antibiotics in Laizhou Bay

2.6 抗生素風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

抗生素類污染物對(duì)環(huán)境造成不良影響可以通過(guò)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)商(RQ)進(jìn)行評(píng)估[23]。總體而言，萊州灣大部分海域的抗生素濃度對(duì)綠藻、水蚤和魚類等相關(guān)敏感水生生物所存在的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)較低。在檢出的9種抗生素中，磺胺甲惡唑?qū)Σ糠趾涌诤Ｓ蛴械铜h(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，諾氟沙星和恩諾沙星對(duì)所檢出海域有低環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，依諾沙星對(duì)部分河口海域有中環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。Yan等[24]和Chen等[25]在中國(guó)長(zhǎng)江口和黃埔江畔區(qū)域發(fā)現(xiàn)了類似的低等到中等的抗生素環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)語(yǔ)

本文建立了固相萃取-HPLC-MS/MS分析測(cè)定海水樣品中的3大類12種抗生素的方法，分別對(duì)色譜及質(zhì)譜條件、萃取時(shí)間和洗脫劑種類進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果顯示，12種抗生素的定量限范圍為0.14～4.62 ng/L，加標(biāo)回收率為62.8%～106.6%。用該方法對(duì)萊州灣海域21個(gè)海水樣品進(jìn)行檢測(cè)，除四環(huán)素、強(qiáng)力霉素和金霉素外，其余9種抗生素均有不同程度的檢出。本方法重現(xiàn)性好、結(jié)果可靠，可應(yīng)用于海水樣品中抗生素的測(cè)定。