青島近海樣品中聚丙烯微塑料降解微生物的富集培養(yǎng)及活性研究*

李 肸，張曉華,2,3，于 敏,2,3**

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋生態(tài)與環(huán)境科學(xué)功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237；3.中國(guó)海洋大學(xué)深海圈層與地球系統(tǒng)前沿科學(xué)中心，山東 青島 266100)

微塑料是指粒徑小于5 mm的塑料碎片，廣泛存在于海洋環(huán)境中[1-3]。微塑料占塑料垃圾的92.4 %[4]，主要包括以下幾種類型：如聚乙烯(Polyethylene,PE)、聚丙烯(Polypropylene，PP)、聚苯乙烯(Polystyrene，PS)和聚氯乙烯(Polyvinylchloride，PVC)等[3,5-6]。2017年全球的塑料生產(chǎn)已達(dá)到3.5億t，并且在逐年增加[7]。每年約有4×106～1.2×107t的塑料進(jìn)入海洋，據(jù)估計(jì)到2050年海洋中的微塑料數(shù)量將超過(guò)魚類數(shù)量[6]。另外，持久性塑料短期內(nèi)可以降解為微塑料和納米塑料并長(zhǎng)期存在于海洋環(huán)境中[8]，對(duì)海洋生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響。近海受人類活動(dòng)影響較大，漁業(yè)、航運(yùn)、沿海工業(yè)、污水處理廠等領(lǐng)域是沿海微塑料入海的主要源頭[9]，且微塑料的豐度與人口密度之間存在顯著相關(guān)性[10]。因此，近海也是微塑料污染較為嚴(yán)重的海域。已有研究發(fā)現(xiàn)，PE和PP是近海海水和沉積物中存在的主要微塑料類型[11]。這兩種微塑料難以降解并在海洋環(huán)境中大量積累，造成嚴(yán)重的海洋生態(tài)問題。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇PP微塑料作為唯一碳源，對(duì)青島近海微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)、多樣性分析及PP降解菌的篩選。

塑料的降解可分為非生物降解和生物降解。非生物降解包括物理降解、光降解和化學(xué)降解。非生物降解可以改變聚合物的性質(zhì)并產(chǎn)生脆化，將塑料降解為微塑料甚至更小粒徑的納米塑料，降解過(guò)程非常緩慢[12]。在生物降解塑料的過(guò)程中，聚合物由于過(guò)大不能滲透進(jìn)微生物的細(xì)胞膜，因此生物降解的第一步是在微生物胞外酶的作用下裂解聚合物的側(cè)鏈或主鏈從而形成較小的聚合物單元(如低聚物、單體)，微生物可以吸附在這些小分子上并對(duì)其進(jìn)行降解[13]。生物降解是目前最經(jīng)濟(jì)環(huán)保高效的一種微塑料處理措施。微塑料作為一種新型的海洋基質(zhì)，水生微生物定植其上并進(jìn)行傳播，這些附著微生物可能對(duì)降解微塑料有一定的貢獻(xiàn)[7,14-16]。已有研究報(bào)道，變形菌門、擬桿菌門和放線菌門細(xì)菌是微塑料附著細(xì)菌群落的主要優(yōu)勢(shì)類群[17]，且其多樣性與暴露時(shí)間、地理位置和微塑料類型有關(guān)[2,18]。不同微塑料類型上定植的細(xì)菌群落與微塑料基質(zhì)表面的疏水性質(zhì)有關(guān)[19]。以PP微塑料為唯一碳源富集培養(yǎng)微塑料降解細(xì)菌，目前發(fā)現(xiàn)降解PP能力較強(qiáng)的細(xì)菌主要包括γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)的假單胞菌屬(Pseudomonas)[20-21]和弧菌屬(Vibrio)[20]，厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌屬(Bacillus)[21-23]和放線菌綱(Actinobacteria)的紅球菌屬(Rhodococcus)[23]等。近年來(lái)，已有諸多研究關(guān)注微塑料附著細(xì)菌的群落多樣性及微塑料降解菌的功能活性，如Xu等[2]通過(guò)16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)，分析了有限時(shí)間內(nèi)中國(guó)近海原位海水中微塑料表面細(xì)菌群落的多樣性，也有研究分析了芽孢桿菌屬和紅球菌屬等細(xì)菌對(duì)微塑料的降解活性[22-23]，但通過(guò)富集培養(yǎng)篩選獲得微塑料降解細(xì)菌的相關(guān)研究較少，關(guān)于微塑料的生物降解機(jī)制仍然沒有定論[22]。目前對(duì)微塑料生物降解過(guò)程的認(rèn)識(shí)大多基于實(shí)驗(yàn)室研究，且通常集中于微塑料單一降解機(jī)制的研究，在若干降解機(jī)制同時(shí)發(fā)生的環(huán)境中微塑料降解相關(guān)的研究十分有限[24]。另外，關(guān)于微塑料的降解多集中于研究其物理及化學(xué)性質(zhì)的變化，在分子水平上對(duì)細(xì)菌裂解塑料聚合物的過(guò)程仍然是未知的[25]。

本研究通過(guò)16S rRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)青島近海微生物隨富集時(shí)間的不同在PP顆粒上的群落演替進(jìn)行了分析，并對(duì)富集40 d后的PP附著細(xì)菌進(jìn)行了分離純化及鑒定，進(jìn)一步對(duì)獲得菌株的PP降解能力進(jìn)行了檢測(cè)。本研究旨在揭示以PP微塑料為唯一碳源的富集過(guò)程中微生物的群落演替，并結(jié)合分離培養(yǎng)獲得PP降解能力較強(qiáng)的細(xì)菌，為緩解微塑料對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的污染提供潛在降解菌資源。

1 材料和方法

1.1 聚丙烯微塑料

本研究所用聚丙烯(Polypropylene，PP)微塑料為白色球狀，直徑為4～5 mm，在25 ℃密度為0.9 g/mL。由Sigma Aldrich Chemical Co.(USA)生產(chǎn)(見圖1A)。

1.2 采集樣品收集與處理

本研究于2019年7月在青島棧橋(Zhanqiao,ZQ)采集的沉積物及在第三海水浴場(chǎng)(The third bathing beath，SY)采集的海水樣品用于富集培養(yǎng)。采集樣品用無(wú)菌離心管收集，置于冰上隨后帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行富集培養(yǎng)。具體的站位信息見圖1B。

(ZQ：棧橋；SY：第三海水浴場(chǎng)。A.PP微塑料顆粒；B.采樣圖。ZQ:Zhanqiao;SY:The third bathing beach.A.Polypropylene microplastic particles;B.Location of the sample.)圖1 PP微塑料顆粒及采樣站位圖Fig.1 Polypropylene microplastic particles and location of the sample

1.3 培養(yǎng)基

富集所用培養(yǎng)基為以PP顆粒為唯一碳源的礦物鹽培養(yǎng)基(Mineral salt medium，MSM)培養(yǎng)基[26]。將MgSO40.2 g，CaCl20.02 g，KH2PO41.0 g，K2HPO41.0 g，NH4NO31.0 g，F(xiàn)eCl30.05 g溶于1 L三蒸水中。用NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)至7.0，121 ℃高壓滅菌20 min，冷卻后添加經(jīng)紫外滅菌后的0.5 g/L PP于培養(yǎng)基。

采用改良的NA培養(yǎng)基[27]對(duì)附著在PP上的細(xì)菌進(jìn)行分離純化。將胰蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉5 g溶于1 L 海水中。用NaOH將培養(yǎng)基pH調(diào)為7.3左右。121 ℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基添加20 g/L的瓊脂。

1.4 富集培養(yǎng)

將棧橋采集的沉積物樣品(0.5 g樣品與50 mL的0.85%無(wú)菌生理鹽水與混勻)，第三海水浴場(chǎng)采集的海水以1%接種量接種于以PP為唯一碳源的600 mL MSM培養(yǎng)基。分設(shè)0、7、21、40和60 d 5個(gè)時(shí)間段，每個(gè)時(shí)間段各3個(gè)平行。以未接種含PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基作為對(duì)照。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組均放置在室溫下靜置培養(yǎng)。

1.4.1 富集水樣及PP顆粒的收集 每個(gè)時(shí)間段取400 mL 富集培養(yǎng)物進(jìn)行0.22 μm濾膜(直徑為47 mm)過(guò)濾，濾膜收集在2 mL無(wú)菌保種管中，液氮速凍，隨后保存在-80 ℃冰箱；同時(shí)收集全部的PP顆粒，與濾膜處理相同。

1.4.2 菌株的分離純化與保藏 收集富集培養(yǎng)40 d后的PP顆粒。將微塑料顆粒置于無(wú)菌生理鹽水中渦旋振蕩3 min，隨后將PP顆粒振蕩后的生理鹽水涂布于NA培養(yǎng)基，放置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌落后，按照菌落大小、形態(tài)、顏色等特征挑取單菌落，純化3次后獲得純菌株。純菌株接種于NA斜面，用15%的甘油保種液(15%甘油：85%的生理鹽水，V:V)進(jìn)行保種并置于-80 ℃冰箱低溫保存。

1.4.3 細(xì)菌基因組DNA的提取、16S rRNA基因序列擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育分析 采用煮沸法或酚-氯仿抽提法[28]提取菌株的基因組。采用細(xì)菌通用引物27F[29](5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1490R[29](GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)、PCR擴(kuò)增體系[30]、酶切體系[30]對(duì)16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增及酶切。酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后挑選條帶不同的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。采 用 Chromas 軟件分析測(cè)序所得的16S rRNA 基因序列，去除低質(zhì)量的測(cè)序堿基后得到的有效序列長(zhǎng)度約1 400 bp，將序列提交至EZbiocloud (https://www.ezbiocloud.net/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，以16S rRNA基因序列相似性大于等于98.65%作為同種菌株的劃分標(biāo)準(zhǔn)[31]。將目的序列與近緣菌株的16S rRNA基因序列用MEGA 7.0 軟件以鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，1 000 次自展(Bootstrap)評(píng)估系統(tǒng)發(fā)育樹的準(zhǔn)確性。

1.4.4 PP降解活性檢測(cè) 將從富集培養(yǎng)40 d的PP樣品上分離得到的細(xì)菌進(jìn)行PP降解活性檢測(cè)。將細(xì)菌接種到新鮮的NA培養(yǎng)基，活化后轉(zhuǎn)接到NB培養(yǎng)基，待菌株長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期(OD600為0.4)后以1%及10 %的接種量接種到以PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中。每50 mL MSM培養(yǎng)基含0.1 g的PP微塑料。室溫培養(yǎng)4周。以不接菌含PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基為對(duì)照。每個(gè)菌株設(shè)置3個(gè)平行。

1.4.5 PP降解率計(jì)算 將培養(yǎng)前處理過(guò)的微塑料稱重并記錄，記為W0。將放置在室溫培養(yǎng)4周的微塑料過(guò)濾回收后，采用70 %乙醇進(jìn)行四階段清洗(每個(gè)階段孵育2 min后震蕩2 min，重復(fù)4次)。清洗后放入50 ℃烘箱中過(guò)夜干燥后稱重，記為W1。計(jì)算公式如下：

1.5 掃描電鏡觀察

用無(wú)菌蒸餾水沖洗棧橋泥樣富集40 d后的PP顆粒，以洗去多余的培養(yǎng)基并干燥，以未接菌的PP顆粒作為對(duì)照。掃描電鏡在0.3 MPa氬氣環(huán)境，25 mA電流下在塑料球表面噴金后進(jìn)行觀察。

1.6 富集樣品DNA的提取及16S rRNA基因高通量測(cè)序

采用Power Soil DNA Isolation Kit(MO BIO)試劑盒對(duì)每個(gè)時(shí)間段富集的水樣濾膜和PP顆粒上的DNA進(jìn)行提取。采用NanoDrop ND 2000紫外分光光度計(jì)以及瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA樣品的純度與濃度。采用微生物通用引物515FmodF,806RmodR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)合格后使用Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序。測(cè)序工作委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

樣品采用“站位+W/P_富集天數(shù)”進(jìn)行命名，其中W為富集水樣，P為富集微塑料樣品。如SW_0d，SP_0d。

1.7 數(shù)據(jù)處理與分析

采用FLASH軟件[32]對(duì)原始reads進(jìn)行質(zhì)控，按照97%相似性使用UPARSE軟件[33]對(duì)非重復(fù)序列進(jìn)行OTU聚類，獲得OTU代表序列，采用Silva數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU進(jìn)行注釋，最終生成OTU表格。將得到的OTU表按照樣品的最小序列數(shù)對(duì)OTU表進(jìn)行抽平。在97%的相似度水平上對(duì)注釋得到的總細(xì)菌OTU進(jìn)行Alpha和Beta多樣性分析。Alpha多樣性分析主要采用mothur[34]計(jì)算Ace指數(shù)、Chao I指數(shù)、Simpson指數(shù)、shannon指數(shù)、Coverage指數(shù)等；Beta多樣性分析通過(guò)采用NMDS分析，即非度量多維尺度分析(Non-metric multidimensional scaling)以研究樣本群落的相似性或差異性。使用PRIMER6軟件中的ANOSIM單因子分析進(jìn)行組間差異檢驗(yàn)。Alpha多樣性指數(shù)在富集水體樣品和微塑料樣品之間的差異顯著性檢驗(yàn)由t檢驗(yàn)-平均值的成對(duì)二樣本分析實(shí)現(xiàn)。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及檢驗(yàn)都使用SPSS軟件及R語(yǔ)言完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同富集時(shí)間PP顆粒上附著細(xì)菌的多樣性和豐富度指數(shù)

對(duì)20個(gè)樣品使用Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行16S rRNA高通量測(cè)序，共得到1 282 567條序列，按照97%相似度劃分得到1 081個(gè)OUT(可操縱單元)。按照最小樣本序列數(shù)對(duì)樣本進(jìn)行抽平，抽平后共得到860 660條序列。每個(gè)樣品抽平后有效序列為43 033條，912個(gè)OTU。從抽平后的序列篩選出細(xì)菌序列，共860 580條序列，細(xì)菌OTU 907個(gè)。所有樣品的Chao指數(shù)在158.50～586.14之間，Shannon指數(shù)在0.86～3.05之間(見圖2)。SY海水的富集水樣Chao I指數(shù)明顯高于PP樣品(P<0.01)，說(shuō)明SY海水的富集水樣中細(xì)菌豐富度明顯高于PP樣品；ZQ沉積物富集后，不論是Chao I指數(shù)還是Shannon指數(shù)，富集水樣和PP樣品中細(xì)菌的豐富度和多樣性均沒有明顯差別(見圖2)。隨著富集時(shí)間的增加，SY海水富集60 d后的細(xì)菌多樣性明顯高于0 d的富集樣品(P<0.05)，而ZQ沉積物富集60 d后的細(xì)菌多樣性明顯高于富集40、0 d的富集樣品(P<0.05)(見圖3)。

(SW:第三海水浴場(chǎng)海水富集后水樣；SP:第三海水浴場(chǎng)海水富集后微塑料樣品；ZW:棧橋沉積物富集后水樣；ZP:棧橋沉積物富集后微塑料樣品。SW:Water sample form the enrichment culture of on the third bathing beach’s seawater;SP:Microplastics sample form the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;ZW:Water sample form the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;ZP:Microplastics sample from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖2 以PP為唯一碳源富集培養(yǎng)青島近海海水和沉積物樣品中細(xì)菌的Chao I指數(shù)(A)和香濃指數(shù)(B)箱式圖Fig.2 Box plot of bacterial Chao I (A)和 Shannon(B)diversity indexes in enrichment culture of Qingdao’s coastal seawaters and sediment samples using PP as the sole carbon source

2.2 隨富集時(shí)間的變化PP顆粒上的細(xì)菌群落演替

SY海水樣品在富集過(guò)程中，在PP表面的附著細(xì)菌以γ-變型菌綱(γ-Proteobacteria，70.73%～99.37%)和α-變形菌綱(α-Proteobacteria，0.44%～23.39%)為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類群。富集21 d時(shí)放線菌綱(Actinobacteria)細(xì)菌豐度增加。而富集培養(yǎng)40 d后，擬桿菌綱(Bacteroidia)細(xì)菌豐度明顯增加。隨著富集時(shí)間的增加，α-變形菌綱、擬桿菌綱細(xì)菌豐度逐漸增加，γ-變形菌綱細(xì)菌豐度逐漸下降(見圖4 A)。從屬水平看，富集培養(yǎng)40 d時(shí)，假單胞菌屬(Pseudomonas,75.47%)，Methyloversatilis(8.57%)，假黃色單胞菌屬(Pseudoxanthomonas,2.11%)為富集出的優(yōu)勢(shì)屬。在富集時(shí)間為60 d時(shí)，假單胞菌屬(50.51%)、Methylotenera(12.59%)、生絲微菌屬(Hyphomicrobium，6.34%)和鞘脂菌屬(Sphingobium，5.09%)為富集優(yōu)勢(shì)屬(見圖4 B)。

ZQ沉積物富集培養(yǎng)后，PP表面的附著細(xì)菌中，優(yōu)勢(shì)綱為γ-變形菌綱(43.65%～95.66%)，其次為α-變形菌綱(1.14%～45.66%)和擬桿菌綱。富集21 d時(shí)，放線菌綱細(xì)菌豐度增加。隨富集時(shí)間的增加，α-變形菌綱、擬桿菌綱、放線菌綱細(xì)菌豐度在不斷增加(見圖4 A)。從屬水平看，富集21 d時(shí)，假單胞菌屬(Pseudomonas，35.44%)，扎瓦爾金氏菌屬(Zavarzinia，29.14%)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter，13.31%)為優(yōu)勢(shì)屬；富集40 d時(shí)，扎瓦爾金氏菌屬(29.39%)、亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas，11.38%)、生絲微菌屬(6.02%)為優(yōu)勢(shì)屬；富集60 d 時(shí)，亞硝化單胞菌屬(12.61%)、生絲微菌屬(18.71%)和羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter，12.22%)為優(yōu)勢(shì)屬(見圖4 B)。

(A.SY海水富集水樣中細(xì)菌和PP附著細(xì)菌的chao I指數(shù)；B.SY海水富集水樣中細(xì)菌和PP附著細(xì)菌的shannon指數(shù)；C.ZQ沉積物富集水樣中細(xì)菌和PP附著細(xì)菌的chao I指數(shù)；D.ZQ沉積物富集水樣中細(xì)菌和PP附著細(xì)菌的shannon指數(shù)。A.Bacterial Chao I indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;B.Bacterial shannon indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;C.Bacterial Chao I indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;D.Bacterial shannon indexes of the water and microplastics samples from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖3 SY海水與ZQ沉積物在不同富集培養(yǎng)時(shí)間水樣中細(xì)菌和PP附著細(xì)菌Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)Fig.3 Bacterial Chao I and Shannon indexes of the water and microplastics samples form enrichment cultures of the third bathing beach’s seawater and the sediment of Zhanqiao at different culture times,respectively

使用NMDS(非度量多維尺度分析)依據(jù)PP附著細(xì)菌對(duì)富集時(shí)間、研究站位進(jìn)行分析，結(jié)果表明PP上的附著細(xì)菌呈現(xiàn)明顯的區(qū)域化特征(見圖6)，大體分為兩簇，SY和ZQ樣品各聚為一簇。此外，細(xì)菌群落隨富集時(shí)間的不同也表現(xiàn)出明顯的差異，相同富集時(shí)間的細(xì)菌群落聚為一簇，較為相似。

2.3 掃描電鏡結(jié)果

通過(guò)對(duì)富集后的PP顆粒進(jìn)行掃描電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)未接種沉積物微生物且放置40 d后的對(duì)照組PP顆粒表面光滑平整(見圖7A)；ZQ沉積物在含PP為唯一碳源的培養(yǎng)基中富集40 d后，PP微塑料樣品表面發(fā)生明顯改變(見圖7B)，可以看到有細(xì)菌附著于PP微塑料表面。

2.4 富集后可培養(yǎng)細(xì)菌的多樣性

將SY海水、ZQ沉積物樣品富集40 d 后的PP樣品上的附著細(xì)菌用無(wú)菌生理鹽水振蕩后進(jìn)行分離純化，共獲得40株細(xì)菌，分屬于3個(gè)門、10個(gè)屬，15個(gè)種(見圖8)。3個(gè)門分別為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)。變形菌門細(xì)菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占分離菌株的87.5%，包括α-變形菌綱、β-變形菌綱和γ-變形菌綱。其中α-變形菌綱細(xì)菌共分離獲得3個(gè)屬，3個(gè)種，共6株；β-變形菌綱細(xì)菌分離獲得1個(gè)屬，2個(gè)種，共5株；γ-變形菌綱細(xì)菌共分離獲得4個(gè)屬，6個(gè)種，共24株。其次擬桿菌門獲得2株細(xì)菌，其中一株為Sphingobacteriummizutaii，一株為Sphingobacteriumdaejeonense。放線菌門獲得3株細(xì)菌，其中2株為Microbacteriumresistens，1株為Microbacteriumsuwonense。

(SW:第三海水浴場(chǎng)海水富集后水樣；SP:第三海水浴場(chǎng)海水富集后微塑料樣品；ZW:棧橋沉積物富集后水樣；ZP:棧橋沉積物富集后微塑料樣品。SW:Water sample form the enrichment culture of on the third bathing beach’s seawater;SP:Microplastics sample form the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;ZW:Water sample form the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;ZP:Microplastics sample from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖4 不同富集培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌群落在綱水平(A)和屬水平(B)上的相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of bacterial community at the class (A)and genus (B)levels at different culture times

(SW:第三海水浴場(chǎng)海水富集后水樣；SP:第三海水浴場(chǎng)海水富集后微塑料樣品；ZW:棧橋沉積物富集后水樣；ZP:棧橋沉積物富集后微塑料樣品。SW:Water sample form the enrichment culture of on the third bathing beach’s seawater;SP:Microplastics sample form the enrichment culture of the third bathing beach’s seawater;ZW:Water sample form the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment;ZP:Microplastics sample from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment.)圖5 不同富集培養(yǎng)時(shí)間PP微塑料附著細(xì)菌群落中豐度前10的細(xì)菌科Fig.5 Most abundant (top 10)bacterial families (OTUs)present in the PP microplastic-associated bacterial communities at different culture times

(SY的富集樣品為綠色，ZQ富集樣品為紅色。相同的富集時(shí)間的樣品形狀相同。The enrichment samples of the third bathing beach are green,and the enrichment samples of the Zhanqiao are red.Samples with the same enrichment time have the same shapes.)圖6 青島近海微生物不同富集培養(yǎng)時(shí)間的細(xì)菌群落NMDS分析(stress=0.081)Fig.6 NMDS analysis of the bacterial community in the enrichment cultures of Qingdao’s coastal seawaters and sediment samples at different culture times (stress=0.081)

2.5 分離菌株降解PP的降解率

對(duì)富集40 d后的PP顆粒上分離得到的細(xì)菌選取15株不同種細(xì)菌進(jìn)行PP降解活性的檢測(cè)。分別以1%、10%接種量接種于含PP為唯一碳源的MSM培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)4周后，發(fā)現(xiàn)不論接種量為1%還是10%，銅綠假單胞菌LXI681(Pseudomonasaeruginosa)、反硝化無(wú)色桿菌LXI668(Achromobacterdenitrificans)對(duì)PP都有一定的降解作用，且在接種量為10%時(shí)，PP降解率分別達(dá)2.5%和0.57%。當(dāng)接種量為1%時(shí)，石油假單胞菌LXI654(Pseudomonasoleovoranssubsp.oleovorans)、鞘氨醇桿菌LXI671(Sphingobacteriummizutaii)和羅思河小桿菌LXI601(Rhodanobactersoli)對(duì)PP有較高的降解率；抗逆微桿菌LXI659(Microbacteriumresistens)、彎曲假單胞菌LXI602(Pseudomonasgeniculata)對(duì)PP沒有降解作用(見圖9)。

(A.對(duì)照組；B.實(shí)驗(yàn)組。A.Control group;B.Experimental group.)圖7 棧橋沉積物富集40 d后微塑料樣品的掃描電鏡圖Fig.7 Scanning electron microscope (SEM)of microplastic samples from the enrichment culture of the Zhanqiao’s sediment after 40 days of cultivation

(選取綠彎菌門的Kouleothrix aurantiaca COM-B作為外種群，系統(tǒng)發(fā)育樹上的數(shù)字代表自展值，括號(hào)中的編號(hào)和數(shù)字分別代表Genbank登錄號(hào)和屬于相同種的細(xì)菌菌株數(shù)。Kouleothrix aurantiaca COM-B from Chloroflexi is used as an out-group.Numbers at each branch point indicate the bootstrap values.The numbers inside brackets represent the Genbank accession numbers and the amount of strains within the same species.)圖8 PP顆粒上分離獲得的40株細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.8 Phylogenetic tree of 40 bacteria strains isolated from PP particles

圖9 富集培養(yǎng)獲得菌株的PP微塑料降解率Fig.9 Degradation rate of PP microplastics by the isolated bacterial strains from the enrichment

3 討論

微塑料普遍存在于表層海水、深海、沉積物甚至是極地等極端環(huán)境中，嚴(yán)重影響了海洋生物的安全和健康。PP為近海主要的微塑料污染類型，難以降解導(dǎo)致其在海洋中大量積累，因此，解決微塑料造成的海洋污染逐漸引起科學(xué)家的重視。目前研究微生物在PP顆粒上的群落演替及PP降解微生物的篩選、活性檢測(cè)等相關(guān)的研究較少。故本實(shí)驗(yàn)采用以PP為唯一碳源對(duì)青島近海微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，以期揭示微生物在PP微塑料上的優(yōu)勢(shì)類群并獲得潛在的PP降解菌為緩解塑料污染帶來(lái)的海洋生態(tài)問題提供微生物菌種資源。

通過(guò)對(duì)青島近海微生物以PP為唯一碳源進(jìn)行富集培養(yǎng)，其16S rRNA高通量測(cè)序結(jié)果表明，采用SY海水樣品進(jìn)行富集培養(yǎng)時(shí)，富集水樣中的細(xì)菌豐富度明顯高于富集微塑料樣品。這一結(jié)果與Zettler等[35]分析北大西洋海水和PP微塑料上細(xì)菌群落的α-多樣性結(jié)果一致。Harrison等[36]在研究中也指出微塑料上的微生物群落不同于周圍海水，微塑料為微生物提供了新型的棲息地，特別是在早期定植階段，微生物會(huì)選擇性的附著在微塑料上。然而，采用棧橋沉積物富集培養(yǎng)時(shí)，富集水樣與微塑料樣品中細(xì)菌的多樣性與豐富度沒有明顯區(qū)別。這可能與沉積物中微生物的多樣性及富集培養(yǎng)時(shí)間有關(guān)。隨富集時(shí)間的增加，PP附著細(xì)菌的多樣性增加(見圖3)。Lobelle等[15]發(fā)現(xiàn)隨培養(yǎng)時(shí)間的增加，塑料的親水性不斷增加，生物被膜的產(chǎn)生量也不斷增加。故推測(cè)富集培養(yǎng)早期細(xì)菌群落多樣性低，可能由于微塑料的疏水性且表面營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏從而不利于早期細(xì)菌的定植；富集培養(yǎng)后期，微塑料表面細(xì)菌多樣性增加，可能由于生物被膜的形成改變了微塑料表面的性質(zhì)使其利于細(xì)菌定植。NMDS分析結(jié)果顯示相同富集時(shí)間的群落聚為一簇，表明相同富集時(shí)間細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)較為相似，不同富集時(shí)間附著在微塑料上的細(xì)菌群落存在明顯差異。這一結(jié)果與Xu等[2]在中國(guó)近海研究微塑料上細(xì)菌的群落演替結(jié)果較為一致。另外，微塑料上的細(xì)菌群落與樣品來(lái)源和微塑料類型有關(guān)，不同的樣品來(lái)源和微塑料類型，在富集培養(yǎng)過(guò)程中微塑料上的附著細(xì)菌群落有明顯差異[18-19]。

本研究在分析微塑料附著細(xì)菌的物種組成時(shí)，發(fā)現(xiàn)不論是富集培養(yǎng)ZQ沉積物樣品還是SY海水樣品，γ-變形菌綱、α-變形菌綱細(xì)菌在PP微塑料上均占主導(dǎo)地位。該結(jié)果與Curren等[37]在研究熱帶沿海環(huán)境微塑料上的細(xì)菌群落組成相似。另外，Xu等[2]在研究中國(guó)近海海域細(xì)菌對(duì)地理位置、暴露時(shí)間和塑料類型的響應(yīng)及群落演替中，發(fā)現(xiàn)γ-變形菌綱、α-變形菌綱、黃桿菌綱在微塑料(PP和PVC)附著細(xì)菌群落中占主導(dǎo)地位。需要注意的是，在富集培養(yǎng)早期，富集水樣中的細(xì)菌群落與已報(bào)道的海水、沉積物微生物群落組成有所區(qū)別，推測(cè)是由于近海海域受人類活動(dòng)影響較大從而影響其群落結(jié)構(gòu)。

本研究在富集培養(yǎng)SY海水樣品及ZQ沉積物后期，PP微塑料上豐度較高的科為假單胞菌科(Pseudomonadaceae)、Acetobacterales_Incertae_Sedis、亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)、生絲微菌科(Hyphomicrobiaceae)、Rhodanobacteraceae和黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)(見圖5)。已有研究表明微塑料可以作為碳源為海洋微生物提供能量[20-23]。研究發(fā)現(xiàn)，從不同環(huán)境中分離出的假單胞菌屬細(xì)菌可以降解多種微塑料，如PE、PP、PS、PVC、PET等[38]。Gyung Yoon等[39]從原油污染嚴(yán)重的海灘樣品中分離出的假單胞菌屬細(xì)菌具有降解低密度聚乙烯(Low-Molecular-Weight Polyethylene)的能力。因此，本研究以PP為唯一碳源富集培養(yǎng)獲得的假單胞菌屬細(xì)菌可能具有PP降解潛力。Amaral-Zettler等[40]從2013年7—11月在美國(guó)馬薩諸塞州伍茲霍爾碼頭進(jìn)行了海洋微生物在高密度聚乙烯(High-Density Polyethylene)上的原位定植實(shí)驗(yàn)，通過(guò)二代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的推移黃單胞菌科細(xì)菌豐度增加，與本研究結(jié)果相似。Brandon等在分析粉蟲腸道菌群中發(fā)現(xiàn)黃單胞菌科細(xì)菌與PS降解相關(guān)，因此推測(cè)富集后期豐度較高的黃單胞菌科細(xì)菌也具有PP降解潛力。另外，ZQ沉積物富集后期，PP附著細(xì)菌群落中扎瓦爾金氏菌屬細(xì)菌的豐度增加，表明其可能具有PP降解潛力。Tourova 等[41]發(fā)現(xiàn)扎瓦爾金氏菌屬細(xì)菌具有降解PS基因的操縱子，可能具有PS降解潛力。然而，在本研究的分離培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，未獲得扎瓦爾金氏菌屬細(xì)菌菌株，可能與分離培養(yǎng)條件不適合其生長(zhǎng)有關(guān)，在后續(xù)對(duì)微塑料降解菌的富集培養(yǎng)和分離純化中應(yīng)考慮采用多種培養(yǎng)基，包括以微塑料為唯一碳源的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，以獲得更多的微塑料降解菌。

本研究對(duì)選取的15株不同種細(xì)菌進(jìn)行了PP微塑料降解活性檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)以10%接種量接種到含PP微塑料為唯一碳源的培養(yǎng)基中，室溫培養(yǎng)4周后，銅綠假單胞菌LXI681、反硝化無(wú)色桿菌LXI668對(duì)PP微塑料有一定的降解活性，降解率分別為2.5%和0.57%。Rajandas等[42]發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)月的時(shí)間里，銅綠假單胞菌可以降解50.5%的低密度聚乙烯，而本實(shí)驗(yàn)中分離得到的銅綠假單胞菌LXI681在室溫放置4周后對(duì)PP的降解率為2.5%，降解率較低。在Arkatkar等[43]的研究中也發(fā)現(xiàn)PP不論有無(wú)化學(xué)處理，生物都很難對(duì)其降解。因此后續(xù)降解實(shí)驗(yàn)可適當(dāng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間以增加其降解率。此外，Kowalczyk等[44]的研究證實(shí)無(wú)色桿菌屬細(xì)菌對(duì)高密度聚乙烯有一定的生物降解作用，而本實(shí)驗(yàn)篩選得到的反硝化無(wú)色桿菌LXI668對(duì)PP有一定的降解能力，表明同種微塑料降解菌可能對(duì)多種類型的微塑料均具有一定的降解能力。

綜上，本研究通過(guò)16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)分析了研究青島近海微生物隨富集時(shí)間的不同在PP顆粒上的群落演替，揭示了富集后期PP微塑料上附著細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)類群。通過(guò)篩選發(fā)現(xiàn)了具有PP降解活性的細(xì)菌如銅綠假單胞菌LXI681、反硝化無(wú)色桿菌LXI668，豐富了PP微塑料降解細(xì)菌資源庫(kù)，對(duì)緩解海洋微塑料污染及改善海洋生態(tài)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。