一株新型異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌GJWA3的脫氮性能及定量檢測(cè)*

蘇兆鵬，李 赟，潘魯青，何子巖，劉麗平，竇 樂，張夢(mèng)宇

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

在脫氮菌株的研究應(yīng)用中，外來菌株由于難以與原生菌株競(jìng)爭(zhēng)而存在無法在目標(biāo)環(huán)境中定殖、存活或成為微生物群落中的優(yōu)勢(shì)種的問題[10]。此外，對(duì)脫氮菌株實(shí)際表現(xiàn)的評(píng)估需要結(jié)合它們?cè)诃h(huán)境中的實(shí)際豐度來進(jìn)行。因此，建立一種定量方法來檢測(cè)脫氮菌株在實(shí)際環(huán)境中的實(shí)時(shí)豐度，對(duì)于綜合評(píng)價(jià)脫氮菌株的應(yīng)用潛力具有重要意義。目前細(xì)菌的定量方法主要有實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative Real-time PCR,qPCR)[11]和酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。ELISA是一種基于特異性抗原-抗體結(jié)合的免疫學(xué)檢測(cè)方法，抗體的類型可以分為單克隆抗體和多克隆抗體。多克隆抗體制備簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高，已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的檢測(cè)和定量中[12-13]。

本研究從對(duì)蝦海水養(yǎng)殖水體中分離出一株HN-AD菌GJWA3。通過不同氮源條件下的氮平衡分析和環(huán)境因子實(shí)驗(yàn)研究了其脫氮特性，同時(shí)采用間接ELISA方法測(cè)定了該菌株在實(shí)際海水養(yǎng)殖水體和養(yǎng)殖廢水中的應(yīng)用潛力，并對(duì)該菌株的生物安全性進(jìn)行了評(píng)估。以期對(duì)該菌株的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 培養(yǎng)基配方

1.2 菌株分離及鑒定

水樣取自廣東江門對(duì)蝦養(yǎng)殖池，將5 mL水樣加入含有95 mL 富集培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)。每天補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基，富集72 h后，將100 μL的菌懸液涂在篩選培養(yǎng)基平板上，28 ℃好氧培養(yǎng)48 h后通過反復(fù)劃線得到若干純化菌株，并對(duì)其硝化-反硝化性能進(jìn)行測(cè)定。選擇硝化-反硝化能力最強(qiáng)的菌株GJWA3，保藏于實(shí)驗(yàn)室并進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。采用通用引物27F/1492R[14]擴(kuò)增菌株GJWA3的16S rDNA基因。PCR產(chǎn)物由生工生物技術(shù)公司(中國上海)測(cè)序。系統(tǒng)發(fā)育樹使用軟件MEGA7中的neighbor-joining方法構(gòu)建。并對(duì)菌株GJWA3的形態(tài)、生理生化特性進(jìn)行觀察分析。

1.3 菌株GJWA3氮去除能力分析

1.4 環(huán)境因素對(duì)菌株GJWA3硝化-反硝化能力的影響

1.5 菌株GJWA3定量方法的建立與應(yīng)用

1.5.1 抗原與抗體的制備 將在2216E液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的菌液離心收集菌體，用0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS)洗滌3次后加入甲醛溶液滅活。滅活后再用PBS洗滌3次并調(diào)節(jié)菌濃度為1 × 109CFU/mL，作為抗原備用。按照蘇真真等[13]的方法將抗原注射到新西蘭大白兔體內(nèi)獲得具有特異性抗體的血清，注射等量的生理鹽水獲得陰性對(duì)照血清。采用間接ELISA的方法測(cè)定血清效價(jià)，所用試劑購于北京翰譜醫(yī)藥生物研究所。血清效價(jià)以P/N值作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，P/N ={OD450(兔抗血清)-OD450(空白)}/{OD450(陰性對(duì)照)-OD450(空白)}，P/N ≥ 2.1代表樣品為陽性。獲得兔抗血清后，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 采用棋盤法[13]對(duì)反應(yīng)過程中的兔抗血清稀釋倍數(shù)、二抗體稀釋倍數(shù)和抗原-抗體反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化。用PBS將菌懸液稀釋至1×108、1×107、1×106、1×105、1×104和1×103CFU/mL。然后采用優(yōu)化后的間接ELISA法測(cè)定相應(yīng)的OD450并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 菌株GJWA3的安全性評(píng)價(jià)

將菌株GJWA3接種于含5%羊血的瓊脂平板上(青島希望生物科技有限公司)，37 ℃孵育48 h，觀察測(cè)定其溶血活性。

從山東煙臺(tái)對(duì)蝦養(yǎng)殖廠購買凡納濱對(duì)蝦，并在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行暫養(yǎng)。一周后將大小均勻的健康對(duì)蝦隨機(jī)放入9個(gè)水箱(40 L)中，每箱20只，記錄每箱中對(duì)蝦的初始質(zhì)量。9個(gè)水箱隨機(jī)分為3組(對(duì)照組、EG5和EG6)，并加入GJWA3菌懸液，使實(shí)驗(yàn)組EG5和EG6中的水體菌濃度分別為1×105、1×106CFU/mL，對(duì)照組添加等量PBS。實(shí)驗(yàn)過程中，每天喂蝦3次，每天換水，換水后加入菌懸液補(bǔ)充至相應(yīng)的菌濃度。飼養(yǎng)14 d后，測(cè)定剩余蝦的存活數(shù)量和質(zhì)量，根據(jù)公式：存活率=最終對(duì)蝦存活數(shù)量/20×100%，增重率=(終末質(zhì)量-初始質(zhì)量)/初始質(zhì)量× 100%，計(jì)算存活率和增重率。并通過測(cè)定剩余對(duì)蝦的血細(xì)胞總數(shù)、血漿的抗菌活性和吞噬活性[6]，評(píng)價(jià)對(duì)蝦的免疫能力。

1.7 測(cè)定方法及數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 菌株GJWA3的鑒定

分離菌株GJWA3在2216E瓊脂平板上形成的菌落呈圓形，白色，不透明，邊緣規(guī)則，表面光滑。顯色反應(yīng)表明該菌株為革蘭氏陰性。擴(kuò)增菌株GJWA3的16S rRNA基因序列大小為1 432 bp，BLAST結(jié)果表明，菌株GJWA3與Halomonasmeridianastrain SCSIO 43005(GenBank:CP024621.1)的相似度為97.94%，在GenBank挑選與分離菌株相似的10株菌的16S rRNA基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖1)，結(jié)果證明，菌株GJWA3為鹽單胞菌。對(duì)菌株GJWA3的生理生化鑒定結(jié)果顯示接觸酶、產(chǎn)氨酶、硝酸鹽還原酶試驗(yàn)表現(xiàn)陽性，甲基紅、V-P、淀粉水解、吲哚、明膠液化試驗(yàn)表現(xiàn)陰性，葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)表現(xiàn)為發(fā)酵型。

(遺傳距離為0.010 0。0.010 0 denotes the genetic distance.)圖1 菌株GJWA3與參考菌株的16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化Fig.1 Phylogenetic tree constructed from 16S rRNA gene sequences of strain GJWA3 and comparative reference strains

2.2 菌株GJWA3的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化特性分析

圖2 菌株GJWA3在不同氮源下的脫氮表現(xiàn)和生長情況Fig.2 Nitrogen removal performance and cell growth of strain GJWA3 under different nitrogen sources

表1 菌株GJWA3在不同氮源下的氮平衡Table 1 Nitrogen balance of strain GJWA3 under different nitrogen sources

2.3 單一環(huán)境因素對(duì)菌株GJWA3的去除能力的影響

圖3 不同因素對(duì)菌株GJWA3的去除能力影響Fig.3 Effects of different factors on removal ability of strain GJWA3

2.4 間接ELISA菌株定量方法的建立與應(yīng)用

2.4.1 間接ELISA定量方法的建立 菌株GJWA3免疫兔抗血清的效價(jià)見表2。P/N值在稀釋比例為1∶32 000時(shí)大于2.1，在稀釋比例為1∶64 000時(shí)小于2.1。因此，兔抗血清的效價(jià)為1∶32 000，滿足間接ELISA定量檢測(cè)的要求。ELISA的最佳條件為抗血清稀釋1∶1 000，抗原抗體反應(yīng)30 min，二抗稀釋1∶3 000。在上述條件下，菌株GJWA3的菌濃度與OD450之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性(R2=0.957 2)。間接ELISA對(duì)菌株GJWA3的檢測(cè)范圍為1×104～1×108CFU/mL (見圖4)。

表2 菌株GJWA3對(duì)應(yīng)的抗體效價(jià)Table 2 Antibody titer corresponding to strain GJWA3

圖4 間接ELISA法測(cè)定菌株GJWA3濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 The standard curve of GJWA3 concentration was determined by indirect ELISA

圖5 菌株GJWA3接種到實(shí)際海水養(yǎng)殖水(a)和養(yǎng)殖廢水(b)中的氮濃度、菌株濃度(BC)變化Fig.5 Changes of nitrogen concentration and bacterial concentration (BC)of strain GJWA3 inoculated into actual mariculture water (a)and aquaculture wastewater (b)

2.5 菌株GJWA3的安全性評(píng)估

在血平板上未發(fā)現(xiàn)溶血圈，證明菌株GJWA3不具有溶血活性(見圖6)。在凡納濱對(duì)蝦實(shí)際養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)過14 d的養(yǎng)殖，添加菌液的實(shí)驗(yàn)組(EG5、EG6)對(duì)蝦存活率均略高于對(duì)照組(見表3)，但并無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異。此外，對(duì)蝦的增重率無顯著差異，對(duì)蝦的血細(xì)胞總數(shù)、抗菌活性和血漿吞噬率指標(biāo)三組間也無明顯差異。綜合結(jié)果表明，菌株GJWA3對(duì)凡納濱對(duì)蝦具有較高的生物安全性。

圖6 菌株GJWA3的溶血活性Fig.6 Hemolysis activity of strain GJWA3

表3 菌株GJWA3對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長、存活和部分免疫指標(biāo)的影響Table 3 Effects of strain GJWA3 on the growth,survival and some immune indexes of Penaeus vannamei

3 討論

3.1 菌株的分離與脫氮特性

3.2 不同環(huán)境條件下菌株GJWA3的去除特性

3.3 菌株定量方法的建立與應(yīng)用

間接ELISA檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中的致病菌的檢測(cè)和定量，Anand等[30]利用間接ELISA技術(shù)建立了副溶血弧菌的檢測(cè)方法，并證明具有很高的特異性；祝璟琳等[31]利用間接ELISA技術(shù)建立無乳鏈球菌的檢測(cè)方法，并對(duì)感染無乳鏈球菌死亡的羅非魚腦組織進(jìn)行檢測(cè)，陽性率為100%。本研究采用間接ELISA建立了HN-AD菌GJWA3的定量檢測(cè)方法。菌株豐度和OD450值的相關(guān)性與標(biāo)準(zhǔn)曲線高度一致，R2=0.957 2，精度高于V.alginolyticus的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。定量范圍為1×104～1×108CFU/mL，大于Campylobacterjejuni[32]的檢測(cè)范圍，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

除了在無菌合成培養(yǎng)基中具有出色的氮去除能力，更重要的是在實(shí)際養(yǎng)殖水環(huán)境中進(jìn)行高效的氮去除，因?yàn)榫哂袕?fù)雜離子成分和菌群結(jié)構(gòu)的實(shí)際養(yǎng)殖水對(duì)添加菌株的生存和氮去除具有巨大挑戰(zhàn)[10]。在海水實(shí)際養(yǎng)殖水和實(shí)際養(yǎng)殖廢水中，菌株GJWA3對(duì)總氮的去除率分別為49.01%、62.48%，與其他HN-AD菌的去除率相似[33]。此外，利用間接ELISA定量方法檢測(cè)到菌株在養(yǎng)殖實(shí)際水體和廢水中的豐度保持在1×106CFU/mL，略高于已報(bào)道的蝦養(yǎng)殖池中異養(yǎng)菌豐度(1.5×104～8.1×105CFU/mL)[34]，一方面表示建立的間接ELISA定量方法在其他菌落存在的情況下仍能對(duì)菌株GJWA3進(jìn)行準(zhǔn)確定量；另一方面表現(xiàn)菌株GJWA3對(duì)于海水養(yǎng)殖環(huán)境具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，后期菌株豐度的降低可能是由于水和廢水中能量物質(zhì)的缺乏造成的。本研究的結(jié)果顯示，鹽單胞菌GJWA3能夠有效去除海水養(yǎng)殖水和養(yǎng)殖廢水中的氮，間接ELISA定量方法驗(yàn)證了該菌株可以在海水養(yǎng)殖水和廢水中定植并保持較高的豐度，并為以后菌株GJWA3實(shí)際應(yīng)用的檢測(cè)提供了切實(shí)可行的方法。

3.4 菌株GJWA3的安全性評(píng)價(jià)

菌株GJWA3具有良好的脫氮能力，可作為一種潛在的益生菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。然而，在實(shí)際應(yīng)用之前評(píng)估潛在益生菌的安全性是至關(guān)重要的一步[35]。Yun等為了評(píng)價(jià)益生菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦的安全性[36]，將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×105CFU/mL，有研究將細(xì)菌濃度調(diào)整為1×105和1×108CFU/mL[6]。本研究所用細(xì)菌濃度分別為1×105和1×106CFU/mL，結(jié)果顯示，對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長、存活和部分免疫參數(shù)均無顯著影響。此外，有報(bào)道稱多種細(xì)菌都能產(chǎn)生能夠引起細(xì)胞膜損傷、細(xì)胞裂解等毒性作用的溶血素[37]，檢測(cè)菌株是否產(chǎn)生溶血素已成為評(píng)價(jià)菌株安全性的重要標(biāo)準(zhǔn)。菌株GJWA3在血平板上無溶血反應(yīng)，與Pseudomonassp.ABSK55[38]相似。因此，菌株GJWA3可以安全地用于養(yǎng)殖水體中的脫氮。

4 結(jié)語