短期饑餓對(duì)花鱸血清生化指標(biāo)、肝臟抗氧化酶活性及攝食調(diào)控信號(hào)通路的影響*

孫亞龍，李文娟，溫海深，李 昀，張凱強(qiáng)

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國(guó)海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

在自然界中，由于環(huán)境變化、季節(jié)更替、棲息地改變、食物分布不均等原因，魚(yú)類(lèi)常常處于饑餓狀態(tài)；而人工養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)，由于投喂不及時(shí)、投喂不均勻、餌料不適口等原因，同樣有個(gè)體處于饑餓狀態(tài)。饑餓會(huì)影響魚(yú)類(lèi)的生長(zhǎng)、消化、代謝、免疫、生殖等生理活動(dòng)[1]。

目前研究表明，饑餓脅迫對(duì)魚(yú)類(lèi)生理生化指標(biāo)及攝食調(diào)控信號(hào)通路有顯著影響。例如，對(duì)胭脂魚(yú)(Myxocyprinusasiaticus)的研究發(fā)現(xiàn)血糖(Glucose，GLU)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine amino-transferase，ALT)的濃度隨饑餓時(shí)間的增加顯著降低[2]。在團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)中饑餓將會(huì)影響肝臟的抗氧化能力，表現(xiàn)為超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性的下降[3]。對(duì)刀鱭(Coilianasus)的研究發(fā)現(xiàn)，饑餓可使其血清皮質(zhì)醇(Cortisol,COR)濃度迅速上升[4]。

機(jī)體能量穩(wěn)態(tài)與采食量的協(xié)調(diào)是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，需要很多營(yíng)養(yǎng)感應(yīng)信號(hào)通路和因子共同調(diào)節(jié)。直接的調(diào)控系統(tǒng)為leptin-mTOR-S6K1-NPY/AgRP/POMC攝食調(diào)控信號(hào)通路[5]。瘦蛋白(Leptin)是由肥胖基因編碼，主要由脂肪組織分泌，發(fā)出脂肪儲(chǔ)存飽和信號(hào)，經(jīng)外周傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，隨之發(fā)生攝食減少和增加能量消耗的生理過(guò)程[6]。雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)信號(hào)的整合器，研究表明，其在機(jī)體能量和代謝調(diào)控過(guò)程中起重要作用。在動(dòng)物攝食調(diào)控方面，mTOR能夠在下丘腦弓狀核中被激活，胞外或胞內(nèi)的影響因子與細(xì)胞表面受體或靶蛋白結(jié)合，然后將信號(hào)傳導(dǎo)至mTOR或直接作用于其下游效應(yīng)器—核糖體蛋白S6激酶1(S6K1)，進(jìn)而調(diào)節(jié)再下游食欲肽阿黑皮素原(POMC)的表達(dá)[5]。POMC為抑食欲肽，可以抑制食物攝入并刺激能量消耗。該通路的研究在果蠅、小鼠等中已經(jīng)非常系統(tǒng)且成熟，但是在水生生物中的研究較少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，饑餓脅迫使南亞野鯪(Labeorohita)肝臟中Leptin基因表達(dá)下調(diào)[6]。經(jīng)過(guò)Leptin蛋白處理后的虹鱒(Oncorhynchusmykiss)攝食行為受到抑制，pomc基因表達(dá)上調(diào)[7]。mtor和s6k1基因在魚(yú)類(lèi)中的研究主要集中在氨基酸、葡萄糖和脂肪代謝，對(duì)魚(yú)類(lèi)調(diào)控?cái)z食的影響研究較少。

花鱸(Lateolabraxmaculatus)隸屬鱸形目(Perciformes)鮨科(Serranidae)花鱸屬(Lateolabrax)，是我國(guó)重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。本研究通過(guò)測(cè)定短期饑餓條件下花鱸血清生化指標(biāo)、激素指標(biāo)、肝臟抗氧化酶活性分析花鱸生理生化指標(biāo)詳細(xì)的變化過(guò)程，并且還研究了短期饑餓對(duì)Leptin-mTOR-S6K1-NPY/AGRP/POMC攝食調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)基因在花鱸組織中相對(duì)表達(dá)量的影響，有助于了解花鱸在短期饑餓脅迫下的生理響應(yīng)及分子調(diào)控機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)在東營(yíng)市利津縣雙瀛水產(chǎn)苗種有限責(zé)任公司進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)用魚(yú)為該公司人工繁育的同一批次體質(zhì)健壯、無(wú)外傷的健康花鱸，體質(zhì)量為(100.00±5.00)g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

隨機(jī)選取100尾體格健壯，活力較好的花鱸置于室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)2周使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，暫養(yǎng)期間于每天上午9：00和下午5：00各投喂一次配合飼料，每天換水量為總水體的1/3。暫養(yǎng)以及實(shí)驗(yàn)期間的水質(zhì)指標(biāo)為：溫度(24.0±2.0)℃，溶解氧大于5.0 mg/L，pH為7.83～8.31。暫養(yǎng)2周后分別在饑餓0(對(duì)照)、1、6、12、24、48和72 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行采樣。

1.3 樣品的采集

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集6尾花鱸，采樣前將實(shí)驗(yàn)魚(yú)使用MS-222 麻醉劑(200 mg/L)麻醉。用2 mL一次性無(wú)菌注射器從魚(yú)體尾靜脈取血，放于1.5 mL分子管中置于4 ℃冰箱中暫存，采樣結(jié)束后進(jìn)行離心(4 ℃，5 000 r/min，10 min)，吸取上清后，迅速置于液氮中冷凍保存，隨后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱(-80 ℃)中，用于后續(xù)的血清生化及激素指標(biāo)測(cè)定。采集肝臟組織，用酒精棉球擦干表面血液后剪碎放入1.5 mL分子管中放入液氮中速凍，而后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中存儲(chǔ)，用于肝臟抗氧化酶的測(cè)定。另取其胃和腦組織放入1.5 mL分子管中，放入液氮中，采樣結(jié)束后放入超低溫-80 ℃冰箱中保存，用于RNA提取。

1.4 血清生化及肝臟抗氧化指標(biāo)的測(cè)定

使用BS-1800全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)進(jìn)行8個(gè)血清生化指標(biāo)的測(cè)定，分別為谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、白蛋白(Albumin，ALB)、總蛋白(Total protein，TP)、總膽固醇(Total cholesterol，TC)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)及乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)，所用試劑盒均購(gòu)自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司。

采用上海酶聯(lián)生物科技有限公司的酶聯(lián)免疫分析試劑盒進(jìn)行血清激素指標(biāo)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(Insulin-like growth factor 1,IGF-1)、皮質(zhì)醇(COR)、三碘甲狀腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲狀腺素(Thyroxine,T4)的測(cè)定。

使用南京建成生物工程研究所的超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試盒和丙二醛(Malondialdehyde,MDA)測(cè)試盒分別進(jìn)行肝臟SOD和MDA抗氧化酶指標(biāo)活性的測(cè)定。

1.5 攝食調(diào)控相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量分析

1.5.1 總RNA的提取和cDNA的合成 采用Trizol法提取樣品中的總RNA。用NanoDrop ND-1000核酸測(cè)定儀(NanoDrop Technologies，美國(guó))測(cè)定總RNA濃度，同時(shí)利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TAKARA，日本)去除基因組DNA和反轉(zhuǎn)錄為cDNA產(chǎn)物。

1.5.2 目的基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 從Genebank中獲得花鱸的mtor(No.KJ746670)和s6k1(No.KJ746671)基因序列；同時(shí)從花鱸基因組(BioProject:PRJNA408177)中獲得leptin和pomc基因序列，用Primer 5設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物(見(jiàn)表1)。

表1 花鱸攝食調(diào)控相關(guān)基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物Table 1 Primers for real-time qPCR of feed intake regulation related gene in Lateolabrax maculatus

攝食相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量利用StepOnePlusTMReal-Time PCR系統(tǒng) (Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行檢測(cè)，所用試劑為T(mén)B Green Premix Ex Taq GC (Perfect Real Time)試劑盒(TAKARA，日本)。qPCR體系為：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，上、下游引物各0.8 μL，ROX reference dye (50×)0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。程序?yàn)椋旱谝徊?5 ℃ 預(yù)變性30 s；第二步95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。以18s為內(nèi)參基因，按照2-△△CT計(jì)算方法求得基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用EXCEL 2010、SPSS 22.0軟件進(jìn)行處理，通過(guò)單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重比較檢驗(yàn)顯著差異性。以P<0.05為顯著性水平，所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。

2 結(jié)果

2.1 短期饑餓脅迫對(duì)花鱸血清生化指標(biāo)的影響

短期饑餓脅迫對(duì)花鱸血清生化指標(biāo)的影響見(jiàn)圖1。由圖1A可知，隨饑餓時(shí)間的延長(zhǎng)，花鱸血清ALT濃度呈先上升后下降再上升后下降的動(dòng)態(tài)變化，在饑餓48和72 h時(shí)，ALT濃度顯著低于0 h(P<0.05)。ALP濃度在饑餓0～12 h呈先下降后上升再急劇下降的趨勢(shì)，饑餓12 h后，ALP濃度均顯著低于0 h(P<0.05)(見(jiàn)圖1B)。血清ALB濃度呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì)，除饑餓24 h外，各時(shí)間點(diǎn)ALB濃度均顯著低于0 h(P<0.05)(見(jiàn)圖1C)。血清TP濃度在饑餓72 h內(nèi)無(wú)顯著性變化(見(jiàn)圖1D)。

(A：谷丙轉(zhuǎn)氨酶；B：堿性磷酸酶；C：白蛋白；D：總蛋白；E：總膽固醇；F：甘油三酯；G：血糖；H：乳酸脫氫酶。圖中不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。A:Alanine aminotransferase;B:Alkaline phosphatase;C:Albumin;D:Total protein;E:Total cholesterol;F:Triglyceride;G:Glucose;H:Lactate dehydrogenase.Different letters indicate significant difference (P<0.05),the same below.)圖1 短期饑餓脅迫對(duì)花鱸血清生化指標(biāo)的影響Fig.1 Effects of short-term starvation on serum biochemical indices of Lateolabrax maculatus

由圖1E可知，花鱸血清TC濃度隨饑餓時(shí)間的增加呈先下降后上升再下降趨勢(shì)，除12和24 h與0 h無(wú)顯著差異外，其余各饑餓時(shí)間點(diǎn)的TC濃度均顯著低于0 h(P<0.05)。饑餓1 h后，血清TG濃度呈先急劇下降后小幅度回升趨勢(shì)，各時(shí)間點(diǎn)TG濃度均顯著低于0和1 h(P<0.05)，在12 h達(dá)到最低 (見(jiàn)圖1F)。由圖1G可知，血清GLU濃度在0～12 h呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，在12～24 h濃度回升至0 h水平，24 h后又顯著下降，48 h后GLU濃度顯著低于0 h(P<0.05)。血清LDH濃度整體波動(dòng)不大，除12 h顯著低于0 h外(P<0.05)，在其余時(shí)間點(diǎn)與0 h無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖1H)。

2.2 短期饑餓脅迫對(duì)花鱸血清激素指標(biāo)的影響

短期饑餓脅迫對(duì)花鱸血清相關(guān)激素的影響見(jiàn)圖2。血清中IGF-1的濃度在饑餓后立即上升，于1～12 h顯著高于0 h,12 h后濃度下降，在72 h時(shí)與0 h無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖2A)。饑餓1和6 h時(shí)，血清T3濃度顯著高于0 h，而后各時(shí)間點(diǎn)濃度均顯著低于0 h(P<0.05)(見(jiàn)圖2B)。

由圖2C可知，隨著饑餓時(shí)間的增加，血清T4濃度呈先降低后升高的趨勢(shì)，饑餓1和6 h時(shí)，其濃度顯著低于0 h(P<0.05)，12 h后濃度逐漸升高，但與0 h無(wú)顯著性差異。血清皮質(zhì)醇濃度在饑餓后變化最為劇烈，在饑餓1 h時(shí)顯著高于0 h(P<0.05)，而在6和24 h時(shí)，濃度達(dá)到最低值(低于0 h約5.55倍，P<0.05)，24 h后濃度逐漸恢復(fù)，于72 h恢復(fù)至與 0 h無(wú)顯著差異(見(jiàn)圖2D)。

(A：胰島素樣生長(zhǎng)因子-1；B：三碘甲狀腺原氨酸；C：甲狀腺素；D：皮質(zhì)醇。A:Insulin-like growth factor 1;B:Triiodothyronine;C:Thyroxine;D:Cortisol.)圖2 短期饑餓脅迫對(duì)花鱸血清激素的影響Fig.2 Effects of short-term starvation on serum hormones in Lateolabrax maculatus

2.3 短期饑餓脅迫對(duì)花鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

短期饑餓脅迫對(duì)花鱸肝臟SOD活力和MDA含量的影響見(jiàn)圖3。隨著饑餓時(shí)間的增加，肝臟SOD活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，饑餓后1、6和12 h，其活力顯著高于0 h (P<0.05)，且6 h時(shí)活力最高，而后濃度逐漸降低，但與0 h無(wú)顯著性差異(見(jiàn)圖3A)。

饑餓后1～24 h，花鱸肝臟MDA濃度顯著高于0 h，且6 h 達(dá)峰值。饑餓48 h時(shí)，肝臟MDA濃度顯著低于其他時(shí)間點(diǎn)，達(dá)最小值(P<0.05)。饑餓72 h時(shí)，肝臟MDA濃度恢復(fù)至初始水平(見(jiàn)圖3B)。

2.4 短期饑餓脅迫對(duì)花鱸攝食調(diào)控信號(hào)通路相關(guān)基因的影響

2.4.1 短期饑餓對(duì)外周leptin基因表達(dá)的影響 短期饑餓脅迫對(duì)外周leptin基因表達(dá)的影響見(jiàn)圖4。隨著饑餓時(shí)間的增加，在饑餓1和6 h時(shí)胃中l(wèi)eptin基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。饑餓12 h時(shí)與0 h無(wú)顯著性差異。饑餓24、48和72 h時(shí)表達(dá)量顯著低于0 h(P<0.05)。

(A：超氧化物歧化酶；B：丙二醛。A:Superoxide dismutase;B:Malondialdehyde.)圖3 短期饑餓對(duì)花鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響Fig.3 Effects of short-term starvation on antioxidant index in Lateolabrax maculatus

圖4 短期饑餓對(duì)花鱸胃中l(wèi)eptin相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.4 Effects of short-term starvation on the relative expression of leptin in the stomach of Lateolabrax maculatus

2.4.2 短期饑餓脅迫對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)mTOR-S6K1-POMC攝食調(diào)控信號(hào)通路的影響 短期饑餓脅迫對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)mTOR-S6K1-POMC攝食調(diào)控信號(hào)通路的影響見(jiàn)圖5。由圖5A可知，花鱸腦中mtor相對(duì)表達(dá)量在饑餓6 h時(shí)最高且顯著高于0 h(P<0.05)，在饑餓72 h時(shí)表達(dá)量最低且顯著低于0 h(P<0.05)?；|腦中s6k1的相對(duì)表達(dá)量呈先急劇升高后降低的趨勢(shì)，在饑餓后1 h達(dá)到峰值,其相對(duì)表達(dá)量是0 h的7.16倍，在其余各時(shí)間點(diǎn)與0 h無(wú)顯著差異(P<0.05)(見(jiàn)圖5B)。花鱸腦中pomc的相對(duì)表達(dá)量在饑餓后24 h時(shí)最高，為0 h的4.00倍，且顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)，于72 h恢復(fù)至0 h水平(見(jiàn)圖5C)。

(A：雷帕霉素靶蛋白基因；B：核糖體蛋白S6激酶1基因；C：阿片黑素促皮質(zhì)激素原基因。A:mtor;B:s6k1;C:pomc.)圖5 短期饑餓對(duì)花鱸腦中攝食調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of short-term starvation on relative mRNA levels of feed intake regulation-related genes in the brain of Lateolabrax maculatus

3 討論

無(wú)論是在自然界中還是人工養(yǎng)殖的魚(yú)類(lèi)，都有可能因?yàn)槭澄锘蝻暳隙倘奔碍h(huán)境變化等原因?qū)е聜€(gè)體面臨饑餓脅迫狀態(tài)，而這會(huì)影響魚(yú)類(lèi)的多種生理活動(dòng)。因此，研究在短期饑餓脅迫后相關(guān)的生理、生化指標(biāo)的響應(yīng)情況及相關(guān)基因的表達(dá)變化，對(duì)解析魚(yú)類(lèi)響應(yīng)饑餓脅迫的生理響應(yīng)及分子機(jī)制、指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)具有參考意義。

3.1 短期饑餓對(duì)花鱸血清生化指標(biāo)的影響

ALT主要存在于肝臟細(xì)胞中，當(dāng)肝臟細(xì)胞受損時(shí)，ALT進(jìn)入血清，血清ALT濃度升高[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示饑餓后期花鱸血清ALT含量降低，這說(shuō)明花鱸通過(guò)機(jī)體調(diào)節(jié)已逐漸適應(yīng)饑餓條件，進(jìn)入低代謝狀態(tài)[9]。對(duì)菊黃東方鲀(Takifuguflavidus)[10]的研究表明，在饑餓達(dá)25 d時(shí)，菊黃東方鲀血清ALT活性沒(méi)有顯著變化。而對(duì)團(tuán)頭魴(M.amblycephala)[3]和大黃魚(yú)(Lari-michthyscrocea)[11]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期饑餓條件下，其血清ALT活性均增加。這表明，不同魚(yú)類(lèi)對(duì)饑餓條件的耐受能力不同，饑餓對(duì)魚(yú)類(lèi)血清ALT的影響可能與魚(yú)的種類(lèi)有關(guān)。本研究結(jié)果表明饑餓使花鱸血清ALP濃度下降，這可能是因?yàn)樵陴囸I條件下血清中GLU和TG含量降低，腸上皮細(xì)胞對(duì)ALP的吸收受到影響所致。ALP作為直接參與磷酸代謝過(guò)程的一類(lèi)重要的代謝調(diào)控酶，影響魚(yú)體吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)草魚(yú)(Ctenopharyngodonidella)[12]和尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)[13]的研究結(jié)果顯示饑餓使其ALP活性顯著下降，與本研究結(jié)果一致。但是對(duì)鲇魚(yú)(SilurusasotusLinnaeus)[14]研究結(jié)果顯示饑餓對(duì)其血清ALP活性無(wú)影響。

血清TP分為ALB和球蛋白(GLOB)，白蛋白是血漿中一類(lèi)重要的載體，球蛋白是重要的免疫抗體[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示饑餓對(duì)花鱸血清TP濃度無(wú)顯著影響，而ALB濃度降低，因此血清球蛋白濃度升高。這可能是由于饑餓引起花鱸體內(nèi)抗體增加，來(lái)應(yīng)對(duì)饑餓條件。對(duì)刀鱭(C.nasus)[4]的研究結(jié)果表明在饑餓2 d時(shí)其血TP和GLOB濃度升高，與本研究結(jié)果相似。

本研究結(jié)果顯示花鱸血清TC隨饑餓時(shí)間的增加處于一種動(dòng)態(tài)平衡，而血清TG的濃度明顯降低。對(duì)尼羅羅非魚(yú)(O.niloticus)[13]和吉富羅非魚(yú)(O.niloti-cus)[16]的研究結(jié)果顯示在饑餓試驗(yàn)期間，TC濃度無(wú)顯著變化。這可能是因?yàn)檫@幾種魚(yú)類(lèi)血清TC濃度不受饑餓條件的影響，其作用機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。花鱸應(yīng)對(duì)短期饑餓脅迫時(shí)，TG含量急劇下降。對(duì)菊黃東方鲀(T.flavidus)[10]的研究結(jié)果顯示饑餓時(shí)其血清TG含量呈下降趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相一致。這表明在饑餓條件下，花鱸可能會(huì)分解TG給機(jī)體供給能量，TG在花鱸響應(yīng)短期饑餓脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用。

GLU是魚(yú)類(lèi)主要的能量來(lái)源，主要有兩條調(diào)節(jié)途徑：糖原分解和糖異生。本實(shí)驗(yàn)中饑餓0～12 h血清GLU含量降低，這可能是饑餓條件下幾乎沒(méi)有糖原分解途徑所導(dǎo)致，而在饑餓24 h時(shí)GLU含量恢復(fù)至0 h水平，可能是因?yàn)樘钱惿緩街兄竞偷鞍踪|(zhì)異生成GLU，對(duì)血清GLU含量進(jìn)行了補(bǔ)充。對(duì)刀鱭(C.nasus)[4]的研究結(jié)果表明在饑餓0～5 d時(shí)，其血清GLU含量顯著降低，與本研究結(jié)果相似。這表明，GLU在魚(yú)體應(yīng)對(duì)饑餓脅迫時(shí)起重要作用。而對(duì)團(tuán)頭魴(M.amblycephala)[3]、吉富羅非魚(yú)(O.niloticus)[16]和瓦氏黃顙魚(yú)(Pelteobagrusvachelli)[17]的研究中發(fā)現(xiàn)在饑餓期間GLU含量無(wú)顯著變化，表明其可能會(huì)適應(yīng)性調(diào)節(jié)血糖含量，來(lái)維持正常的生理活動(dòng)。本研究結(jié)果表明在饑餓后血清LDH含量先降低后升高，在12 h時(shí)達(dá)到最低，從GLU含量可以看出，在饑餓12 h時(shí)花鱸體內(nèi)可能正在進(jìn)行糖異生，糖異生途徑以及饑餓前期的糖酵解途徑消耗了大量的LDH。對(duì)齊口裂腹魚(yú)(Schizothoraxprenanti)[18]的研究結(jié)果表明饑餓處理24 h使其血清LDH濃度降低，與本研究結(jié)果類(lèi)似。這表明，LDH在魚(yú)體應(yīng)對(duì)饑餓脅迫時(shí)的糖酵解過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3.2 短期饑餓對(duì)花鱸血清激素指標(biāo)的影響

IGF-1主要在肝臟中合成，在結(jié)構(gòu)功能上與胰島素相似，具有促進(jìn)葡萄糖和脂肪酸吸收、降低血清中甘油三酯含量的作用[19]。本研究結(jié)果顯示隨著饑餓時(shí)間的增加，血清IGF-1濃度在饑餓12 h時(shí)最高，后降低到0 h 水平，這可能與12 h時(shí)血清中TG和GLU含量顯著下降相關(guān)。而在虹鱒(O.mykiss)[20]、尼羅羅非魚(yú)(O.niloticus)[13]和異育銀鯽(Carassiusauratusgibelio)[21]中的研究結(jié)果與本研究結(jié)果不同，其血清IGF-1濃度分別在饑餓21、28和14 d時(shí)顯著降低。

甲狀腺激素包括T3和T4，參與生長(zhǎng)、繁殖、發(fā)育、能量代謝等多種生理活動(dòng)[22]。研究結(jié)果顯示，隨著饑餓時(shí)間的增加，花鱸血清T3濃度先增加后減少。對(duì)黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)[23]的研究結(jié)果顯示，饑餓使其血清T3水平顯著降低，這與本研究結(jié)果相同，表明魚(yú)類(lèi)會(huì)通過(guò)降低血清T3濃度來(lái)應(yīng)對(duì)饑餓。本研究結(jié)果顯示饑餓72 h時(shí)花鱸血清T4濃度仍維持在起始水平，這可能是由于饑餓時(shí)間太短，對(duì)T4的影響還不顯著所致。

皮質(zhì)醇被稱為應(yīng)激激素，在機(jī)體處于應(yīng)激、饑餓或營(yíng)養(yǎng)不良狀態(tài)下，其濃度會(huì)升高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在饑餓1 h時(shí)皮質(zhì)醇濃度顯著增加，可能由于饑餓迅速引起了花鱸的應(yīng)激反應(yīng)，皮質(zhì)醇濃度的增加能促進(jìn)蛋白質(zhì)的分解和減少脂肪的儲(chǔ)存來(lái)響應(yīng)饑餓脅迫。對(duì)刀鱭(C.nasus)的研究發(fā)現(xiàn)，在饑餓2 d時(shí)血清皮質(zhì)醇迅速上升，到第5天達(dá)到最大值[4]。而對(duì)舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)和黑點(diǎn)海鯛(Pagellusbogaraveo)[24]的研究發(fā)現(xiàn)饑餓不會(huì)導(dǎo)致其血清皮質(zhì)醇水平的變化。這表明饑餓對(duì)魚(yú)類(lèi)血清皮質(zhì)醇濃度的影響可能因種類(lèi)而異。

3.3 短期饑餓對(duì)花鱸肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物，會(huì)引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細(xì)胞毒性。SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化酶，能消除鏈反應(yīng)引發(fā)階段的自由基及其他引發(fā)劑，SOD活力的高低間接反映機(jī)體消除自由基的能力，MDA含量高低也間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[25]。

在本研究中，隨著饑餓時(shí)間的增加，花鱸肝臟SOD及MDA的活力均先升高后降低。MDA在饑餓24 h內(nèi)活力升高，在48 h達(dá)最小值，說(shuō)明花鱸在饑餓脅迫時(shí)處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。SOD活力升高提高了花鱸抗氧化能力來(lái)適應(yīng)饑餓條件，并修復(fù)氧化損傷，因此推測(cè)在饑餓48 h時(shí)MDA基本被消除。饑餓72 h時(shí)MDA和SOD活力與0 h均無(wú)顯著差異，說(shuō)明饑餓3 d對(duì)花鱸的抗氧化能力沒(méi)有顯著影響。對(duì)異育銀鯽(C.auratusgibelio)幼魚(yú)的研究發(fā)現(xiàn)，在饑餓1 d時(shí)SOD活力顯著下降[26]。對(duì)方斑東風(fēng)螺(Babyloniaareolata)[27]的研究中發(fā)現(xiàn)，在饑餓25 d前SOD活力逐漸增強(qiáng)，到40 d時(shí)SOD含量顯著降低。這說(shuō)明饑餓對(duì)水生生物抗氧化能力的影響因種類(lèi)而異，但是長(zhǎng)期饑餓會(huì)導(dǎo)致生物抗氧化能力的降低，必然打破機(jī)體氧化和抗氧化平衡。

3.4 短期饑餓對(duì)花鱸攝食調(diào)控信號(hào)通路的影響

瘦素在哺乳動(dòng)物和魚(yú)類(lèi)中均被證實(shí)是一種多功能的激素，不僅參與調(diào)控?cái)z食和機(jī)體能量，還參與生長(zhǎng)繁殖，發(fā)育和應(yīng)激應(yīng)答[28-29]。瘦素可發(fā)出脂肪儲(chǔ)存飽和信號(hào)，經(jīng)外周傳入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，個(gè)體隨之發(fā)生減少攝食和增加能量消耗的生理過(guò)程[6]。胃是瘦素的主要來(lái)源,胃內(nèi)的瘦素水平主要受營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)的管理。已有研究報(bào)道，饑餓脅迫使南亞野鯪(Labeorohita)[6]和齊口裂腹魚(yú)(S.prenanti)[30]肝臟中l(wèi)eptin基因表達(dá)下調(diào)。而本研究結(jié)果顯示，饑餓12 h時(shí)胃leptin基因表達(dá)量增加，可能是因?yàn)榇藭r(shí)花鱸GLU和TG含量降低處于高代謝狀態(tài)；花鱸饑餓48和72 h后，外周組織胃leptin基因表達(dá)量顯著降低，可能是因?yàn)榛|會(huì)通過(guò)降低代謝率來(lái)儲(chǔ)存脂肪以應(yīng)對(duì)饑餓條件。

外周組織負(fù)責(zé)感應(yīng)機(jī)體能量狀態(tài)，能夠?qū)⑺a(chǎn)生的食欲通過(guò)內(nèi)分泌途徑傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，最終由下丘腦對(duì)這些內(nèi)分泌信號(hào)進(jìn)行整合，通過(guò)神經(jīng)信號(hào)調(diào)控食欲相關(guān)因子對(duì)攝食進(jìn)行動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)。mTOR作為生長(zhǎng)因子和營(yíng)養(yǎng)信號(hào)的整合器，其在機(jī)體能量和代謝調(diào)控過(guò)程中起著重要作用[31-32]。S6K1為mTOR調(diào)控蛋白翻譯的下游效應(yīng)器，其磷酸化是mTOR活性啟動(dòng)的一個(gè)標(biāo)志，此外激活的S6K1能夠增加其生熱作用，影響機(jī)體的能量代謝[33]。本研究結(jié)果顯示花鱸腦中mtor的表達(dá)量在饑餓后呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，說(shuō)明mTOR在機(jī)體能量感知方面有重要作用。s6k1表達(dá)量在饑餓1 h時(shí)顯著增加，其分子磷酸化水平上升，后一直處于低表達(dá)水平，說(shuō)明饑餓會(huì)降低其磷酸化水平。對(duì)虹鱒(O.mykiss)的研究顯示，經(jīng)過(guò)Leptin處理后其攝食行為受到抑制，pomc表達(dá)上調(diào)[7]。在本研究中，pomc在饑餓24 h時(shí)表達(dá)量顯著增加，可能是由于12 h時(shí)胃leptin基因表達(dá)量增加所致。在48和72 h時(shí)，pomc又恢復(fù)到初始水平，可能是饑餓使花鱸處于低代謝狀態(tài)，s6k1磷酸化水平降低，pomc表達(dá)下調(diào)降低能量消耗。

4 結(jié)語(yǔ)

本文主要研究了花鱸面臨短期饑餓時(shí)的生理及分子響應(yīng)機(jī)制，聚焦生理生化指標(biāo)以及攝食調(diào)控通路Leptin-mTOR-S6K1-POMC的基因表達(dá)變化。研究結(jié)果表明，在血清生化水平上，花鱸通過(guò)降低血清ALT、ALP、ALB、TC、TG、GLU和T3的濃度來(lái)響應(yīng)短期饑餓脅迫，TP則無(wú)明顯變化。在應(yīng)對(duì)短期饑餓脅迫過(guò)程中，花鱸肝臟抗氧化酶指標(biāo)SOD和MDA活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。在分子水平上，花鱸通過(guò)調(diào)控胃中l(wèi)eptin基因相對(duì)表達(dá)量的變化，腦中mtor、s6k1和pomc基因先升高后降低的表達(dá)水平來(lái)應(yīng)對(duì)短期饑餓。因此，花鱸可通過(guò)調(diào)控血清生化指標(biāo)、肝臟抗氧化酶活性及攝食調(diào)控通路相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)共同響應(yīng)短期饑餓脅迫。