一測(cè)多評(píng)法測(cè)定礞石滾痰丸中6種成分含量

趙新紅，范 珊，齊永秀

（山東第一醫(yī)科大學(xué)·山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 泰安271016）

礞石滾痰丸由金礞石（煅）、熟大黃、黃芩、沉香等中藥組方［1］，其中君藥大黃有效成分為大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚，臣藥黃芩有效成分為黃芩苷，金礞石為佐藥，沉香為使藥，全方具有祛痰降火功效，臨床多用于治療抑郁癥、單純性肥胖癥（胃濕熱阻證）、中風(fēng)等［2－3］。中藥材成分復(fù)雜，其質(zhì)量受多種因素影響，僅憑某一成分評(píng)價(jià)中藥材的質(zhì)量過于片面。一測(cè)多評(píng)法不僅可實(shí)現(xiàn)多成分的質(zhì)量控制，還能解決對(duì)照品價(jià)格昂貴的問題，廣泛用于多個(gè)成方制劑的質(zhì)量評(píng)價(jià)。通過選定合適的內(nèi)參物，根據(jù)成方制劑各種成分間存在的線性或比例關(guān)系，建立內(nèi)參物與其他成分間的相對(duì)校正因子［4－7］，僅需測(cè)定內(nèi)參物的含量，通過校正因子計(jì)算其他成分含量。本研究中建立了大黃素與大黃酚、大黃酸、黃芩苷、大黃素甲醚和蘆薈大黃素的相對(duì)校正因子（fs／i），通過外標(biāo)法測(cè)定大黃素的含量，根據(jù)大黃素與其他成分間的相對(duì)校正因子測(cè)定其他各成分含量，既可節(jié)省檢測(cè)成本，又可減少檢測(cè)時(shí)間，能較好地反映制劑質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司）；LC－20AD型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；KQ－500E型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FR224CN型電子天平（奧豪斯儀器上海有限公司，精度為萬分之一）；離心機(jī)（鹽城凱特實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；GM 0.33A型隔膜真空泵（天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

礞石滾痰丸（保定中藥制藥股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字Z13021937，批 號(hào) 分 別 為190405，200101，200305，200307，200408）；大 黃 素 甲 醚 對(duì) 照 品（批 號(hào) 為TA0421FA14，含量≥98%），蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)為T28D6F8264，含量≥97%），均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715－200514，含量≥98%），大黃素對(duì)照品（批號(hào)為110756－200110，含量≥98%），大黃酸對(duì)照品（批號(hào)為0757－200206，含量≥98%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；大黃酚對(duì)照品（天津西瑪科技有限公司，批號(hào)為09T18，含量≥98%）；甲醇為色譜純，磷酸為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo ODS Hypersil柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇（A）－0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～52 min時(shí)36.7%A→91.6%A，52～54 min時(shí)91.6%A→36.7%A，54～60 min時(shí)36.7%A）；流 速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液制備

分別取蘆薈大黃素、黃芩苷、大黃素甲醚、大黃酚、大黃素、大黃酸對(duì)照品各適量，精密稱定，加入甲醇超聲（功率為300 W，頻率為40 kHz，下同）溶解，制成質(zhì)量濃度分別為11.34，314.40，26.02，15.34，4.60，3.84 μg／mL的混合對(duì)照品溶液［8］。取樣品適量，研成粉末，過篩，精密稱取0.391 3 g，置50 mL棕色容量瓶中，甲醇定容，超聲處理40 min，放冷至室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，3 000 r／min離心5 min，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液［9］。按礞石滾痰丸處方和工藝分別制備缺黃芩和大黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液［10］。

2.3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下4種溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。理論板數(shù)以黃芩苷峰計(jì)為8 731，各成分與相鄰組分分離較好。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液各適量，制成系列混合對(duì)照品溶液［11］，各量取10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍。詳見表1。

精密度試驗(yàn)：取供試品溶液（批號(hào)為190405）適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果見表1，可見方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取取供試品溶液（批號(hào)為190405）適量，分別于室溫下放置0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見表1，可見，供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖1高效液相色譜圖1.baicalin 2.aloe－emodin 3.rhein 4.emodin 5.physcion 6.chrysophanolA.Mixed reference solution B.Test solution C.Negative reference solution without Scutellariae Radix D.Negative reference solution without Rhei Radix et RhizomaFig.1 HPLC chromatograms

表1 方法學(xué)考察結(jié)果Tab.1 Results of the methodological investigations

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為190405）適量，各6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果見表1，可見，方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)［12］：取已知含量的樣品（批號(hào)為190405）適量，共6份，分別加入一定濃度的對(duì)照品溶液，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2.4 fs／i的建立

2.4.1fs／i的耐用性評(píng)價(jià)

根據(jù)公式fs／i＝（cs×Ai）／（As×ci）計(jì)算一測(cè)多評(píng)的相對(duì)校正因子［13］。式中，As代表內(nèi)標(biāo)物大黃素峰面積，cs代表內(nèi)標(biāo)物大黃素質(zhì)量濃度，Ai代表其他組分峰面積，ci代表其他組分質(zhì)量濃度；以大黃素（d）為內(nèi)參物，計(jì)算其與黃芩苷（a）、蘆薈大黃素（b）、大黃酸（c）、大黃酚（e）和大黃素甲醚（f）的fs／i分別為0.263，1.478，0.111，2.010，0.340［14］。

高效液相色譜系統(tǒng)和色譜柱的影響：取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件［分別設(shè)置色譜系統(tǒng)為Waters e2695型、Shimadzu LC－20AD型高效液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Thermo ODS Hypersil柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Venusil MP C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Waters C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）］進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積并計(jì)算fs／i。結(jié)果各成分在不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱上的fs／i的RSD均小于7%［15］，表明不同色譜系統(tǒng)和不同色譜柱對(duì)各成分fs／i無顯著影響。詳見表2。

表2 不同色譜系統(tǒng)和色譜柱對(duì)fs／i的影響Tab.2 Effects of different chromatographic systems and columns on fs／i

進(jìn)樣量的影響：取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置進(jìn)樣量為8，9，10，11 μL）進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積，并計(jì)算fs／i。結(jié)果各成分fs／i的RSD均小于2%，表明不同進(jìn)樣量對(duì)各成分fs／i無顯著影響。詳見表3。

色譜柱柱溫的影響：取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置色譜柱柱溫為28，29，30℃），進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積，并計(jì)算fs／i。結(jié)果各成分fs／i的RSD均小于2%，表明不同色譜柱柱溫對(duì)各成分fs／i無顯著影響。詳見表3。

流動(dòng)相流速的影響：取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置流速為0.8，0.9，1.0，1.1 mL／min）進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積并計(jì)算fs／i。結(jié)果各成分fs／i的RSD均小于4%，表明流速對(duì)各成分fs／i無顯著影響。詳見表3。

流動(dòng)相組成比例的影響：取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件［分別設(shè)置不同流動(dòng)相組成比例（±0.5%甲醇比例）］進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積，并計(jì)算fs／i。結(jié)果各成分fs／i的RSD均小于7%［14］，表明流動(dòng)相組成比例的微小變化對(duì)各成分fs／i無顯著影響。詳見表3。

酸水比例流動(dòng)相的影響：取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置流動(dòng)相磷酸體積分?jǐn)?shù)為0.09%，0.10%，0.11%）進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分峰面積，并計(jì)算fs／i。結(jié)果各成分fs／i的RSD均小于2%，表明不同酸水比例流動(dòng)相對(duì)各成分fs／i無顯著影響。詳見表3。

檢測(cè)波長(zhǎng)的影響：取樣品適量，精密稱定，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件（分別設(shè)置檢測(cè)波長(zhǎng)為253，254，255 nm）進(jìn)樣測(cè)定，記錄各成分的峰面積，并計(jì)算fs／i。結(jié)果各成分fs／i的RSD均小于4%，表明檢測(cè)波長(zhǎng)的微小變化對(duì)各成分fs／i無顯著影響。詳見表3。

表3 fs／i耐用性評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.3 Results of the durability evaluation of fs／i

2.4.2 待測(cè)組分色譜峰定位

一測(cè)多評(píng)法多采用相對(duì)保留值（ts／i）或保留時(shí)間差（Δts／i）進(jìn)行定位?？疾煸诓煌V系統(tǒng)和色譜柱中各待測(cè)成分色譜峰與參照峰的保留時(shí)間差和相對(duì)保留值，結(jié)果見表4。通過比較，ts／i的RSD更小，對(duì)色譜峰定位更準(zhǔn)確，因此以相對(duì)保留值進(jìn)行色譜法定位［16］。

2.5 一測(cè)多評(píng)法與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果比較

分別取5批樣品各適量，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定各成分的峰面積。以大黃素為內(nèi)參物，計(jì)算大黃素與其他5種成分的fs／i，并以此計(jì)算各自的含量。再以外標(biāo)法計(jì)算6種成分的含量，并對(duì)比2種方法所得結(jié)果的差異。結(jié)果外標(biāo)法與一測(cè)多評(píng)法所得結(jié)果的RSD均小于5%，無顯著差異，表明一測(cè)多評(píng)法可用于礞石滾痰丸中多種成分含量的測(cè)定。詳見表5。

3 討論

礞石滾痰丸中主要有效成分為黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，其中大黃素對(duì)照品簡(jiǎn)單易得，性質(zhì)較穩(wěn)定，且保留時(shí)間居于中間位置，故以此為內(nèi)參物，進(jìn)而計(jì)算大黃素與黃芩苷、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚、大黃酸的fs／i。

本預(yù)試驗(yàn)中考察了不同比例的甲醇、乙腈、甲酸、冰醋酸、磷酸作流動(dòng)相對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響［12］，分析發(fā)現(xiàn)，乙腈洗脫能力高于甲醇，使得樣品峰中多個(gè)組分無法達(dá)到好的分離效果。通過比較不同酸的種類及比例之后，發(fā)現(xiàn)0.5%磷酸可使色譜峰峰形較好，分離效果較好，故最終選擇甲醇－0.5%磷酸水溶液作流動(dòng)相。

黃芩中黃芩苷在215.6，277.2，316.5 nm波長(zhǎng)處，大黃中大黃酚在226，257，286.7 nm波長(zhǎng)處，大黃素在216.8，253.4，291.5nm波長(zhǎng)處，大黃酸在228.6，258.2nm波長(zhǎng)處，大黃素甲醚在222.7，265.3，286.7 nm波長(zhǎng)處，蘆薈大黃素在225.0，255.8，286.7 nm波長(zhǎng)處，均有較大吸收。經(jīng)Waters e2695型HPLC系統(tǒng)紫外3D波長(zhǎng)掃描可得，在波長(zhǎng)為254 nm時(shí)，樣品中6個(gè)成分均具有較好的吸收，故選擇254 nm作為吸收波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究中通過外標(biāo)法與相對(duì)校正因子法同時(shí)測(cè)定礞石滾痰丸中6種成分的含量，2種方法的結(jié)果無顯著差異，證明一測(cè)多評(píng)法可用于礞石滾痰丸中多種成分含量的測(cè)定，本研究為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制訂提供了參考。