高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定馬尾連及硬水黃連提取物中4種生物堿類成分含量

卞艷晶

（山東省濟(jì)寧市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濟(jì)寧272025）

馬尾連又名馬尾黃連，出自《本草綱目拾遺》，為毛茛科植物金絲馬尾連、昭通唐松草、貝加爾唐松草、多葉唐松草、高原唐松草等的根及根莖，性寒，味苦，歸心、肝、大腸經(jīng)，具清熱燥濕、瀉火解毒之功效，主治濕熱瀉痢、黃疸、瘡瘍腫毒、目赤腫痛、感冒發(fā)熱、癌腫［1］263－268。硬水黃連為其近緣藥用植物，又名水黃連、黃腳雞等，為毛茛科植物短梗箭頭唐松草的根或全草?！栋俨葭R》載：“水黃連，打箭爐出者，形細(xì)長(zhǎng)，少硬刺，較重于他連，以皮肉帶青色者為佳。出小西天者，色黑有毛者佳，無(wú)毛光黃者次之?！逼湮犊唷⑿院?，歸肝、肺、大腸經(jīng)，具清熱解毒、利濕退黃、止痢之功效，常用于治療黃疸、痢疾、肺熱咳嗽、鼻疳等［1］274－275。兩種藥用資源均富含多種生物堿及黃酮苷類等成分［2－5］。目前，僅將小檗堿作為馬尾連的指標(biāo)性成分，硬水黃連則無(wú)相關(guān)質(zhì)量研究報(bào)道［6－7］。藥理學(xué)研究表明，唐松草屬植物中生物堿成分具有顯著抗腫瘤、抗血小板聚集、抗硅肺、抗病毒、抗菌等作用［8－10］。兩者性味、功效相同，但其歸經(jīng)及其他藥理作用有差異。本研究中提取純化制備馬尾連和硬水黃連提取物，建立了同時(shí)測(cè)定各提取物中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿及小檗堿含量的高效液相色譜法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20A型高效液相色譜儀（日本島津制作所株式會(huì)社）；RE2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；TopPette型微量移液器（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器＜北京＞有限公司）；PRM－1012X型超聲清洗機(jī)（寧波博爾超聲波設(shè)備有限公司，功率為720 W，頻率為25 kHz）；DZF6030型真空干燥機(jī)（上海丙林電子科技有限公司）；MS105／A型電子天平（梅特勒－托利多國(guó)際貿(mào)易＜上海＞有限公司，精度為0.01 mg）。

1.2 試藥

木蘭花堿對(duì)照品（展舒生物科技有限公司，批號(hào)為2141095，純度≥99%）；鹽酸藥根堿對(duì)照品（批號(hào)為110733－201609，純度≥89.5%），鹽酸黃連堿對(duì)照品（批號(hào)為112026－201802，純度≥94%），鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713－201814，純度≥86.7%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；馬尾連提取物（批號(hào)分別為20200924，20200930，20201009），硬水黃連提取物（批號(hào)分別為20201014，20201020，20201023），均為本實(shí)驗(yàn)室自制；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：ZorbaxEclipseXDB－C18柱（250mm×4.6mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸水溶液加0.3%十二烷基硫酸鈉（A）－乙腈（B），梯度洗脫（0～8 min時(shí)10%B→23%B，8～20 min時(shí)23%B→47%B，20～28 min時(shí)47%B～85%B，28～35 min時(shí)85%B→95%B）；流速：1 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：268 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 馬尾連和硬水黃連提取物制備

稱取干燥的馬尾連適量，粉碎，過20目篩，加12倍量純凈水回流提取1次，再加8倍量純凈水回流提取1次，合并提取液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.3，加乙醇醇沉至醇含量為50%，靜置24 h，離心，取上清液，濃縮至無(wú)醇味，采用001×7陽(yáng)離子樹脂進(jìn)行吸附，用0.5 mmol／L的氨水溶液進(jìn)行洗脫，收集氨水洗脫液，濃縮，濃縮液上201×4陰離子樹脂，純凈水洗脫，濃縮純凈水洗脫液，真空干燥，即得馬尾連提取物。硬水黃連提取物制備過程同馬尾連。

2.3 溶液制備

取木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿對(duì)照品各適量，精密稱定，置100 mL容量瓶中，加適量乙腈溶解并定容，制備得木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質(zhì)量濃度分別為86.30，227.80，152.60，179.50 mg／L的混合對(duì)照品溶液。取馬尾連及硬水黃連提取物各100 mg，精密稱定，置10mL容量瓶中，用純凈水超聲溶解，加乙腈定容，搖勻，過0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得相應(yīng)供試品溶液。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.3項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、2.2項(xiàng)下馬尾連和硬水黃連提取物供試品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿4種生物堿類成分的分離度均良好，表明方法專屬性良好。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖1.magnoflorine 2.jatrorrhizine 3.coptisine 4.berberineA.Mixed reference solution B.Test solution of Radix et Rhizoma Thalictri extract C.Test solution of Radix Thalictri Brveipis extractFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：精密吸取2.3項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加乙腈稀釋為含木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質(zhì)量濃度分別為2.157 5，4.315 0，8.630 0，21.575 0，43.150 0，86.300 0 mg／L，5.695 0，11.390 0，22.780 0，56.950 0，113.900 0，227.800 0 mg／L，3.815 0，7.630 0，15.260 0，38.150 0，76.300 0，152.600 0 mg／L，4.487 5，8.975 0，17.950 0，44.875 0，89.750 0，179.500 0 mg／L的系列對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（C，mg／L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表1。

表1 4種生物堿類成分線性關(guān)系考察、精密度、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the linear relation，precision and stability tests of four alkaloids（n＝6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取含木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、檗堿質(zhì)量濃度分別為8.63，22.78，15.26，17.95 mg／L的混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取馬尾連提取物供試品溶液，室溫下分別于0，2，5，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。取硬水黃連提取物供試品溶液，同法試驗(yàn)，結(jié)果表明，供試品溶液室溫下在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取馬尾連提取物（批號(hào)為20200924）和硬水黃連提取物（批號(hào)為20201014）100 mg，精密稱定，各6份，按2.3項(xiàng)下方法配制供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果見表2。

表2 馬尾連提取物和硬水黃連提取物中4種生物堿類成分重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of the repeatability tests of four alkaloids in the extract of Radix et Rhizoma Thalictri and Radix Thalictri Brveipis（n＝6）

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的馬尾連提取物（批號(hào)為20200924）50 mg，精密稱定，共6份，加適量純凈水，超聲處理使溶解，吸取木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質(zhì)量濃度分別為43.15，113.90，76.30，89.75 mg／L的混合對(duì)照品溶液1 mL，置10 mL容量瓶中，加乙腈定容。取已知含量的硬水黃連提取物（批號(hào)為20201014）50 mg，精密稱定，共6份，加適量純凈水，超聲處理使溶解，加入木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿質(zhì)量濃度分別為21.575，56.950，38.150，44.875 mg／L的混合對(duì)照品溶液2.5 mL，置10 mL容量瓶中，加乙腈定容。上述溶液均經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 馬尾連提取物和硬水黃連提取物中4種生物堿類成分加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery tests of four alkaloids in the extract of Radix et Rhizoma Thalictri and Radix Thalictri Brveipis（n＝6）

2.5 樣品含量測(cè)定

取3批馬尾連提取物（批號(hào)分別為20200924，20200930，20201009）和3批硬水黃連提取物（批號(hào)分別為20201014，20201020，20201023）各100 mg，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3次，計(jì)算馬尾連提取物和硬水黃連提取物中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿的含量。結(jié)果見表4。

表4 樣品中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿和小檗堿含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab.4 Content determination of magnoflorine，jatrorrhizine，coptisine and berberine in the samples（n＝3）

3 討論

木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿對(duì)照品分別經(jīng)紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果木蘭花堿在271 nm和314 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，藥根堿在265 nm和345 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，黃連堿在268 nm和341 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，小檗堿在264 nm和346 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，考慮到木蘭花堿在340 nm波長(zhǎng)附近無(wú)吸收，且在268 nm波長(zhǎng)處色譜峰的峰形及基線均良好，故選擇268 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

前期分別考察了甲醇－水、乙腈－水、乙腈－0.1%甲酸溶液、乙腈－0.1%醋酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸加0.2%十二烷基硫酸鈉溶液、乙腈－0.1%磷酸加0.3%十二烷基硫酸鈉溶液等不同流動(dòng)相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈－0.1%磷酸加0.3%十二烷基硫酸鈉溶液中色譜峰的基線平穩(wěn)、峰形及分離度均顯著好于其他體系，且色譜圖待測(cè)成分保留時(shí)間良好。故選擇乙腈－0.1磷酸加0.3%十二烷基硫酸鈉為流動(dòng)相。

選擇木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿4種生物堿類成分作為考察指標(biāo)，初步比較了本工藝條件下制備的馬尾連提取物和硬水黃連提取物中成分的含量差異。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，馬尾連提取物中4種成分含量由高至低為藥根堿、小檗堿、黃連堿、木蘭花堿；而硬水黃連中僅檢測(cè)到黃連堿和小檗堿，但其中的黃連堿和小檗堿含量均高于同工藝下制備的馬尾連提取物。黃連堿和小檗堿治療肺病（如肺損傷、肺癌、肺炎等）療效顯著［11－14］，可推測(cè)硬水黃連中黃連堿和小檗堿的含量高于馬尾連，可能是其歸肺經(jīng)的原因所在。

綜上所述，所建立的方法簡(jiǎn)便快捷，準(zhǔn)確度高，重復(fù)性和穩(wěn)定性均較好，可同時(shí)測(cè)定馬尾連及硬水黃連提取物中木蘭花堿、藥根堿、黃連堿、小檗堿的含量。由研究結(jié)果推測(cè)，可能正是這些成分的缺失及含量差異，導(dǎo)致兩者功效及藥理作用不同。后期將進(jìn)行更深入的分子學(xué)研究，以期獲得可靠性結(jié)論。