太歲中真菌菌群結(jié)構(gòu)及分離菌株的DNA驗(yàn)證

王朝江, 王世清, 高春燕, 李 慧, 夏偉偉

(河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,河北 石家莊 050051)

自1992年首例太歲在陜西省周至縣渭河被發(fā)現(xiàn)以來[1]，其分類屬性就成為科學(xué)熱點(diǎn)和社會(huì)關(guān)注點(diǎn).黃建新等[1]將首例太歲鑒定為“大型粘菌復(fù)合體”；但在2010年又進(jìn)行了自我否定[2]，原因是其后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)太歲主體物質(zhì)為聚乙烯醇，同時(shí)含有14.48%多糖，以及細(xì)菌、霉菌、酵母和粘菌，認(rèn)為化工產(chǎn)品與微生物及其代謝產(chǎn)物共存的矛盾，只有從生物代謝與合成的角度才能得到最佳解釋[2].2018年趙雅秋等[3]提出的“脫模物造假說”，無視太歲形態(tài)各異、外具褶皺、內(nèi)多有纖維狀紋理的特征，推定其為建筑膠遺留，但并未提供相應(yīng)發(fā)現(xiàn)地證據(jù)；2020年Li et al[4]提出的“古老有機(jī)物說”，一方面自陷合成聚乙烯醇原因不明的困惑，另一方面，出現(xiàn)了太歲所藏地層在4萬年前尚未形成的矛盾[5-6].另外，這2種假說也無法解釋太歲中細(xì)菌分布極不均衡的現(xiàn)象[7-8].因此，太歲生物成因的可能性仍然最大，有待進(jìn)一步探索.揭秘太歲屬性的關(guān)鍵是能否從太歲中分離到具有合成“聚乙烯醇”類物質(zhì)能力的菌種，這依賴于對(duì)太歲各類內(nèi)含菌的逐一排查.

太歲中存在真菌已被多次證實(shí)：首例太歲中分離到枝頂孢霉屬(Acremonium)、木霉屬(Trichoderma)、青霉屬(Penicillium)等種類[9]；其他太歲中分離到假絲酵母(Candidasp.)、粘質(zhì)紅酵母(Rhodotorulamucilaginosa)[10]、卵圓假散囊菌(Pseudeurotiumovale)[11]、白色側(cè)齒霉菌(Engyodontiumalbum)和埃及枝頂孢霉(Acremoniumegyptiacum)[4]等.然而，采用傳統(tǒng)培養(yǎng)方法分離菌類，容易受培養(yǎng)基、培養(yǎng)難易度等因素影響，難以獲得全部真菌，也無法知曉分離菌在整個(gè)菌群結(jié)構(gòu)中的地位，且操作污染的干擾常使人懷疑其源自太歲的真實(shí)性.高通量測序技術(shù)具有通量高、速度快、準(zhǔn)確度高以及運(yùn)行成本低等特點(diǎn)，能夠快速測知菌群結(jié)構(gòu)，但其正確性易受DNA提取方法影響[8].目前，只有Li et al[4]采用該技術(shù)研究了7個(gè)太歲中的真菌，獲知的優(yōu)勢屬為擬青霉屬(Paecilomyces)，同時(shí)分離到了腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)，但作者認(rèn)為其均是來自環(huán)境而非太歲.該研究用常規(guī)方法提取DNA，存在太歲組織未徹底破碎、所含大量多羥基類物質(zhì)未去除的問題，導(dǎo)致結(jié)果不可信[7].所以，有關(guān)太歲真菌菌群結(jié)構(gòu)仍有待研究.

鑒于此，本研究采用高通量測序技術(shù)分析太歲中真菌菌群結(jié)構(gòu)，并對(duì)分離菌進(jìn)行DNA驗(yàn)證，以期為太歲生物成因的揭秘提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試太歲 紅褐色、具尖圓柱體狀太歲，發(fā)現(xiàn)于河南省三門峽市黃河岸邊，浸水保存狀態(tài)下觸感如硬橡皮，內(nèi)部組織致密、褐至淺紅色，2007年底由作者收藏.

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基 十六烷基三甲基溴化銨(CTAB，天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純)，溶菌酶(北京索萊寶科技有限公司)，Transgen 2×Taq master Mix(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，DNA檢測試劑盒(Qubit 3.0，Life, America).真菌分離純化培養(yǎng)基為高氏1號(hào)培養(yǎng)基[12].

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 臺(tái)式離心機(jī)(H1850，湘儀)，電泳儀(DYY-6C型，北京六一)，PCR儀(T100，BIO-RAD)，Miseq高通量測序平臺(tái)(2×300，Illumina，美國)，光學(xué)顯微鏡(Nikon 80i，日本).

1.2 方法

1.2.1 取樣及DNA提取 用于提取DNA的外層(SFO)組織樣品取自沒有紅褐色分泌物質(zhì)和雜物黏附的部位，切取深度0.5 cm；內(nèi)層(SFI)組織樣品取自表皮下2～3 cm處.每層在2個(gè)位置取樣，分別編號(hào).每份樣品稱取0.2 g，切成厚度小于1 mm的碎屑.分離真菌從內(nèi)層組織取樣.取樣按無菌操作規(guī)程進(jìn)行.

用CTAB法[13]提取DNA.提取前增加了熱水溶解和0.22針頭濾膜(Milex，美國)過濾溶解液處理，用富集菌體的濾膜提取[8].提取時(shí)用玻璃杵研爛濾膜.分離真菌DNA用平皿純培養(yǎng)的菌絲體提取.

1.2.2 高通量測序及菌群分析 太歲樣品DNA的高通量測序由生工生物工程(上海)有限公司完成.測序前經(jīng)兩輪擴(kuò)增建庫：第1輪引物為融合有Illumina Miseq測序平臺(tái)的真菌rDNA引物ITS1F(CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA)和ITS2R(GCTGCGTTCTTCATCGATGC).PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s, 45 ℃ 20 s, 65 ℃ 30 s，5次循環(huán)；94 ℃ 20 s, 55 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s，20次循環(huán)；72 ℃ 5 min.第2輪擴(kuò)增引入Illumina橋式引物，產(chǎn)物經(jīng)Qubit3.0 DNA試劑盒定量后，等量混合測序.

測序得到原始序列后，以標(biāo)簽序列(barcode)區(qū)分不同樣品，經(jīng)Cutadapt軟件拼接、Prinseq[14]軟件質(zhì)控、Uchime軟件過濾嵌合體、Usearch[15]軟件去除非特異性擴(kuò)增序列后得到優(yōu)質(zhì)序列；優(yōu)質(zhì)序列以97%相似水平劃分OTU(operational taxonomic units).用RDP classifier算法[16]將OTU進(jìn)行門、綱、目、屬等水平的分類注釋.

用香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、Chao1指數(shù)評(píng)估樣品中真菌的α多樣性和相對(duì)豐度；用覆蓋率(coverage)指數(shù)評(píng)價(jià)測序數(shù)據(jù)量的真實(shí)合理性；用韋恩(Venn)圖軟件統(tǒng)計(jì)OTU在樣品中的分布情況.將樣品間共有、具高占比OTU支撐，且相對(duì)豐度高的菌群確定為優(yōu)勢菌群[8].

1.2.3 真菌分離及形態(tài)觀察 取樣切成碎屑，加水振蕩15 min，制成濃度為50 mg·mL-1的太歲組織浸提液；每皿涂0.1 mL，20～25 ℃暗室培養(yǎng)10 d.

選擇在不同皿上出現(xiàn)頻次多且非青霉、木霉等常見霉菌的菌落，尖端菌絲純化培養(yǎng).培養(yǎng)期間，每天觀察菌落生長狀況，記錄菌落顏色、形態(tài)變化.用插片法與載片法[17]培養(yǎng)菌絲，光學(xué)顯微鏡下觀察產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子形態(tài).

1.2.4 分離真菌的分子鑒定 采用真菌rDNA 18S通用引物NS1(GTAGTCATATGCTTGTCTC)、NS8(TCCGCAGGTTCACCTACGGA)和鐮刀菌屬rDNA ITS特異性引物Fu1(CCGAGTTTACAACTCCCAAA)、Fu2(TCCTCCGCTTATTGATATGC)進(jìn)行聯(lián)合分子鑒定.NS1、NS8擴(kuò)增條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min， 30次循環(huán)；72 ℃ 10 min.Fu1、Fu2擴(kuò)增條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，35次循環(huán)；72 ℃ 10 min.運(yùn)用NCBI中BLAST程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對(duì)擴(kuò)增序列進(jìn)行同源性檢索.在NS1、NS8擴(kuò)增序列比對(duì)結(jié)果中，選擇相似性≥99.30%的種序列，通過MEGA 7.0軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹[18]，步長值1 000；用Fu1、Fu2擴(kuò)增序列的比對(duì)結(jié)果對(duì)進(jìn)化分析結(jié)果做進(jìn)一步驗(yàn)證[19].

1.2.5 分離真菌來源的DNA驗(yàn)證 分離真菌的DNA用高通量測序引物(ITS1、ITS2)擴(kuò)增，擴(kuò)增序列經(jīng)NCBI同源性檢索后確定分類歸屬，再與高通量測序結(jié)果中同屬OTU的所有序列進(jìn)行多序列BLAST相似性比對(duì)，根據(jù)高相似性O(shè)TU出現(xiàn)及存在情況，判斷分離真菌是否源自太歲.

2 結(jié)果與分析

2.1 真菌多樣性

從表1中OTU數(shù)目可知，供試太歲中真菌種類豐富；各樣品的OTU數(shù)目及香農(nóng)指數(shù)、Chao1指數(shù)等與預(yù)測的趨勢一致，都表現(xiàn)為內(nèi)層高于外層，說明內(nèi)層的真菌多樣性高于外層.另外，4個(gè)樣品的覆蓋率均為0.99，說明測序數(shù)據(jù)量幾乎涵蓋了樣品所有物種，能夠代表樣品真實(shí)情況.

表1 4個(gè)樣品的測序數(shù)據(jù)及α多樣性指數(shù)1)Table 1 Sequencing data and α diversity index in 4 samples

2.2 樣品間OTU關(guān)聯(lián)性

從圖1可以看出：樣品間共有OTU僅40個(gè)，占各樣品總數(shù)的比例很少；這些共有OTU在SFO2、SFO3、SFI2和SFI3樣品中的相對(duì)豐度依次為66.68%、66.32%、41.01%和33.03%，樣品間變幅較大，整體上外層高于內(nèi)層.這說明太歲中OTU多數(shù)為非共有，且內(nèi)層中含有更多與其構(gòu)成無關(guān)的種類.

圖1 OTU(個(gè))在4個(gè)樣品中分布的韋恩圖Fig.1 Venn diagram of OTU distribution in 4 samples

2.3 真菌物種注釋與菌群結(jié)構(gòu)

從表2可以看出：各樣品中的真菌約有10個(gè)門、100個(gè)以上的屬；按相對(duì)豐度≥0.01%統(tǒng)計(jì)，目和屬水平上的數(shù)目減少明顯，特別是外層樣品.這說明太歲組織無論內(nèi)層還是外層，在真菌構(gòu)成上都是雜合體；外層有很多相對(duì)豐度在0.01%左右的類群存在.

表2 各樣品中按不同相對(duì)豐度(RA)水平統(tǒng)計(jì)的OTU分類數(shù)目Table 2 OTU classification of different samples based on relative abundance (RA)

門分類水平上，4個(gè)樣品中相對(duì)豐度≥0.01%的門共涉及 12個(gè)，其中6個(gè)為共有(含unclassified)，除SFO3外，各包含1或2個(gè)獨(dú)有門，占比最高的僅0.16%，說明不同樣品間菌群不完全相同.SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中相對(duì)豐度≥1%的門分別有3、3、5和4個(gè)，子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、未分類門(unclassified phylum)為共有門，占比之和依次為99.36%、99.41%、90.86%和93.08%.子囊菌門在各樣本中占比均超過70%，占絕對(duì)優(yōu)勢，與Li et al[4]的研究結(jié)果不同，其以未分類門為優(yōu)勢.

目分類水平上，4個(gè)樣品中相對(duì)豐度≥0.01%的目共涉及56個(gè)，其中25個(gè)為共有，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3分別獨(dú)有2、1、7和10個(gè)目.各樣品獨(dú)有目占比之和最高的為1.41%.SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中相對(duì)豐度≥1%的目分別有7、9、14和9個(gè)，刺盾炱目(Chaetothyriales)、散囊菌目(Eurotiales)、肉座菌目(Hypocreales)、酵母目(Saccharomycetales)、未分類目(unclassified order)為共有目，占比之和依次為77.60%、91.64%、69.23%和72.83%.刺盾炱目和肉座菌目在各樣品中占比均較高.

屬分類水平上，4個(gè)樣品中相對(duì)豐度≥0.01%的屬共涉及146個(gè)，其中32個(gè)為共有，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3分別獨(dú)有8、11、25和35個(gè)屬.SFO2和SFO3獨(dú)有屬占比之和均在0.23%以下，SFI2和SFI3各為2.97%和39.33%.相對(duì)豐度≥1%的優(yōu)勢屬共涉及27個(gè)，SFO2、SFO3、SFI2和SFI3中分別有11、14、17和15個(gè)(圖2).

圖2 各樣品中相對(duì)豐度大于1%的屬分布柱狀圖Fig.2 Genus composition of different samples with relative abundance over 1%

從圖2可以看出，柱狀圖基部的蟲草屬(Cordyceps)、鐮刀菌屬(Fusarium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、未分類屬(unclassified genus)、曲霉科未分類屬(unclassified Aspergillaceae)為共有屬，在SFO2、SFO3、SFI2、SFI3中占比依次為20.50%、30.07%、32.86%、21.19%.同時(shí)，共有屬不是各樣品中占比最高的屬，其占比之和均低于60%，不構(gòu)成絕對(duì)優(yōu)勢.占比最高的外瓶霉屬(Exophiala，45.33%)主要存在于外層樣品中，內(nèi)層樣品SFI2中未檢測到；占比次高的Anthopsis(22.11%)僅存在于內(nèi)層樣品中；占比第3的叢赤殼科未分類屬(unclassified Nectriaceae, 18.92%)存在于SFI3中，SFI2中未檢測到.這些結(jié)果均與太歲由真菌構(gòu)成的假定相背離，因缺乏一個(gè)占比高且在組織中普遍存在的屬.

2.4 共有屬和高占比屬內(nèi)的OTU分布情況

從表3可以看出，每個(gè)屬都包含多個(gè)OTU，表明存在不同的“種”.共有屬中的蟲草屬、踝節(jié)菌屬、曲霉科未分類屬在各樣品中均具有相同的最高豐度OTU，其占比與屬占比很接近，表明其構(gòu)成的主“種”相同，是真正的共有屬，但其在4個(gè)樣品中占比之和依次降為11.13%、11.53%、25.19%和16.14%；鐮刀菌屬在內(nèi)層樣品中具共有OTU，占比為屬占比的一半，外層無共有OTU，各自占比與屬占比接近，表明在不同的層次位置，該屬的“種”存在大的變化；未分類屬的最高豐度OTU占比與屬占比相差很大，表明該屬的優(yōu)勢由眾多低占比OTU累積而成，是假共有屬.其他非共有屬在各樣品中均有高占比的相同OTU，占比在不同樣品間存在較大變幅.

表3 相對(duì)豐度≥1%的共有屬和相對(duì)豐度最高值≥10%的非共有屬內(nèi)的OTU分布情況1)Table 3 OTU number and percentage of common genera with ≥1% relative abundance and uncommon genera with highest relative abundance being ≥10%

2.5 分離真菌的形態(tài)特征與分子鑒定

將分離真菌命名為SZB，其在PDA培養(yǎng)基上的菌落圓形、白色(圖3A、3B)，氣生菌絲薄絨狀，間有墨綠色素，隨傳代消失；可產(chǎn)生圓形厚垣孢子(圖3C)，形成菌絲環(huán)、菌絲巢，上附大量小孢子(圖3D、3E).典型鐮刀狀大型分生孢子少，有的呈馬特型，兩端較鈍，基胞有圓形足跟，具0～6個(gè)隔膜，大小為(28.2～40.6) μm×(5.8～7.2) μm；小型分生孢子多，長橢圓至卵形，有的具1個(gè)隔膜，大小為(9.6～14.7) μm×(4.3～5.3) μm，多假頭生于菌絲尖端和堆積于菌絲環(huán)、菌絲巢處(圖3F).

A、B.菌落正反面；C.大、小孢子與厚垣孢子；D、E.菌絲巢與小孢子；F.頭狀孢子堆.標(biāo)尺=50 μm.圖3 分離真菌菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及孢子形態(tài)Fig.3 Colony morphology, sporogenous structure and spore morphology of the isolated strain

用引物NS1、NS8擴(kuò)增SZB所得序列(SZBNS18)的GenBank登錄號(hào)為MN508437.1.經(jīng)BLAST比對(duì)獲得高相似性同源序列，以鐮刀菌屬同目(肉座菌目)不同科、屬的球孢蟲草(Cordycepsbassiana, AB079126)、Cordycepscateniobliqua(NG062658)作外群，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.圖4顯示：所有鐮刀菌屬聚為一大類，支持率100%；鐮刀菌屬以下基本按不同的種各聚為一類，SZB與腐皮鐮刀菌聚為一類，支持率為86%.

圖4 基于18S rDNA 基因構(gòu)建的分離菌和相似種系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree of isolates and similar species based on 18S rDNA sequence

用引物Fu1、Fu2擴(kuò)增SZB所得序列的GenBank登錄號(hào)為MT825571，長度506 bp.比對(duì)結(jié)果顯示，該序列與分離自杏鮑菇(Pleurotuseryngii)的一株腐皮鐮刀菌(登錄號(hào)：MK402158.1)序列的序列覆蓋率(query over)為99%，期望值(E-value)為0，相似性(per. ident)為99.01%.

綜合SZB的形態(tài)、系統(tǒng)發(fā)育樹和屬內(nèi)序列比對(duì)結(jié)果，將其鑒定為腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani).

2.6 分離真菌來源的檢驗(yàn)

用引物ITS1、ITS2擴(kuò)增SZB所得序列(SZBITS12)的GenBank登錄號(hào)為MN508438.經(jīng)比對(duì)，其與鐮刀菌屬未定種(Fusariumsp., LN809062.1)序列同源性最高.因此，SZBITS12可與高通量測序結(jié)果中鐮刀菌屬OTU進(jìn)行比對(duì).

從表4可以看出，SZBITS12序列與OTU802序列相似性為100%.OTU802存在于4個(gè)樣品中，在內(nèi)層樣品SFI2和SFI3中占比分別為0.08%和0.13%，在外層樣品SFO2和SFO3中占比分別為0.33%和13.88%.這表明分離菌SZB源自太歲，不是外源污染菌.

表4 SZB與同屬OTU同源性比對(duì)結(jié)果Table 4 Homology comparison of SZB and OTU from the same genus

3 討論

3.1 真菌非均勻分布提示存在生長與環(huán)境的互作

相對(duì)豐度≥0.01%的146個(gè)屬中，有114個(gè)為非共有屬；≥1%的5個(gè)共有屬經(jīng)OTU檢驗(yàn)后僅余3個(gè)；占比高的屬在樣品不同層間或同層次不同重復(fù)間跳躍性存在.這種分布不均衡特點(diǎn)表明太歲生長可能與環(huán)境菌群存在互作關(guān)系：太歲周邊環(huán)境菌群不均衡，造成同層樣品間的菌群存在差別；周邊環(huán)境菌群會(huì)被處于不同生長階段的太歲黏附和裹挾，菌群的變化導(dǎo)致不同層次間的菌群存在差別.這種互作導(dǎo)致了太歲真菌種類和豐度的多樣性.4個(gè)樣品中鐮刀菌屬的幾個(gè)主OTU，在相對(duì)豐度≥0.01%時(shí)都為共有，只是由于環(huán)境變化，未形成同一OTU的優(yōu)勢地位.

真菌分布不均衡特點(diǎn)進(jìn)一步印證了細(xì)菌不平衡存在的真實(shí)性[7-8].然而， “脫模物造假說”[3]和“古老有機(jī)物說”[4]均認(rèn)為太歲是一個(gè)化工產(chǎn)品構(gòu)成的靜態(tài)物體，前者認(rèn)為其中的菌類為加工用水?dāng)y帶，并未考慮脫模加工過程必有的攪拌操作會(huì)導(dǎo)致菌類及豐度分布的均勻化；后者則解釋其中的菌類為環(huán)境滲透，并未注意到菌體難以滲入結(jié)構(gòu)致密的化工膠體，即使?jié)B入，菌群將形成以聚乙烯醇分解菌為主、整體多樣性劇降的結(jié)構(gòu).這均與本研究中菌群多樣性外低內(nèi)高的結(jié)果不符.

3.2 真菌的土壤生境特點(diǎn)印證太歲出自土層

中國報(bào)道的蟲草屬有139個(gè)，其寄主包括昆蟲綱、蛛形綱和大團(tuán)囊菌屬(Elaphomycessp.)[20].昆蟲幼蟲如蛾幼蟲、金龜子幼蟲、蟬若蟲，成蟲如螻蛄、螞蟻，蛛形綱的穴居蜘蛛的生境都是土層；大團(tuán)囊菌更是典型的地下生態(tài)類群[21].這說明蟲草屬真菌廣泛存在于土層中.踝節(jié)菌屬、曲霉科未分類屬、叢赤殼科未分類屬真菌均是植物根際和土壤中常檢測到的優(yōu)勢類群[22-23]；Naganishia則是淡水濕地生態(tài)系統(tǒng)中酵母菌的優(yōu)勢屬[24]；鐮刀菌屬更是一類世界性分布的真菌，它可以在土壤中越冬、越夏[25-26].這些真菌以土壤為生境的構(gòu)成特點(diǎn)，印證太歲出自土層的結(jié)論[27]是正確的.

3.3 太歲中存在一些常規(guī)真菌屬于普遍現(xiàn)象

本研究通過DNA檢驗(yàn)的方法除證實(shí)了腐皮鐮刀菌的存在外，還檢測到了枝頂孢霉屬、木霉屬、青霉屬[9]、假絲酵母屬、紅酵母屬真菌[10]，且為4個(gè)樣品共有，相對(duì)豐度分別為1.40%、0.11%、0.21%、1.61%、1.92%；但未檢測到假散囊菌屬[11]、側(cè)齒霉菌、擬青霉屬[4].這說明太歲中存在常見真菌屬普遍現(xiàn)象，該現(xiàn)象可由太歲以1 m深土層為主的分布規(guī)律獲得解釋[22]；但真菌種類會(huì)因環(huán)境的影響而存在差別，這也證明太歲中真菌是由于保藏階段污染造成的結(jié)論[4]是錯(cuò)誤的.綜上所述，本研究認(rèn)為今后應(yīng)堅(jiān)持以生物成因?yàn)榉较驅(qū)μ珰q進(jìn)行揭秘.