稻飛虱傳播水稻病毒機(jī)制的研究進(jìn)展

賴?yán)? 王海峰, 徐鐘天, 崔 娜,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,福建 福州 350002;2.北京惠吉圣唯生物科技有限公司，北京 100071)

水稻是全世界最重要的糧食作物,但其產(chǎn)量深受病蟲(chóng)害影響.稻飛虱是水稻最主要的害蟲(chóng),其能夠消耗光合作用產(chǎn)物和傳播水稻病毒.在我國(guó),稻飛虱每年的發(fā)生面積達(dá)0.25億hm2,可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)25億kg[1].

在我國(guó)危害的稻飛虱主要有3種:灰飛虱(Laodelphaxstriatellus)、褐飛虱(Nilaparvatalugens)和白背飛虱(Sogatellafurcifera).灰飛虱對(duì)我國(guó)長(zhǎng)江流域以北的稻區(qū)危害最為嚴(yán)重,是水稻條紋病毒(Ricestripevirus, RSV)和水稻黑條矮縮病毒(Riceblack-streakeddwarfvirus, RBSDV)的傳播介體[2].RSV引起的條紋葉枯病最早于1963年發(fā)生在我國(guó)江蘇[3],截至 2000年,該病已在江蘇、浙江和河南等地大范圍擴(kuò)散[4-5];RBSDV于1963年在我國(guó)浙江省首次被發(fā)現(xiàn),之后主要在我國(guó)華北和華東水稻區(qū)發(fā)生,可導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10%～40%[6].20世紀(jì)50年代以后,褐飛虱開(kāi)始成為我國(guó)水稻上的主要害蟲(chóng)[7],2005年在我國(guó)長(zhǎng)江流域暴發(fā),引起水稻大面積倒伏[8].褐飛虱具有極強(qiáng)的季節(jié)性、遷飛性和繁殖能力,其大量暴發(fā)會(huì)導(dǎo)致稻株枯萎,產(chǎn)量劇降[9].其傳播的水稻齒葉矮縮病毒(Riceraggedstuntvirus, RRSV)最早于1976年在印度尼西亞和菲律賓被發(fā)現(xiàn)[10],目前該病害主要發(fā)生在我國(guó)的海南、福建、廣東、云南等地[11];褐飛虱傳播的水稻草矮病毒(Ricegrassystuntvirus, RGSV)于1963年在菲律賓首次被發(fā)現(xiàn)[12],隨后擴(kuò)散至東亞、南亞和東南亞的許多國(guó)家和地區(qū),造成了巨大的糧食損失和經(jīng)濟(jì)損失[13-14].白背飛虱主要危害我國(guó)南方稻區(qū)[15],是近年來(lái)我國(guó)發(fā)生嚴(yán)重的稻飛虱之一[16].白背飛虱傳播的南方水稻黑條矮縮病毒(Southernriceblack-streakeddwarfvirus, SRBSDV)于2001年首次在我國(guó)廣東省陽(yáng)江市被發(fā)現(xiàn),隨后向臨近的幾個(gè)省份擴(kuò)散,2010年該病的總發(fā)病面積約133萬(wàn)hm2[17-20].

水稻病毒病的大量暴發(fā)一部分是由本地蟲(chóng)源引起的,另一部分歸因于稻飛虱的長(zhǎng)距離遷移[21],了解稻飛虱及其傳播的水稻病毒的特性是防控水稻病害不可或缺的理論基礎(chǔ).本文綜述3種稻飛虱的基本特性及其介導(dǎo)的5種水稻病毒的基因功能和致病特征,重點(diǎn)介紹水稻病毒與稻飛虱的互作機(jī)制,總結(jié)病毒在稻飛虱體內(nèi)的傳播路徑和傳播障礙,為深入研究稻飛虱與植物病毒的互作提供參考.

1 灰飛虱傳播RSV和RBSDV的研究進(jìn)展

1.1 灰飛虱基本特征

灰飛虱屬于半翅目(Hemiptera)飛虱科(Dephacidae).灰飛虱的卵為橢圓形,上細(xì)下粗,長(zhǎng)約1 mm,初期為乳白色,后期逐漸變?yōu)闇\黃色;若蟲(chóng)分為5個(gè)齡期,體長(zhǎng)1～3 mm,體色呈乳白色至灰褐色,腹部各節(jié)為白色環(huán)圈[22].灰飛虱可以分為短翅型、中翅型和長(zhǎng)翅型,成蟲(chóng)長(zhǎng)翅型3.5～4.0 mm,短翅型2.3～2.5 mm(表1).灰飛虱不耐高溫,因此夏季不會(huì)造成種群暴發(fā),一般在8—9月,灰飛虱數(shù)量達(dá)到全年最多[23].

表1 3種飛虱的基本特征比較Table 1 Comparison of the basic characteristics of the 3 planthoppers

1.2 灰飛虱傳播RSV

1.2.1 RSV基因功能及致病癥狀 RSV引起的水稻條紋葉枯病對(duì)水稻的生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失[25].水稻感染RSV后主要表現(xiàn)兩種癥狀:一種是展葉型,該癥狀典型特征是從心葉基部沿著葉脈呈現(xiàn)斷斷續(xù)續(xù)的黃白色或黃綠色的條形病斑,心葉不卷曲,保持展葉正常或基本正常;另一種是卷葉型,該癥狀的典型特征是水稻心葉褪綠,呈現(xiàn)弧圈狀下垂,發(fā)生后期心葉干枯而死[26-27].

RSV屬于白細(xì)病毒科(Phenuiviridae)纖細(xì)病毒屬(Tenuiviruses),為負(fù)義單鏈RNA病毒.在電鏡下,提純的RSV呈直徑為3 nm、長(zhǎng)為500～2 000 nm的分支狀粒體.RSV包括4種纖細(xì)絲狀體,也稱為核糖核蛋白(ribonucleo protein, RNP),外層由核衣殼蛋白包裹.RSV的基因組由4條單鏈RNA組成[28]:RNA1編碼依賴RNA的RNA聚合酶(RdRp);RNA2編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS2、NSvc2[29];RNA3編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS3和結(jié)構(gòu)蛋白NSvc3(CP);RNA4編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS4(SP)、NSvc4. NS2和NS3被證實(shí)為病毒基因的沉默抑制子[30-31];結(jié)構(gòu)蛋白NSvc3被稱為外殼蛋白,參與病毒粒子的構(gòu)成以及RSV在灰飛虱中的侵染、復(fù)制和傳遞[32-33];SP蛋白為病害特異蛋白,有研究表明,其表達(dá)量與RSV引起的病害程度有關(guān);NSvc4被鑒定為運(yùn)動(dòng)蛋白,參與RSV的運(yùn)動(dòng)[34];CP為致病相關(guān)蛋白,與SP共同參與RSV的致病過(guò)程[35].

1.2.2 灰飛虱與RSV的互作 RSV由灰飛虱以持久增殖型方式傳播,并經(jīng)卵傳播,后代帶毒率達(dá)75%～100%[36].灰飛虱的獲毒時(shí)間為10～15 min,并且在飼毒2 d后獲毒率達(dá)到最高(表2).RSV進(jìn)入灰飛虱體內(nèi)會(huì)與灰飛虱產(chǎn)生互作.

表2 3種飛虱的病毒傳播特性比較Table 2 Comparison of virus transmission characteristics among the 3 planthoppers

互作的直接證據(jù)主要體現(xiàn)為蛋白之間的互作.灰飛虱卵黃蛋白(vitellogenin, Vg)的表達(dá)對(duì)RSV在其體內(nèi)的運(yùn)輸以及越冬傳播發(fā)揮了重要的作用,RSV的RNPs可以與Vg結(jié)合進(jìn)入生殖細(xì)胞[33].Li et al[39]通過(guò)2-DE技術(shù)篩選了與RSV互作的5種灰飛虱蛋白,分別為RACK、GAPDH3、RPL5、RPL7a和RPL8;又通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two hybrid system, YTHs)和Far-western blotting技術(shù)發(fā)現(xiàn),RACK和GAPDH3與RSV核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, NCP)無(wú)相互作用,而3種核糖體蛋白R(shí)PL5、RPL7a和RPL8與RSV有特異性互作;在Dot-Immunobinding Assay (DIBA)中,這5種蛋白均能與RSV顆粒結(jié)合,并且RACK和GAPDH3可能參與病毒顆粒的上皮胞吞作用.還有研究發(fā)現(xiàn),灰飛虱的9種蛋白直接與RSV核衣殼蛋白PC3互作,共同參與病毒的移動(dòng)、復(fù)制和經(jīng)卵傳播,其中一種新型角質(zhì)層蛋白CPR1是RSV病媒傳播的關(guān)鍵蛋白,RNA干擾下調(diào)CPR1轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致血淋巴、唾液腺RSV濃度降低,使病毒傳播效率降低[40].灰飛虱26S蛋白酶體系在調(diào)節(jié)宿主對(duì)病原體的防御中起重要作用,通過(guò)酵母雙雜交(Y2H)分子試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),26S蛋白酶體的一個(gè)亞基RPN3可以與RSV的NS3蛋白互作,RSV通過(guò)劫持灰飛虱26S蛋白酶體,減弱宿主的防御反應(yīng)[41].RSV的CP蛋白能夠與灰飛虱糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白LsST6互作和共定位,當(dāng)LsST6表達(dá)降低時(shí),病毒滴度和傳播效率均顯著降低,但病毒復(fù)制不會(huì)受影響[42].灰飛虱的c-Jun N-terminal kinase (JNK)信號(hào)通路也能夠響應(yīng)植物病毒的感染,RSV可以提高灰飛虱腫瘤壞死因子-α水平,降低GPS2的水平,激活JNK信號(hào)通路,促進(jìn)RSV在灰飛虱中的復(fù)制,而JNK信號(hào)通路的抑制則會(huì)顯著降低病毒的產(chǎn)生[43].Chen et al[44]發(fā)現(xiàn),灰飛虱非結(jié)構(gòu)蛋白NS3與多酚氧化酶(prophenoloxidase, PPO)存在互作,NS3通過(guò)阻礙PPO蛋白水解抑制酚氧化酶(phenoloxidase, PO)活性,降低病毒在灰飛虱血淋巴中的穩(wěn)定性.

RSV與灰飛虱的互作間接體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄組和蛋白組等多組學(xué)測(cè)序結(jié)果上.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),RSV的侵染能夠增加灰飛虱中一種神經(jīng)酰胺酶LsnCer mRNA的表達(dá)與酶活性,其可能參與灰飛虱對(duì)環(huán)境的適應(yīng)過(guò)程[45];在帶毒灰飛虱消化道中,參與溶酶體、消化和解毒的基因被激活,而與DNA復(fù)制和修復(fù)相關(guān)的基因被抑制,在唾液腺中,MAPK、mTOR、Wnt和TGF-beta信號(hào)通路被抑制[46].但也有研究發(fā)現(xiàn),帶毒/不帶毒灰飛虱包括Imd通路在內(nèi)的眾多免疫通路保持不變[47].Liu et al[48]通過(guò)iTRAQ方法,分析有毒/無(wú)毒灰飛虱卵子的差異蛋白質(zhì)組學(xué)特征,發(fā)現(xiàn)RSV侵染后有147個(gè)差異蛋白,其中包含與減數(shù)分裂和有絲分裂有關(guān)的蛋白,可導(dǎo)致孵化率降低和發(fā)育遲緩.RSV感染還可改變灰飛虱中各種鞘酯酶的轉(zhuǎn)錄水平和鞘酯的含量[49].

1.3 灰飛虱傳播RBSDV

1.3.1 RBSDV基因功能及致病癥狀 RBSDV侵染水稻后病株表現(xiàn)的癥狀為植株矮縮、葉色暗綠、莖稈和葉背上有短條狀乳白色瘤狀凸起,瘤狀凸起在后期會(huì)呈現(xiàn)黑褐色,結(jié)實(shí)不良[50].

RBSDV屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)斐濟(jì)病毒屬(Fijivirus),病毒粒體為直徑70～80 nm的等軸二十面體,具有雙層衣殼,并且成熟的病毒粒體無(wú)包膜.外層衣殼有12個(gè)稱之為A-spike的凸起,由于外殼不穩(wěn)定的特性,脫落后形成表面有12個(gè)B-spike凸起的亞病毒粒體.RBSDV的基因組含有10條雙鏈RNA,根據(jù)基因組片段大小命名為S1～S10[51],共編碼13種蛋白,包括6種結(jié)構(gòu)蛋白(P1、P2、P3、P4、P8、P10)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(P5-1、P5-2、P6、P7-1、P7-2、P9-1、P9-2).P6具有沉默抑制子功能[52],能夠自身互作且在植物細(xì)胞中形成點(diǎn)狀的類病毒原質(zhì)結(jié)構(gòu),推測(cè)其為病毒原質(zhì)的組分之一[53];P9-1是病毒原質(zhì)的主要成分,參與病毒復(fù)制和子代病毒粒體裝配[54];P7-2具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能,可用于改善桿狀病毒的殺蟲(chóng)效果和構(gòu)建重組桿狀病毒[55];對(duì)于P7-1蛋白,早前有研究表明其在擬南芥中過(guò)量表達(dá)后,花藥不能開(kāi)裂進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株不能結(jié)實(shí),但在水稻中并未發(fā)現(xiàn)P7-1基因過(guò)量表達(dá)造成不能結(jié)實(shí)的現(xiàn)象,通過(guò)免疫電鏡觀察到P7-1蛋白抗體標(biāo)記在包裹病毒粒子的管狀結(jié)構(gòu)上[56-57].

1.3.2 灰飛虱與RBSDV的互作 RBSDV由灰飛虱以持久增殖型方式傳播,但不經(jīng)卵傳播[58].灰飛虱由吸食植物韌皮部汁液獲毒,最短獲毒時(shí)間為1 h;灰飛虱的傳毒與溫度有關(guān),4～5 ℃不能傳毒,12～14 ℃開(kāi)始傳毒,并且最短傳毒時(shí)間為1 min[37](表2).

灰飛虱與RBSDV互作的研究主要集中在RNA和蛋白兩個(gè)方面.Li et al[59]通過(guò)深度siRNA測(cè)序發(fā)現(xiàn),相比于RSV,RBSDV能夠引起灰飛虱體內(nèi)更多的siRNA累積,暗示RBSDV可能會(huì)激活灰飛虱RNAi免疫通路;RBSDV的感染也能夠上調(diào)灰飛虱miRNA的表達(dá)[60].Y2H在RBSDV與灰飛虱的互作研究中被廣泛使用:徐秋芳等[61]將RBSDV的外殼蛋白P10作為Y2H的誘餌,從灰飛虱cDNA文庫(kù)中篩選到326個(gè)陽(yáng)性克隆,共編碼14種互作蛋白,包括Actin1、TWDL1、GAPDH和RACK等,這些互作蛋白與病毒在灰飛虱體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)有關(guān),參與病毒的胞吞胞吐作用以及膜融合和膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程;陳晴晴[62]利用病毒覆蓋的方法排除Y2H引起的假陽(yáng)性,發(fā)現(xiàn)Actin、RACK、GAPDH3和HIPVCP3能與RBSDV粒體互作;另外,Lu et al[63]將RBSDV P10蛋白作為Y2H誘餌,篩選灰飛虱DNA文庫(kù),獲得5個(gè)與P10互作的蛋白,分別為RACK1、CPT3、PLOD、prefoldin subunit 2-like protein和paxillin-like isoform 2,又通過(guò)Co-IP和體外試驗(yàn)GST pull-down發(fā)現(xiàn),RBSDV P10能夠與灰飛虱活化蛋白激酶C1受體互作,從而抑制灰飛虱蛋白激酶C的活性,促進(jìn)病毒的復(fù)制增殖.

2 褐飛虱傳播RRSV和RGSV的研究進(jìn)展

2.1 褐飛虱基本特征

褐飛虱屬于半翅目飛虱科,為不完全變態(tài)昆蟲(chóng).卵期6～7 d,卵長(zhǎng)約1 mm;若蟲(chóng)期12～18 d,有5個(gè)齡期,體長(zhǎng)1.1～2.7 mm;成蟲(chóng)體長(zhǎng)為3～5 mm,體色呈褐色并逐漸變深,雌蟲(chóng)比雄蟲(chóng)體型更大,顏色更淺,在后足第一跗節(jié)外側(cè)上有小刺[24](表1).

2.2 褐飛虱傳播RRSV

2.2.1 RRSV基因功能及致病癥狀 RRSV侵染水稻后病株表現(xiàn)的癥狀為植株矮小,葉緣缺刻呈鋸齒狀,葉尖卷曲,水稻分蘗前期發(fā)病會(huì)導(dǎo)致無(wú)法正常分蘗,分蘗后期發(fā)病會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)緩慢[64].

RRSV屬于呼腸孤病毒科水稻病毒屬(Oryzavirus),其病毒粒體具有雙層衣殼且呈球狀[65],直徑為75～80 nm,核心顆粒約為50 nm.外層衣殼上有A型刺突,A型凸起寬10～12 nm,長(zhǎng)約8 nm,內(nèi)層衣殼表面有B型凸起,二者相互連接[66].RRSV的基因組含有10條雙鏈RNA[67],至少編碼7種結(jié)構(gòu)蛋白(P1、P2、P3、P4、P5、P8、P9)和3種非結(jié)構(gòu)蛋白(Pns6、Pns7、Pns10)[68].呼腸孤病毒的增殖是在病毒原質(zhì)中進(jìn)行的,Pns6和Pns10是構(gòu)成RRSV病毒原質(zhì)的主要成分.在RRSV中,病毒原質(zhì)是新合成的病毒RNA和子代單層核心粒子聚集在一起的球狀結(jié)構(gòu),完整的雙層病毒粒子聚集在它們的外圍[69].Pns6具有多種生物學(xué)功能,如結(jié)合核酸[70]、協(xié)助病毒在寄主中傳輸以及沉默抑制子[71].通過(guò)免疫熒光標(biāo)記的方法發(fā)現(xiàn)，Pns10抗體隨著RRSV侵入天數(shù)的延長(zhǎng)分別定位在載體上皮細(xì)胞、中腸表皮肌肉細(xì)胞,最終定位在唾液腺中形成的病毒原質(zhì)中,表明RRSV編碼的Pns10是病毒原質(zhì)基質(zhì)的組分[72].

2.2.2 褐飛虱與RRSV的互作 RRSV由褐飛虱以持久增殖型方式傳播,但不能經(jīng)卵傳播.最短獲毒時(shí)間為30 min,帶毒率約為40%;最短傳毒時(shí)間為30 min,傳毒率約為40%(表2);病毒在褐飛虱體內(nèi)的平均循回期為10 d[11].

褐飛虱與RRSV互作的研究主要集中在RNA和蛋白兩個(gè)層面.RRSV侵染褐飛虱細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)RNAi途徑抗病毒相關(guān)基因Ago1、Ago2、Ago3、Dicer1、Dicer2等表達(dá)量上調(diào),通過(guò)免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),siRNA途徑中Dicer2和Ago2基因的表達(dá),能夠促進(jìn)RRSV在介體細(xì)胞中侵染[73].劉成穩(wěn)[74]利用酵母雙雜交技術(shù)構(gòu)建褐飛虱全蟲(chóng)的酵母文庫(kù),并從中篩選出與Pns10互作的ML(MD-2-related lipid-recognition)、SAM50、Calpain-7-like等11個(gè)介體蛋白;通過(guò)pull-down和RNAi技術(shù)驗(yàn)證了Pns10與ML蛋白的互作,并猜想ML通過(guò)調(diào)控昆蟲(chóng)TOLL免疫通路影響病毒的復(fù)制增殖.Huang et al[75]利用酵母雙雜交技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10與寄主寡霉素敏感相關(guān)蛋白(oligomycin-sensitivity conferral protein,OSCP)存在相互作用,并通過(guò)GST融合蛋白沉降技術(shù)對(duì)該結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證;同時(shí),通過(guò)RNAi技術(shù)抑制OSCP基因表達(dá),顯著降低了受RRSV侵染褐飛虱中的RRSV含量.

2.3 褐飛虱傳播RGSV

2.3.1 RGSV基因功能及致病癥狀 RGSV侵染水稻后病株表現(xiàn)的癥狀為葉片變黃變窄且有許多形狀不規(guī)則的褐色銹斑,植株生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,分蘗數(shù)明顯增多[76].

RGSV是白細(xì)病毒科纖細(xì)病毒屬成員,在電鏡下,提純的RGSV病毒粒體是直徑為6～8 nm的線狀或長(zhǎng)分絲狀粒體[77].RGSV基因組由6條RNA片段組成,分別命名為RNA1～RNA6,共編碼12個(gè)開(kāi)放閱讀框,均采用雙義編碼方式[78].RGSV的RNA1、RNA2、RNA5和RNA6與同屬的RSV的RNA1、RNA2、RNA3和RNA4相似.目前,只有少數(shù)蛋白質(zhì)的功能被確定[78]:由viral complementary RNA1(vcRNA1)編碼的pc1蛋白被認(rèn)為是RNA依賴的RNA聚合酶[79];分別由viral RNA5(vRNA5)和vRNA2編碼的P2和P5蛋白被鑒定為RNA沉默的RGSV抑制因子[80-81];由vcRNA5編碼的pc5蛋白是核衣殼蛋白[82];由vcRNA6編碼的pc6蛋白在病毒胞間運(yùn)動(dòng)過(guò)程中發(fā)揮作用[83].

2.3.2 褐飛虱與RGSV的互作 目前還未見(jiàn)褐飛虱與RGSV體內(nèi)互作的相關(guān)報(bào)道.Chomchan et al[84]發(fā)現(xiàn),在RGSV感染的水稻葉片上生長(zhǎng)的褐飛虱若蟲(chóng)中,只有20%的昆蟲(chóng)攜帶N蛋白(nucleocapsid protein)，并且從其中檢查到了大量的P5蛋白,推測(cè)P5可能在植物和昆蟲(chóng)宿主的病毒感染中發(fā)揮重要的作用 .孫付森[85]從病毒-介體昆蟲(chóng)-寄主植物三者互作的角度進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),水稻受RGSV侵染后釋放的揮發(fā)物會(huì)影響褐飛虱的選擇行為反應(yīng),如半蔽稀類物質(zhì)柏木烯對(duì)褐飛虱有趨避作用,然而其衍生物倍半萌醇雪松醇卻對(duì)褐飛虱具有明顯的引誘作用.

3 白背飛虱傳播SRBSDV的研究進(jìn)展

3.1 白背飛虱基本特征

白背飛虱屬于半翅目飛虱科,為不完全變態(tài)昆蟲(chóng).成蟲(chóng)分為長(zhǎng)翅型和短翅型兩種:長(zhǎng)翅型體長(zhǎng)為4～5 mm,呈灰黃色,頭頂略狹窄;短翅型雌蟲(chóng)體長(zhǎng)約為4 mm,呈灰黃色至淡黃色.白背飛虱完成一個(gè)世代周期的時(shí)間受溫度、地理位置等因素的影響,平均世代周期為30 d[15-16](表1).

3.2 白背飛虱傳播SRBSDV

3.2.1 SRBSDV基因功能及致病癥狀 水稻在各生育期均可感染SRBSDV.SRBSDV在秧苗期和本田初期侵染水稻會(huì)導(dǎo)致植株矮縮,受害嚴(yán)重者甚至?xí)缈菟劳?水稻分蘗期和拔節(jié)期被侵染后無(wú)明顯矮縮現(xiàn)象,抽穗少且小,實(shí)粒少且輕.發(fā)病植株葉色濃綠,莖稈有白色瘤狀凸起,根系不發(fā)達(dá),須根少而短[86].

SRBSDV屬呼腸孤病毒科斐濟(jì)病毒屬,其病毒粒體是直徑為75～80 nm的正二十面體,具有雙層衣殼,無(wú)包膜,且比大多數(shù)植物病毒的個(gè)體要大[87].SRBSDV的基因組由10條雙鏈RNA組成,Wang et al[88]成功測(cè)定出SRBSDV的全基因組序列,發(fā)現(xiàn)SRBSDV與RBSDV基因組序列同源性高達(dá)60%～85%;SRBSDV共編碼13種蛋白,包括6種結(jié)構(gòu)蛋白(P1、P2、P3、P4、P8、P10)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(P5-1、P5-2、P6、P7-1、P7-2、P9-1、P9-2).結(jié)構(gòu)蛋白P1為病毒RNA依賴的RNA聚合酶;P2為病毒內(nèi)核的組分;P3為帽子酶;P4為病毒外殼的B刺突蛋白[89-91；非結(jié)構(gòu)蛋白P5-1是病毒原質(zhì)的組分,呈絲狀結(jié)構(gòu)分布,參與病毒粒體的復(fù)制與裝配;P6會(huì)與P5-1發(fā)生互作,具有沉默抑制子功能,有研究表明P6蛋白可以通過(guò)免疫膠體金技術(shù)在病毒原質(zhì)中,因此推測(cè)其參與病毒原質(zhì)的形成[92];P7-1可以在非寄主細(xì)胞內(nèi)獨(dú)立裝配形成小管結(jié)構(gòu),并參與病毒的擴(kuò)散[93];P9-1是病毒原質(zhì)的組分,與病毒的復(fù)制有關(guān)[94].

3.2.2 白背飛虱與SRBSDV的互作 SRBSDV是由白背飛虱以持久增殖型方式傳播的,成蟲(chóng)和若蟲(chóng)均能高效傳毒,但該病毒不能經(jīng)卵傳播.白背飛虱隨著齡期的增長(zhǎng),最短獲毒時(shí)間逐漸降低:初孵若蟲(chóng)為11～19 min,3齡若蟲(chóng)為6～12 min,5齡若蟲(chóng)為3～9 min,成蟲(chóng)為2～8 min[38].長(zhǎng)翅型成蟲(chóng)獲毒時(shí)間為5～12 min,短翅型成蟲(chóng)為6～12 min[95](表2).SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的循回期為6～14 d[96].

SRBSDV侵染白背飛虱會(huì)改變其取食行為,帶有SRBSDV的白背飛虱刺探韌皮部的頻率和時(shí)間都會(huì)增加[97-98];SRBSDV也會(huì)影響白背飛虱的發(fā)育與繁殖,還可能影響飛虱壽命[99];與未攜帶SRBSDV的白背飛虱相比,攜帶SRBSDV的白背飛虱分泌的蜜露中糖濃度更高[100].蘭漢紅等[101]以白背飛虱培養(yǎng)細(xì)胞為研究對(duì)象,干擾其RNAi途徑中的Dicer2和Ago2基因的表達(dá),提高了SRBSDV的侵染率和積累量,同時(shí)造成攜毒飛虱存活率下降.SRBSDV在介體內(nèi)傳播依賴小管結(jié)構(gòu),而小管結(jié)構(gòu)的形成依賴SRBSDV編碼的P7-1,小管能與白背飛虱細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白纖維互作,形成病毒在細(xì)胞間傳播的橋梁[102];P7-1蛋白還能與白背飛虱的神經(jīng)質(zhì)蛋白、肌球蛋白輕鏈、核糖體結(jié)合蛋白、E3泛素-蛋白連接酶、多聚泛素和前纖維蛋白發(fā)生互作,參與病毒在介體內(nèi)的運(yùn)動(dòng)和克服傳播障礙[103].Than[104]采用酵母雙雜交技術(shù),結(jié)合pull-down技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)與白背飛虱外殼蛋白P10互作的3種蛋白,即VAMP7、Vtila和Ghitm,三者共同參與病毒在介體中的傳播;再利用RT-qPCR對(duì)3種互作蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的分析,發(fā)現(xiàn)VAMP7與Ghitm在雄飛虱中表達(dá)更加豐富,而Vtila在雌飛虱中表達(dá)更顯著.馬思琦[105]采用同樣的技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)與SRBSDV P5-1互作的2個(gè)蛋白——核糖蛋白和烯醇酶.安興奎[106]對(duì)感染SRBSDV的白背飛虱的唾液腺轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)89個(gè)基因的表達(dá)水平發(fā)生了改變,如卵黃蛋白原下調(diào),而氣味結(jié)合蛋白則上調(diào).以中腸cDNA文庫(kù)為篩選對(duì)象,在酵母Y2HGold細(xì)胞內(nèi)獲得5個(gè)可能與P6蛋白互作的介體蛋白,分別為BRD、SUCLSB、RPSA、TOLIP和STAM1,主要參與基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯及翻譯后的修飾和蛋白質(zhì)合成的過(guò)程[107].

4 病毒在稻飛虱體內(nèi)的侵染途徑及屏障

中腸、唾液腺和卵巢是病毒在稻飛虱體內(nèi)的3個(gè)主要傳輸屏障(圖1).飛虱的腸道被內(nèi)臟肌肉纖維包圍,由一層上皮細(xì)胞組成,腸腔內(nèi)側(cè)有微絨毛,外側(cè)有基底層.上皮細(xì)胞是通過(guò)細(xì)胞間連接復(fù)合物連接而成的,這可能是防止微生物傳染的物理屏障.病毒一旦被攝入,飛虱就會(huì)在腸道上皮細(xì)胞中形成原始感染,但是只有數(shù)量有限的上皮細(xì)胞含有病毒識(shí)別的受體,這些受體位于微絨毛膜供病毒粒子接觸.然而,即使在最初被感染的上皮細(xì)胞中,入侵的病毒也能夠形成病毒基質(zhì),成為病毒增殖的場(chǎng)所.子代病毒直接從最初感染的腸道上皮細(xì)胞基底層進(jìn)入內(nèi)臟肌肉或穿過(guò)細(xì)胞間連接復(fù)合物進(jìn)行細(xì)胞間的病毒傳播.隨后,病毒從內(nèi)臟肌肉傳播到血淋巴,最后進(jìn)入唾液腺水平傳輸給健康植物或進(jìn)入雌性卵巢垂直傳播給后代.

藍(lán)色箭頭表示病毒感染的路線. 病毒經(jīng)稻飛虱從病株中攝取后,最初感染腸道上皮細(xì)胞,后穿過(guò)基底層進(jìn)入中腸內(nèi)臟肌肉,再?gòu)膬?nèi)臟細(xì)胞傳輸?shù)窖馨?然后進(jìn)入唾液腺或雌蟲(chóng)的卵巢.水稻病毒在稻飛虱中的傳播障礙有中腸、唾液腺、卵巢.圖片修改自參考文獻(xiàn)[108].圖1 病毒在稻飛虱體內(nèi)的感染途徑Fig.1 Pathway of virus infection in rice planthopper

4.1 中腸傳播

中腸作為病毒侵染的第一道障礙,一直被認(rèn)為是昆蟲(chóng)媒介傳播病毒能力的主要決定因素.然而,有關(guān)植物病毒在昆蟲(chóng)中腸持續(xù)感染的分子機(jī)制的研究甚少.有研究表明,持久增殖型病毒利用病毒包涵體促進(jìn)自身在昆蟲(chóng)中腸的傳播[109].水稻呼腸孤病毒利用由病毒非結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成的管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行傳播,如SRBSDV使用P7-1小管直接通過(guò)最初感染的腸道上皮細(xì)胞基底進(jìn)入環(huán)形肌肉細(xì)胞,最終進(jìn)入血淋巴.除了昆蟲(chóng)體內(nèi)的物理屏障之外,幾種抗病毒途徑也可調(diào)節(jié)植物病毒在昆蟲(chóng)載體中的持續(xù)傳播.siRNA的抗病毒途徑能夠響應(yīng)植物病毒在昆蟲(chóng)媒介中的傳播[110].siRNA抗病毒途徑已被證明可以有效地限制SRBSDV的積累.Wang et al[43]發(fā)現(xiàn)RSV的外殼蛋白可激活灰飛虱載體的 JNK通路以促進(jìn)其復(fù)制.病毒從內(nèi)臟肌肉細(xì)胞傳播到血淋巴后,表皮蛋白與RSV的外衣殼蛋白相互作用,防止昆蟲(chóng)免疫系統(tǒng)降解病毒顆粒[40].Lu et al[111]發(fā)現(xiàn),RSV非結(jié)構(gòu)糖蛋白NSvc2能夠幫助RSV克服中腸障礙,并且在缺少NSvc2的情況下,RSV不能進(jìn)入灰飛虱中腸.因此推斷在病毒克服中腸障礙的能力和昆蟲(chóng)媒介控制病毒傳播的能力之間存在一種亞穩(wěn)態(tài)平衡,從而使病毒在自然界中持久和高效率地傳播[112].

4.2 唾液腺傳播

昆蟲(chóng)唾液腺分為主腺和附腺.主腺被認(rèn)為在病毒的傳播中起著至關(guān)重要的作用[113-115].唾液腺細(xì)胞充滿有微絨毛的管道,這是病毒傳播的最后一層膜屏障[116].RRSV、RBSDV和SRBSDV 3種水稻呼腸孤病毒能夠誘導(dǎo)大量小管通過(guò)微絨毛進(jìn)入管腔,從而促進(jìn)病毒釋放進(jìn)入管腔,最終通過(guò)唾液從管腔流出.RSV是如何克服唾液腺障礙的,尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道.

4.3 卵巢傳播

一些病毒可通過(guò)母本垂直傳播給后代.但目前這種經(jīng)卵傳播的機(jī)制尚不清楚.病毒須通過(guò)濾泡細(xì)胞進(jìn)入卵母細(xì)胞才能成功傳播給后代,但研究表明,病毒本身無(wú)法進(jìn)入卵母細(xì)胞,只能依賴特定途徑進(jìn)入卵母細(xì)胞.例如:RSV通過(guò)外殼蛋白與昆蟲(chóng)卵黃蛋白(Vg)特異性相互作用,克服垂直傳播障礙[33];同屬水稻呼腸孤病毒屬的水稻矮縮病毒(Ricedwarfvirus, RDV)能附著在細(xì)菌共生體Sulcia的外膜上,形成內(nèi)陷或被膜包被的囊泡,進(jìn)入卵母細(xì)胞.這種病毒-細(xì)菌結(jié)合是由病毒外殼蛋白與Sulcia外膜蛋白的特異性相互作用介導(dǎo)的[117].有關(guān)RRSV、RBSDV及SRBSDV如何克服垂直傳播障礙,尚未見(jiàn)報(bào)道.微生物在自然界中普遍存在[118],病毒-細(xì)菌互作模式可能是一種常見(jiàn)現(xiàn)象,對(duì)今后研究其他幾種病毒垂直傳播機(jī)制提供了方向.

5 結(jié)論與展望

稻飛虱是一類重要的水稻病毒傳播介體,主要包括灰飛虱、褐飛虱和白背飛虱,其傳播的水稻病毒RSV、RBSDV、RRSV、RGSV和SRBSDV嚴(yán)重威脅著水稻的生產(chǎn).有關(guān)稻飛虱傳播水稻病毒機(jī)制的研究已取得一定進(jìn)展:病毒誘導(dǎo)的內(nèi)含物能夠克服水平傳播的障礙;卵黃蛋白原或共生菌能夠克服垂直傳播障礙;病毒和昆蟲(chóng)之間存在一種明顯的平衡,持久增殖型病毒的感染可以激活某些細(xì)胞調(diào)控途徑,如自噬、凋亡、siRNA抗病毒途徑或c-JunN末端激酶途徑,進(jìn)而調(diào)節(jié)飛虱傳播病毒的能力.

新技術(shù)的發(fā)展將提供更多的方法揭示媒介飛虱傳播病毒的分子機(jī)制.例如,3種稻飛虱全基因組的獲得,為飛虱基因的功能分析提供了資源.基于CRISPR/Cas9的基因編輯技術(shù)也已在飛虱中有所應(yīng)用,將為深入探究飛虱傳毒的相關(guān)基因功能提供有力工具.

病毒、昆蟲(chóng)、昆蟲(chóng)共生菌和植物之間的相互作用是未來(lái)研究的重要課題,這種更深層次的研究有利于設(shè)計(jì)新的病蟲(chóng)害控制策略,這個(gè)多重相互作用系統(tǒng)中的一些難題是今后值得探索的領(lǐng)域.例如:病毒如何調(diào)整稻飛虱對(duì)宿主植物的適應(yīng)度,以利于病毒在田間的傳播;病毒與稻飛虱共生菌是否存在協(xié)同關(guān)系;在病毒傳播過(guò)程中,稻飛虱共生菌的貢獻(xiàn)及其是否可以用來(lái)控制病毒.