依賴于JA信號的蛋白酶抑制劑介導(dǎo)番茄對斜紋夜蛾的抗性

王如夢, 杜逸菲, 高玢垣, 丁元鑫, 孫仲享,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，福建 福州 350002;2.中山大學(xué)有害生物控制與資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275)

番茄(Lycopersiconesculentum)是一種具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的雙子葉植物，屬于茄科，為一年生或多年生植物，原產(chǎn)于南美洲，現(xiàn)已成為世界上栽培最為廣泛的蔬果之一[1].番茄在整個(gè)生長發(fā)育階段易受到多種害蟲的嚴(yán)重危害，害蟲主要包括蚜蟲、粉虱、螨類、棉鈴蟲(Helicoverpaarmigera)、斜紋夜蛾(Spodopteralitura)等[1-2].其中，斜紋夜蛾屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，是分布于全世界的雜食性和暴發(fā)性農(nóng)業(yè)害蟲，目前已知宿主植物達(dá)90科290多種，主要為害番茄、辣椒、茄子、棉花、大豆、煙草等作物.斜紋夜蛾幼蟲取食量非常大，對番茄等植物有很強(qiáng)的適應(yīng)力，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了巨大的威脅[3-4].如何經(jīng)濟(jì)、有效、穩(wěn)定、持久地控制蟲害的發(fā)生以及減小對農(nóng)作物生態(tài)環(huán)境的不良影響已成為目前的研究熱點(diǎn).充分利用植物自身對害蟲的防御機(jī)制不僅可以防控害蟲，還可以實(shí)現(xiàn)農(nóng)藥減施與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的目標(biāo).

昆蟲侵害會誘導(dǎo)高等植物合成大量抗性相關(guān)的化學(xué)物質(zhì).系統(tǒng)素(systemin)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)被認(rèn)為是最可能的細(xì)胞間創(chuàng)傷信號.系統(tǒng)素是植物受到外界傷害時(shí)在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生的具有信號傳導(dǎo)功能的內(nèi)源多肽物質(zhì)[5].JA是一種廣泛存在于高等植物中的激素，起信號傳遞作用[6]，并被認(rèn)為是番茄在受侵害時(shí)誘導(dǎo)蛋白酶抑制劑(proteinase inhibitor, PI)分泌的主要因子[5].嫁接試驗(yàn)證明JA是植物系統(tǒng)性抗性反應(yīng)中的長距離介導(dǎo)因子[7].PI是一類低分子質(zhì)量的多肽或蛋白質(zhì)，其基因及其編碼區(qū)域較小，一般沒有內(nèi)含子，參與調(diào)節(jié)植物許多重要的生命活動，如植物對昆蟲的防衛(wèi)作用[8-9].Ryan[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)番茄植株受到昆蟲侵害后會合成大量PI等抗性相關(guān)物質(zhì)，并且PI不只是在受傷的葉片中被大量合成(局部反應(yīng))，未受傷的葉片也能合成(系統(tǒng)反應(yīng)).研究表明，系統(tǒng)素位于植物創(chuàng)傷信號的上游，是原初信號分子，通過激活十八碳烷酸途徑(octadecanoid pathway)促進(jìn)JA的合成，進(jìn)而激活PI等相關(guān)防御基因的表達(dá)[12].

然而，PI和JA在番茄抗蟲中的關(guān)系與功能尚不明確.因此，本試驗(yàn)以野生型番茄CM、系統(tǒng)素過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因品種35S∷PS(35S∷prosystemin)、JA合成缺陷突變體品種spr8 (suppressorofprosystemin-mediatedresponse8)為材料，研究PI和JA在番茄防御斜紋夜蛾中的功能與誘導(dǎo)效應(yīng)，以期為進(jìn)一步研究植物對害蟲的防御機(jī)制和植物毒素的合成調(diào)控原理，以及開發(fā)植物源殺蟲劑奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 番茄種植CM、spr8和35S∷PS的番茄種子均由李傳友教授(中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究中心，北京)提供.將試驗(yàn)所需番茄種子用10% H2O2消毒10 min，蒸餾水沖洗數(shù)次，后置于生物培養(yǎng)箱中催芽.待番茄種子發(fā)芽生長10 d 后，挑選大小一致的苗，置入花盆(h=12 cm，Φ=10 cm)中，沙子、大田土、花土比為1∶1∶1，在溫室(溫度22 ℃，66% RH，L∶D=16 h∶8 h)內(nèi)培育，每天定時(shí)澆約50 mL的自來水或Holand營養(yǎng)液，待其生長35～40 d供試.

1.1.2 斜紋夜蛾飼養(yǎng) 斜紋夜蛾敏感品系由中山大學(xué)昆蟲研究所提供，在福建農(nóng)林大學(xué)作物抗性與化學(xué)生態(tài)學(xué)研究所養(yǎng)蟲室用人工飼料培養(yǎng)[溫度(25±2) ℃，60% RH，L∶D=16 h∶8 h]多代.斜紋夜蛾人工飼料配方：組分A為黃豆粉100 g、麥胚80 g、酵母粉26 g、干酪素8 g、維生素C 8 g；組分B為氯化膽堿1 g、山梨酸2 g、膽固醇0.2 g、肌醇0.2 g；組分C為瓊脂26 g.斜紋夜蛾人工飼料配制步驟：稱取組分A至飼料盒中，加入500 mL超純水，室溫浸泡1 h；稱取組分B至小燒杯中，加入50 mL超純水，玻璃棒攪拌均勻；稱取組分C于另一燒杯中，加入400 mL超純水，浸泡1 h；將浸泡好的組分C于鍋中煮沸，其間用勺子快速攪動，防止粘鍋；往鍋中加入組分B，用50 mL超純水潤洗盛放組分B的容器，潤洗液也倒入鍋中，繼續(xù)煮沸；在通風(fēng)柜往鍋中加入2 mL甲醛，用勺子快速攪勻；待冷卻至60 ℃左右，往鍋中倒入浸泡好的組分A，用勺子快速攪勻，趁熱倒入飼料盒中.配制好的飼料于4 ℃冰箱保存.

1.2 方法

1.2.1 番茄材料對斜紋夜蛾生長影響的測定 通過測定斜紋夜蛾幼蟲在CM、35S∷PS和spr8植株上取食24 h后的體重增量明確不同基因型番茄材料對斜紋夜蛾的抗性.具體方法：挑選長勢一致的3種番茄材料各5盆，以一個(gè)側(cè)枝為一單位，選取生長發(fā)育和體重一致的5頭4齡斜紋夜蛾幼蟲，饑餓2 h后，接入側(cè)枝上的番茄葉片，每株番茄各接兩個(gè)側(cè)枝.24 h后取下番茄上的斜紋夜蛾，用精確度為萬分之一的天平稱重.

1.2.2 番茄葉片取樣 分別選擇6株生長周期一致的CM、35S∷PS和spr8植株，3株作為不接蟲的對照，3株作為接蟲的試驗(yàn)組.試驗(yàn)組每株番茄上隨機(jī)接入5頭4齡斜紋夜蛾幼蟲，蟲害處理24 h后，用剪刀對未被斜紋夜蛾取食的葉片進(jìn)行取樣，隨即將葉片樣品置于液氮中，并存貯于-80 ℃冰箱用于后續(xù)RNA提取和PI含量測定.

1.2.3 植物總RNA的提取 對被斜紋夜蛾取食24 h后的不同基因型番茄植株的葉片進(jìn)行液氮研磨，采用上海Promega公司的Eastep Super總RNA提取試劑盒 LS1040提取番茄葉片的總RNA，-80 ℃冰箱貯藏備用.

1.2.4 反轉(zhuǎn)錄 根據(jù)提取的RNA濃度，調(diào)整RNA用量，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海Promega公司.cDNA合成的PCR體系(20 μL)：GoScriptTM反應(yīng)緩沖液Oligo (dT) 2 μL，隨機(jī)引物2 μL，GoScriptTM酶混合物2 μL，RNA 2 μL，ddH2O 12 μL.將其充分混勻，在PCR儀上進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：40 ℃ 20 min；95 ℃ 5 min；4 ℃ 5 min.反應(yīng)結(jié)束后取出并置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析lapA1和pin2是番茄受蟲害誘導(dǎo)的防御基因，也是JA合成基因.本研究通過qRT-PCR技術(shù)研究3種基因型番茄材料被斜紋夜蛾取食前后防御基因lapA1和pin2相對表達(dá)量的變化.同時(shí)，JA可誘導(dǎo)受傷基因表達(dá)，從而增加PI的合成.為了驗(yàn)證3種基因型番茄材料的抗蟲性與番茄中PI含量的相關(guān)性，對斜紋夜蛾取食前后番茄PI合成基因PI-Ⅱ相對表達(dá)量的變化進(jìn)行測定.

參考已報(bào)道基因的序列設(shè)計(jì)特異引物對PI-Ⅱ、lapA1和pin2進(jìn)行qRT-PCR分析[13-14].以β-Actin作為內(nèi)參基因，基因擴(kuò)增引物見表1.采用上海Promega公司的M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成第一鏈，按照TOYOBO公司SYBR Green Real-time PCR Master Mix-Plus-的程序進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng).引物由鉑尚生物技術(shù)有限公司合成.

表1 RT-PCR所用的特異性引物Table 1 Specific primers for real-time PCR

PCR體系：cDNA(稀釋100倍) 4.6 μL，2×UltraSYBR Mixture (High ROX) 5.0 μL，目的基因上、下游引物(10 μmol·L-1) 0.4 μL，總體積為10 μL.

RT-PCR程序：95 ℃ 10 min ，95 ℃ 10 s ，退火60 ℃ 30 s ，72 ℃ 32 s ，40個(gè)循環(huán).融解曲線分析：95 ℃ 15 s ，60 ℃ 1 min ，95 ℃ 15 s ，60 ℃ 15 s.

1.2.6 PI含量的測定 分別取未受蟲害的番茄標(biāo)記為CM+CK、spr8+CK、35S∷PS+CK，取受蟲害的番茄標(biāo)記為CM+SL、spr8+SL、35S∷PS+SL.每組取相同部位葉片100 mg，通過以下方法測定PI含量.

(1)在液氮中將樣品凍結(jié)并研磨，加入0.3 mL提取緩沖液離心(12 000g, 4 ℃)20 min.將 0.1～0.2 mL上清液轉(zhuǎn)移到新管中，使用微量布拉德福檢測法[15]確定蛋白質(zhì)濃度.向上清液中添加1.0～1.2 mL冰冷飽和的硫酸銨，并在冰上靜置1 h(蛋白質(zhì)沉淀).12 000g、4 ℃離心10 min，去除下層清液，用50 μL 0.1 mol·L-1Tris緩沖液溶解蛋白質(zhì)顆粒，吹打混勻備用，再次確定蛋白質(zhì)濃度.

(2)取樣品溶液45 μL加入提前制備好并打孔的平板孔中，密封后水平放入4 ℃冰箱擴(kuò)散16～18 h.取出后用25 mL新制備的染色液進(jìn)行染色，37 ℃孵育55 min.

(3)將染色液倒入已染色的容器中，并用水沖洗凝膠.

(4)用尼康SMZ18型體視鏡進(jìn)行拍照.用ImageJ軟件測量PI抑制區(qū)域的直徑，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算PI活性.PI含量=PI活性/鮮樣質(zhì)量(100 mg).

1.2.7 PI對斜紋夜蛾的脅迫處理 準(zhǔn)確量取適量大豆胰蛋白酶抑制劑純品，溶解到1 mL雙蒸水中配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，加至60 ℃保存的人工飼料中，充分混勻，配制成含0.2 mg·g-1PI純品的飼料，對照為用1 mL雙蒸水混勻的飼料.

挑選生長發(fā)育和體重較一致的4齡斜紋夜蛾幼蟲，以3頭為一個(gè)單位記錄初始體重，以兩種飼料分別飼喂斜紋夜蛾，待其取食48 h后，統(tǒng)計(jì)斜紋夜蛾的體重增長率，每組試驗(yàn)設(shè)置10個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、整理作圖，多重比較采用Tukey法.用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)差異顯著性，差異顯著性水平為0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄材料對斜紋夜蛾生長的影響

由圖1可知，與取食CM相比，取食35S∷PS的斜紋夜蛾體重增量顯著減少，而取食spr8的斜紋夜蛾體重增量顯著增加.這說明35S∷PS對斜紋夜蛾的抗性顯著高于CM，推測系統(tǒng)素可能在番茄抗斜紋夜蛾中發(fā)揮重要作用；而spr8抗蟲性顯著低于CM，表明JA信號通路在番茄抵御斜紋夜蛾過程中是必需的.

柱上不同字母表示經(jīng)Tukey法檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著.圖1 斜紋夜蛾接入3種基因型番茄24 h后的體重增量Fig.1 Weight gain of S.litura after inoculating with 3 genotypes of tomato for 24 h

2.2 斜紋夜蛾取食對番茄葉片中抗性相關(guān)基因表達(dá)的影響

由圖2可知：3種基因型番茄材料被斜紋夜蛾取食前，lapA1和pin2基因相對表達(dá)量無顯著差異；而斜紋夜蛾取食后35S∷PS中l(wèi)apA1的相對表達(dá)量顯著高于CM；斜紋夜蛾取食后spr8的lapA1和pin2相對表達(dá)量顯著低于CM.CM和35S∷PS在被斜紋夜蛾取食后，lapA1和pin2相對表達(dá)量比被取食前顯著上升；而spr8在蟲害前后lapA1和pin2基因的表達(dá)量無顯著差異.以上結(jié)果表明JA對番茄抵御斜紋夜蛾起主導(dǎo)作用.

CK.未接種害蟲的處理；SL.接入斜紋夜蛾的處理.柱上不同字母表示經(jīng)Tukey法檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著.圖2 斜紋夜蛾取食對3種基因型番茄葉片防御反應(yīng)基因lapA1(A)和pin2(B)表達(dá)的影響Fig.2 Effects of S.litura feeding on expressions of defense-related genes lapA1(A) and pin2(B) in 3 genotypes of tomato leaves

2.3 斜紋夜蛾取食對番茄葉片中PI含量的影響

由圖3A可知：斜紋夜蛾取食前和取食后35S∷PS中的PI-Ⅱ相對表達(dá)量都高于CM；斜紋夜蛾取食前和取食后CM的PI-Ⅱ相對表達(dá)量都高于spr8，表明番茄PI-Ⅱ基因的表達(dá)依賴于JA信號途徑.CM和35S∷PS在被斜紋夜蛾取食后PI-Ⅱ相對表達(dá)量都比被取食前有所上升，說明蟲害可以誘導(dǎo)番茄PI合成基因的表達(dá)；而spr8受蟲害前后PI-Ⅱ相對表達(dá)量無顯著差異，說明JA對番茄調(diào)控PI合成基因的表達(dá)起主導(dǎo)作用.

由圖3B可知，CM和35S∷PS在被斜紋夜蛾取食后PI含量比被取食前上升，而spr8被斜紋夜蛾取食前后PI含量無顯著變化.斜紋夜蛾取食前和取食后，35S∷PS的PI含量在3種基因型番茄中均最高，而spr8的PI含量均最低.以上結(jié)果表明系統(tǒng)素可以促進(jìn)PI的表達(dá)，而且番茄PI的合成依賴于JA信號途徑.

CK.未接種害蟲的處理；SL.接入斜紋夜蛾的處理.柱上不同字母表示經(jīng)Tukey法檢驗(yàn)在0.05水平上差異顯著.圖3 斜紋夜蛾取食對3種基因型番茄葉片中PI-Ⅱ表達(dá)量(A)和PI含量(B)的影響Fig.3 Effects of S.litura feeding on PI-Ⅱ expression (A) and PI content (B) of 3 genotypes of tomato leaves

2.4 PI對斜紋夜蛾體重的影響

當(dāng)斜紋夜蛾取食含PI的飼料時(shí)，體重增長率從83.4%極顯著下降到53.3%(P<0.01)，說明飼料中添加PI可顯著抑制斜紋夜蛾的生長.

3 討論

多肽信號分子系統(tǒng)素和植物激素JA在番茄創(chuàng)傷信號中扮演著重要的角色[16].系統(tǒng)素和JA在同一信號途徑中協(xié)同作用激活了PI和其他防御相關(guān)基因的表達(dá)[17].已有研究表明，spr2突變體在JA合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面發(fā)生了缺陷[18]，不能合成JA.本研究中，35S∷PS對斜紋夜蛾的抗性最高；而spr8不能合成JA，故喪失了對蟲害的抗性.此外，斜紋夜蛾取食35S∷PS和CM后，JA合成基因lapA1和pin2的表達(dá)量顯著提高，而spr8中這兩種基因的表達(dá)量極低.可見，JA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在調(diào)控番茄植株對斜紋夜蛾的抗性中具有重要作用.

PI能抑制昆蟲腸道中的蛋白水解酶,降低昆蟲蛋白降解速率, 從而降低昆蟲的體重和生長速率.研究發(fā)現(xiàn)，JA缺失突變體def1番茄在受到機(jī)械損傷后PI-Ⅱ表達(dá)量下調(diào)，在噴施MeJA后恢復(fù)表達(dá)水平[19].含有0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))大豆胰蛋白酶抑制劑的人工飼料可顯著抑制斜紋夜蛾2或3齡幼蟲的增長[20].本研究也得到類似結(jié)果：被斜紋夜蛾取食后3種基因型的番茄PI含量都有所提高，但spr8中PI含量最低，35S∷PS最高.對PI-Ⅱ基因進(jìn)行qRT-PCR發(fā)現(xiàn)，spr8被斜紋夜蛾取食后PI-Ⅱ基因未被誘導(dǎo)表達(dá)；當(dāng)人工飼料中添加0.2 mg·g-1PI時(shí)可顯著抑制斜紋夜蛾4齡幼蟲的生長.這說明PI是番茄中真正抑制斜紋夜蛾生長的效應(yīng)因子.

植物能敏感覺察到昆蟲的攻擊并迅速啟動其防御信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，激活下游的基因合成抗蟲的防御蛋白(如PI)和次生代謝物質(zhì)(如萜類、生物堿等)，對害蟲產(chǎn)生化學(xué)防御[21-22].PI是一種有效的控害因子，其在植物保護(hù)中具有很大的控害潛力[23].本研究不但證實(shí)了PI對斜紋夜蛾的抗性依賴于JA信號途徑，還進(jìn)一步證明了外源添加微量PI對斜紋夜蛾的抑制效應(yīng)，進(jìn)一步明確了JA和PI在番茄防御斜紋夜蛾中的作用，為進(jìn)一步研究植物對害蟲的防御、植物毒素的合成調(diào)控以及開發(fā)植物源殺蟲劑奠定了基礎(chǔ).