載荷利福平和異煙肼的BCP人工骨在家兔體內(nèi)釋藥性能初步研究

李忠杰，劉飛飛，阮玉山，丁 凱，雷延發(fā)，和 英，李紹波*

（1. 大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院脊柱外科，云南大理 671000；2. 大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，云南大理671000；3. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

結(jié)核病由來已久，骨關(guān)節(jié)結(jié)核是常見的肺外結(jié)核。臨床對骨關(guān)節(jié)結(jié)核常用病灶清除術(shù)，但術(shù)后會遺留較大的結(jié)核性骨缺損〔1〕，需要植骨重建，如有一種既能起到結(jié)構(gòu)性支撐，又能緩慢釋放高濃度一線抗結(jié)核藥物的植骨材料，則對局部高效殺滅結(jié)核分枝桿菌十分有利，對于骨關(guān)節(jié)結(jié)核局部的穩(wěn)定性重建與快速治愈病灶具有重要意義。雙相磷酸鈣（bidirectional calcium phosphate, BCP）人工骨是由羥基磷灰石（HA）和β-磷酸三鈣（β-TCP）依照不同比例組合而成，具有生物兼容性、生物活性及骨傳導(dǎo)性等特質(zhì)，可提供骨組織生長架構(gòu)及引導(dǎo)新生骨組織生長。因此，本研究將制備吸附利福平和異煙肼的BCP人工骨，檢測BCP人工骨的載藥率，觀察其在家兔體內(nèi)的釋藥性能。

1 材料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備及實驗動物BCP人工骨（BCG01，2~3 mm，60% HA+40%β-TCP，臺灣微創(chuàng)醫(yī)療器械股份有限公司），利福平（RFP，上海羅恩試劑），異煙肼（INH，上海羅恩試劑），TU1901型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），成年雄性健康新西蘭大白兔24只（體質(zhì)量2.5~3.0 kg，普通級，大理大學(xué)動物實驗中心提供）。

1.2 制備吸附利福平和異煙肼的BCP人工骨避光條件下配制50 mg/mL異煙肼藥液（500 mg溶于10 mL去離子水），準(zhǔn)確稱量1 g BCP人工骨顆粒浸泡于異煙肼藥液中，超聲震蕩儀適度震蕩，以人工骨顆粒表面無氣泡逸出為宜，取出后冷凍干燥制得吸附異煙肼的BCP人工骨備用。避光條件下配制10 mg/mL利福平藥液（100 mg溶解于10 mL甲醇），將上述已干燥吸附異煙肼的BCP人工骨浸泡于利福平藥液中，同樣用超聲震蕩儀適度震蕩，取出在避光條件下待甲醇揮發(fā)后制得吸附異煙肼和利福平的BCP人工骨，輻照滅菌后低溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 吸附利福平和異煙肼的BCP人工骨載藥量的測定①紫外-可見分光光度計定量測定并繪制利福平在甲醇中的標(biāo)準(zhǔn)曲線。②用直接測定法測定載藥率：稱取100 mg載藥BCP人工骨浸入1.5 mL甲醇中，用勻漿機(jī)研碎，使利福平充分溶于甲醇后離心10 min（6 000 r/min）得到含利福平的上清液。稱取同等質(zhì)量的無藥BCP人工骨，通過與上述相同的處理過程，得到參比上清液，含利福平的上清液稀釋至合適濃度后用紫外-可見分光光度計測定波長為474 nm處的吸光度，載藥BCP人工骨樣品中利福平的濃度通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到。載藥率%（利福平）=［M（利福平質(zhì)量）/M（人工骨質(zhì)量）］×100%。異煙肼載藥率測定方法與利福平相同，測量波長調(diào)整為263 nm。按照“1.2”項下方法制備載藥BCP人工骨3份，并按“1.3”項方法測定載藥量，得到人工骨的平均載藥率。

1.4 制備家兔髂骨骨缺損模型與人工骨植入所有家兔術(shù)前均禁食禁水12 h，隨機(jī)分為兩組，空白組（BCP人工骨組）6只、實驗組18只（載荷利福平、異煙肼BCP人工骨組），用3%戊巴比妥鈉（1.3 mL/kg）靜脈麻醉，俯臥位固定，髂嵴手術(shù)區(qū)備皮，消毒鋪巾后作一長約2 cm切口，暴露髂骨，咬除15 mm×10 mm骨質(zhì)，建立髂骨骨缺損模型，空白組直接縫合，實驗組在骨缺損內(nèi)將分裝保存的載藥人工骨植入，將缺損周圍肌層嚴(yán)密縫合以固定人工骨。所有家兔術(shù)后均分籠飼養(yǎng)，自行攝食及飲水，常規(guī)換藥及拆線。

1.5 吸附利福平和異煙肼的BCP人工骨在體內(nèi)的藥物釋放行為

1.5.1 取材 在吸附利福平和異煙肼的BCP人工骨植入后的第1、3、7、14、28、56天分別將空白組1只和實驗組3只家兔麻醉，取下腔靜脈血置入檸檬酸鈉抗凝管，離心20 min（3 000 r/min）將血漿標(biāo)本于-80℃保存待測；同時按原手術(shù)切口進(jìn)入，取髂骨骨缺損部位及周圍約5 mm包括松質(zhì)骨、肌肉組織及植骨材料標(biāo)本于-80℃保存待測。

1.5.2 血漿樣品藥物濃度測定 繪制藥物在血漿中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用紫外-可見分光光度計分別測量263、474 nm處的吸光度值，計算載藥上清液中利福平及異煙肼的濃度，得到血漿中藥物濃度。

1.5.3 局部組織藥物濃度的測定 將取出的組織塊剪碎稱重取500 mg，加入1.5 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）勻漿后量取1mL，加入2mL甲醇使蛋白質(zhì)沉淀后離心20 min（6 000 r/min）保留上清液待測，以空白組為參比，采用紫外-可見分光光度計分別測量263、474 nm處的吸光度值并計算載藥上清液中利福平及異煙肼的濃度，得到局部組織藥物濃度。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析所有測量指標(biāo)均以表示，釆用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件，對同一時間點血漿藥物濃度和局部組織藥物濃度用Nemenyi法兩兩樣本之間進(jìn)行比較，P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吸附利福平和異煙肼的BCP人工骨的載藥率

2.1.1 利福平載藥率 利福平甲醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A= 0.037 1C+ 0.004 2，R2= 0.998 4，利福平在5.0~50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。3次制得的載藥BCP人工骨取樣100 mg，測得樣品中的藥物量分別為5.13、6.72、6.08 mg；計算其利福平載藥率分別為5.13%、6.72%、6.08%，最終算得的載藥率為（5.98±0.80）%。

2.1.2 異煙肼載藥率 異煙肼PBS溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A= 0.029 2C+0.033，R2=0.997 8，異煙肼在5.0~50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。3次制得的載藥BCP人工骨取樣100 mg，測得樣品中的藥物量分別為15.48、12.69、17.08 mg；計算其異煙肼載藥率分別為15.48%、12.69%、17.08%，最終算得的載藥率為（15.08±2.22）% 。

2.2 吸附利福平和異煙肼的BCP人工骨在體內(nèi)的藥物釋放行為利福平血漿上清液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A= 0.069 4C+0.006 3，R2=0.997 5，利福平在5.0~25.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。異煙肼血漿上清液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A= 0.031 6C+0.026 9 ，R2=0.998 2 ，異煙肼在5.0~50.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。不同時間點利福平和異煙肼在血漿和局部組織中藥物濃度情況見表1。

表1 植入載藥BCP人工骨后在不同時間點的利福平和異煙肼血漿和局部組織藥物濃度（，n=3）

表1 植入載藥BCP人工骨后在不同時間點的利福平和異煙肼血漿和局部組織藥物濃度（，n=3）

注：“—”代表藥物濃度未檢出；Nemenyi法兩兩樣本之間比較，*P <0.05。

時間/d利福平 異煙肼血漿藥物濃度/（μg/mL） 局部組織藥物濃度/（μg/mL） 血漿藥物濃度/（μg/mL） 局部組織藥物濃度/（μg/mL）1 12.22 ± 0.71 91.01 ± 8.99* 16.59 ± 0.38 107.17 ± 6.42*3 14.92 ± 1.41 105.56 ± 5.84* 19.73 ± 1.01 126.86 ± 5.44*7 8.46 ± 0.63 89.50 ± 5.11* 6.10 ± 0.17 62.66 ± 7.07*14 5.61 ± 0.45 47.93 ± 4.51* 5.31 ± 0.11 13.94 ± 1.99*28 5.04 ± 0.70 11.34 ± 1.84* — 5.23 ± 0.91*56 — 6.28 ± 0.59* — —

3 討論

藥物治療在骨關(guān)節(jié)結(jié)核治療中起著關(guān)鍵的作用，目前抗結(jié)核相關(guān)研究主要集中在以異煙肼、利福平為代表的一線抗結(jié)核藥物。異煙肼為類白色的結(jié)晶，易溶于水，對處于快速繁殖期的結(jié)核分枝桿菌有較好的殺滅作用，而對緩慢生長或靜止期結(jié)核分枝桿菌僅能起到一定的抑制作用，對細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外的結(jié)核分枝桿菌都具有殺滅作用，異煙肼的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）為 0.025 ~0.050 μg/mL〔2-3〕，最低殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）為10倍的MIC。利福平為紅色至橙色粉末，易溶于甲醇而在水中幾乎不溶，利福平對靜止期及繁殖期的結(jié)核分枝桿菌均能殺滅，也被用于耐藥性結(jié)核的治療，研究表明〔4-5〕在液體培養(yǎng)基中的MIC為0.006~0.050 μg/mL，其MBC為0.005~0.200 μg/mL。為預(yù)防耐藥結(jié)核的出現(xiàn)，以及增強(qiáng)抗結(jié)核療效，通常選擇聯(lián)合用藥，考慮骨關(guān)節(jié)結(jié)核治療中異煙肼、利福平作為最常用的兩種一線藥物，本實驗選擇擔(dān)載異煙肼、利福平。

載藥人工骨修復(fù)材料直接接觸病變部位，在植入后緩慢降解并釋放藥物而被認(rèn)為是局部治療理想的載體〔6〕。磷酸鈣因其具有整合和保留活性物質(zhì)的能力，而且隨著時間的推移會逐漸降解，從而被新形成的骨所取代，常被用作治療骨疾病的藥物載體，載藥磷酸鈣釋藥可以按照兩種主要機(jī)制進(jìn)行：通過磷酸鈣載體的多孔網(wǎng)絡(luò)擴(kuò)散以及進(jìn)行性的生物降解。載藥支架特性（即微觀結(jié)構(gòu)、孔隙率、比表面積等）以及載藥劑量參與了釋放動力學(xué)和釋放劑量的控制〔7〕。BCP為較常用的磷酸鈣材料，采用羥基磷灰石和β-磷酸三鈣按不同鈣磷比制備而成，BCP人工骨具有較高的孔隙率且溶解度介于羥基磷灰石和β-磷酸三鈣之間，可以吸附藥物且提供骨組織生長架構(gòu)，因此，我們選擇BCP人工骨作為藥物載體。

作為對載藥人工骨緩釋實驗的初步研究，我們選擇較為簡單易行的負(fù)載方法，將利福平及異煙肼溶液直接浸泡然后干燥，使藥物吸附于BCP人工骨內(nèi)，植入體內(nèi)后通過擴(kuò)散的方式及逐漸溶解釋放藥物。我們參考文獻(xiàn)〔8〕，通過紫外-可見分光光度法分別測量并計算BCP人工骨對兩種藥物的載藥率，結(jié)果顯示：異煙肼載藥率大于利福平載藥率，這與我們配制兩種藥物溶液濃度有關(guān)系，實驗結(jié)果表明兩種藥物均能夠擴(kuò)散至周圍組織及血液中，且兩種藥物同一時間局部組織的藥物濃度高于血漿藥物濃度，檢測到的濃度均大于兩種藥物的有效治療濃度。兩種藥物在初期均有突釋現(xiàn)象，且異煙肼較利福平明顯，兩者在釋放初期也表現(xiàn)出差異，無論是在血漿還是局部組織中，我們均能看到利福平較異煙肼有更長的釋放，術(shù)后56 d仍能檢測到局部組織中有利福平，而異煙肼未檢測到，術(shù)后28 d在血漿中檢測到利福平而未檢測出異煙肼，這可能還與我們選擇的檢測方法有關(guān)，文獻(xiàn)〔9〕報道的高效液相色譜法及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等方法可檢測多種藥物且方法簡便、快速，靈敏度和準(zhǔn)確度高，但檢測成本較高，儀器普及率較低，臨床上難以推廣運用。

本實驗結(jié)果中，藥物載藥率及釋放時間較文獻(xiàn)〔10〕報道偏低，因為我們選擇將利福平及異煙肼溶液直接浸泡吸附于BCP人工骨內(nèi)，緩釋具有局限性。將藥物與聚合物微球相結(jié)合可以提高藥物緩釋性能，何胤等〔11〕報道了載異煙肼、利福平、吡嗪酰胺的聚乳酸-羥基乙酸緩釋微球具有平穩(wěn)緩慢釋放的特性，植入體內(nèi)可實現(xiàn)局部給藥和緩釋長程治療的雙重效果，且實現(xiàn)了多藥的負(fù)載。Roth等〔12〕研究證實了與膠原復(fù)合的磷酸鈣顯示出明顯更高的負(fù)載能力和穩(wěn)定釋放能力。目前很多研究利用3D打印技術(shù)可以制備出具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜的載藥人工骨支架，伍衛(wèi)剛等〔13〕利用3D打印技術(shù)制備的利福平-異煙肼-控釋型載藥人工骨可以實現(xiàn)藥物的聯(lián)合治療，利福平及異煙肼兩種藥物可依次序貫釋放，實現(xiàn)了藥物的控釋和緩釋目的。因此本實驗雖然證實了吸附異煙肼和利福平的BCP人工骨具有一定的緩釋性能，但載藥方式有待改進(jìn)，與滿足臨床骨關(guān)節(jié)結(jié)核局部抗結(jié)核治療所需的優(yōu)越性能仍有差距，也是我們?nèi)蘸筮M(jìn)一步優(yōu)化改善的方向。本實驗表明載荷利福平和異煙肼的BCP人工骨植入髂骨骨缺損模型具有抗結(jié)核藥物緩釋效果，術(shù)后持續(xù)一定時間能達(dá)到局部有效抗菌濃度，能作為后續(xù)抗結(jié)核藥物緩釋相關(guān)研究的載體。