果蔗中百菌清殘留特征研究

楊 玲，李復(fù)琴，沈石妍，高欣欣，鄧 軍，張躍彬，刀靜梅

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，云南省甘蔗遺傳改良重點實驗室，云南 開遠661699）

果蔗是一種以莖汁供鮮食的水果甘蔗，果蔗汁口感甜蜜、味道清香、水分充足，含有豐富的碳水化合物。果蔗富含多種對促進人體新陳代謝有益的維生素和有機酸等營養(yǎng)成分，食用后具有提神醒腦、清痰止咳等作用[1]。我國果蔗產(chǎn)地主要分布在廣東、廣西、浙江、福建等?。▍^(qū)）[2]，云南省的元江、紅河、元陽等低海拔河谷地帶均有種植。果蔗成熟時從主產(chǎn)地向全國各地銷售，供果蔗喜好者消費食用，運輸時間加銷售時間一般在5 d以上。

百菌清屬于低毒殺菌劑[3]，是一種取代苯類的廣譜性殺真菌劑[4]。它能和真菌里的三磷酸甘油醛脫氫酶中一種叫半胱氨酸的蛋白質(zhì)相結(jié)合，達到抑制真菌中酶活力的目的，致使真菌細(xì)胞的代謝能力受阻而逐漸喪失生命力[5]。百菌清不具備內(nèi)吸傳導(dǎo)功能，藥物無法從噴藥位置及農(nóng)作物的根系吸收，但噴灑到農(nóng)作物上后，在植物表面有很好的吸附力，耐雨水沖洗，所以能延長藥效的保持時間[6]。百菌清吸進人體有較強的毒性，會刺激呼吸系統(tǒng)，同時有一定的致癌作用[7]，誤入眼睛會產(chǎn)生嚴(yán)重危害，通過皮膚接觸容易導(dǎo)致過敏，對魚類等水生生物毒性極大，進入水域系統(tǒng)將會受到諸多影響，產(chǎn)生惡劣后果。

本研究對市售果蔗噴施不同濃度（100～500倍液）的百菌清可濕性粉劑，以期了解百菌清在堆儲果蔗的果蔗汁中的殘留變化，評估其安全使用量和使用時間。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

試驗用果蔗為云南主栽果蔗品種——黃皮果蔗（粵糖54-474），種植地為云南省玉溪市元江縣。

百菌清標(biāo)準(zhǔn)品（100 μg/mL)，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；乙腈、正己烷，默克股份兩合公司；丙酮（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純），天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，用烘箱140℃烘烤4 h；濾膜（0.2 μm）,有機溶劑膜，津騰實驗設(shè)備有限公司；固相萃取柱，弗羅里矽柱，容積6 mL，填充物1 000 mg。

百菌清為江西某農(nóng)化有限公司生產(chǎn)的可濕性粉劑，有效成分含量75%，包裝袋上推薦使用400～600倍液制劑用藥量。

1.1.2 儀器與設(shè)備

GC-2014氣相色譜儀，有電子捕獲檢測器（ECD），日本島津公司；LCZ-80型甘蔗壓榨機，廣東樂創(chuàng)電器有限公司；XW-80型旋渦混勻器，上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠；FHS-2型高速勻漿機，金壇市盛藍儀器制造有限公司；WD-12型恒溫水浴氮吹儀，杭州奧盛儀器有限公司；PL2002/01型電子天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 果蔗預(yù)處理

試驗用果蔗于2019年10月21日從當(dāng)?shù)剞r(nóng)貿(mào)市場購買，果蔗在試驗前經(jīng)檢測未檢出百菌清。試驗百菌清濃度為5水平，分別稱取10、5、3.3、2.5、2 g 75%百菌清可濕性粉劑于燒杯中，溶于1 000 mL水中，依次配制出100、200、300、400、500倍百菌清溶液。100 kg果蔗噴施1 L百菌清溶液。

噴灑各濃度保鮮劑后的果蔗，待蔗皮上的百菌清溶液干透，分別堆儲到室溫25℃的實驗室內(nèi)，每3 d取樣1次，共取樣13次，整個試驗周期為39 d。39 d后，果蔗外觀干縮，刀口斷面發(fā)紅，蔗汁有酒味，無法入口食用。

1.2.2 樣品制備

樣品制備時，去除果蔗的頭尾兩端，削皮，放入不銹鋼甘蔗壓榨機內(nèi)，榨出果蔗汁，裝入樣品瓶中，于-20℃的冰箱中保存，待測。

1.2.3 樣品提取

以NY/T 761—2008《蔬菜和水果中有機磷、有機氯、擬除蟲菊酯和氨基甲酸酯類農(nóng)藥多殘留的測定》[8]為檢測依據(jù)。稱取25.0 g待測果蔗汁于100 mL錐形瓶內(nèi)，加入50.0 mL乙腈，在勻漿機中高速勻漿2 min后用濾紙過濾，濾液收集到裝有5～7 g氯化鈉的100 mL具塞量筒中，收集濾液40～50 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，然后在室溫下靜置30 min，使乙腈相與水相分層。

1.2.4 凈化

從100 mL具塞量筒中吸取10.00 mL乙腈溶液，放入50 mL燒杯中，將燒杯放在80℃水浴鍋中加熱，杯內(nèi)緩緩?fù)ㄈ氲獨猓舭l(fā)近干，加入2.0 mL正己烷，蓋上鋁箔，待凈化。將弗羅里矽柱依次用5.0 mL丙酮+正己烷（V丙酮∶V正己烷=1∶9，下同）、5.0 mL正己烷預(yù)淋洗，當(dāng)溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用15 mL刻度離心管接收洗脫液，用5 mL丙酮+正己烷沖洗燒杯后淋洗弗羅里矽柱，并重復(fù)一次。將盛有淋洗液的離心管置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃條件下，氮吹蒸發(fā)至小于5 mL，用正己烷定容至5.0 mL，在旋渦混合器上混勻，移入2 mL自動進樣器樣品瓶中，待測。

1.2.5 色譜條件

色譜柱：50%聚苯基甲基硅氧烷（DB-17）柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進樣口溫度：200℃；檢測器溫度：320℃；柱溫：起始溫度150℃，保持2 min，以6℃/min升至270℃，保持8 min；載氣：氮氣，純度≥99.999%，流速為1 mL/min；進樣方式：分流進樣，分流比10∶1。以上述色譜條件，百菌清標(biāo)準(zhǔn)樣品（1 μg/mL）出峰時間為15.225 min（見圖1）。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of standard sample

1.2.6 定性分析

雙柱測得的樣品溶液中未知組分的保留時間（RT）分別與標(biāo)準(zhǔn)溶液在同一色譜柱上的保留時間（RT）相比較，如果樣品溶液中某組分的兩組保留時間與標(biāo)準(zhǔn)溶液中某一農(nóng)藥的兩組保留時間相差均在±0.05 min內(nèi)，即可認(rèn)定為該農(nóng)藥。

1.2.7 定量分析

試樣中被測農(nóng)藥殘留量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)（ω）計，單位以mg/kg表示。

式中：ρ為標(biāo)準(zhǔn)溶液中農(nóng)藥的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，mg/L；A為樣品溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；AS為農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液中被測農(nóng)藥的峰面積；V1為提取溶劑總體積，mL；V2為吸取出用于檢測的提取溶液的體積，mL；V3為樣品溶液定容體積，mL；m為試樣的質(zhì)量，g。

計算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字，當(dāng)結(jié)果大于1 mg/kg時保留3位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 果蔗汁中不同濃度百菌清殘留特征

由圖2可見，在39 d試驗中，噴施百菌清100倍液果蔗的果蔗汁中百菌清含量變化不明顯，保持在0.79～1.24 mg/kg。雖然噴施的百菌清含量（10 g/L）很高，但果蔗汁中檢出的殘留量卻偏低，這與制備樣品時削去果蔗皮后才榨取果蔗汁有關(guān)。百菌清是一種不具備內(nèi)吸傳導(dǎo)作用的殺菌性農(nóng)藥[9]，且在果蔗皮上有很強的附著性[10]。因此，楊玲等[11]研究表明，果蔗中百菌清主要殘留在果蔗皮上，且果蔗皮上的殘留量遠遠高于果蔗汁。試驗于2019年10月21日噴施百菌清100倍液，3 d后榨出的果蔗汁中百菌清含量為0.91 mg/kg，其氣相色譜圖見圖3。

圖2 果蔗汁中不同濃度百菌清含量隨堆儲時間的變化Fig.2 Contents changes of chlorothalonil at different concentrations in fruit sugarcane juice with storage time

圖3 樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample

相比較噴施100倍液的果蔗汁而言，噴施200倍液果蔗汁中的百菌清殘留含量明顯減少，在0.37～0.67 mg/kg，最高值出現(xiàn)在噴施后的21 d，整體降解進程緩慢。

由圖2可以看出，噴施百菌清300倍液的果蔗在堆儲3 d時百菌清殘留量為0.14 mg/kg；之后的21 d呈緩慢上升趨勢，至堆儲27 d時殘留量達到了最高值，為0.30 mg/kg；隨后開始下降，至堆儲39 d時降至0.13 mg/kg。噴施百菌清300倍液的果蔗在堆儲過程中果蔗中百菌清殘留量顯著低于噴施100、200倍液組（P＜0.05）。

噴施百菌清400倍液的果蔗汁中的百菌清殘留量略低于噴施300倍液的果蔗汁。其最高含量出現(xiàn)在堆儲的第24天，為0.21 mg/kg；而最低值出現(xiàn)在堆儲3 d和39 d時，也是本次試驗的第1次和最后1次取樣，含量均為0.10 mg/kg。

噴施百菌清500倍液3 d和6 d時，果蔗汁中百菌清殘留量均為0.10 mg/kg，之后一直以0.11 mg/kg保持至第24天，堆儲27 d時果蔗汁中百菌清殘留量最高，為0.18 mg/kg，之后開始緩慢下降，至堆儲第39天降至0.07 mg/kg。

2.2 檢測方法的準(zhǔn)確度和精密度

目前，測定百菌清的常用方法有氣相色譜法和液相色譜法[12]。因液相色譜法具有設(shè)備價格昂貴，成本偏高，精確度低等缺點，沒有得到廣泛應(yīng)用[13]。所以本文采用氣相色譜法，以NY/T 761—2008[8]為依據(jù)。果蔗汁前處理加乙腈溶劑高速勻漿提取[14]，利用水浴氮吹儀進行濃縮，經(jīng)弗羅里矽柱過柱凈化后，采用氣相色譜儀檢測。加標(biāo)回收率試驗的結(jié)果和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）值見表1。

表1 加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 1 Labeled recovery test results

稱取25.0 g果蔗汁于100 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入0.04、0.24、0.64、1.24 μg/mL百菌清標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過提取、凈化，上氣相色譜儀重復(fù)測定3次，加標(biāo)色譜圖見圖4。結(jié)果顯示：加標(biāo)平均回收率為100%～103%，RSD值為0.24%～1.71%。從加標(biāo)回收率和RSD值可以看出，該檢測方法前處理操作簡單、容易掌握，使用氣相色譜法檢測具有靈敏度高、處理數(shù)據(jù)便捷等明顯優(yōu)勢，完全能適用于本試驗中果蔗汁百菌清殘留量的測定。

圖4 加標(biāo)回收色譜圖Fig.4 Labeled recovery chromatogram

3 結(jié)論與討論

在噴施百菌清100、200、300、400、500倍液的果蔗的果蔗汁中，施用100、200倍液的果蔗汁中百菌清殘留量明顯較高，殘留量為0.37～1.24 mg/kg，噴施300、400、500倍液的果蔗汁中，百菌清殘留量最高值為0.30 mg/kg，最低值僅為0.07 mg/kg，且這3個稀釋濃度處理果蔗汁中百菌清殘留量都很接近。各濃度百菌清在果蔗中的降解速度都很緩慢，試驗前期都是由低到高慢慢積累，逐步上升，中后期才達到高峰值，30 d后開始呈下降趨勢。這與陳莉等[15]研究的在大田露天條件下噴施百菌清后呈階梯式下降的降解趨勢有所不同。這可能與果蔗噴施百菌清后存放在密閉的室內(nèi)，沒有日曬和對流的風(fēng)，未經(jīng)雨水、露水的沖刷有關(guān)。

果蔗汁中百菌清最高殘留值出現(xiàn)在噴施百菌清100倍液后的第18天，其殘留量為1.24 mg/kg，而在GB 2763—2019[16]中，沒有明確規(guī)定果蔗的最大殘留限量，本文以西瓜為參考，其百菌清的最大殘留為5 mg/kg。本試驗中果蔗是削去外皮后才榨取汁液檢測，大多數(shù)百菌清殘留物是附著在果蔗皮上，只有少量百菌清沿著砍收時的頭尾兩端傷口緩緩進入果蔗中，造成少量的殘留。這與王吉騰等[17]在測定梨中百菌清殘留結(jié)果一致，即百菌清在梨的果皮上被測出，而梨果肉中未被測出，百菌清主要吸附在梨皮表面，且沒有任何內(nèi)吸傳導(dǎo)功能。王靜等[18]也認(rèn)為種植在大棚內(nèi)的黃瓜，百菌清主要殘留在黃瓜皮上，百菌清含量高的黃瓜經(jīng)過削皮后檢測發(fā)現(xiàn)百菌清含量明顯降低。因此，建議鮮食果蔗時，用刀削去外皮后再吃，盡量避免用嘴直接去皮食用。